PRAVILNIK O KVALITETU MEDA I DRUGIH PČELINJIH PROIZVODA I METODAMA ZA KONTROLU KVALITETA MEDA I DRUGIH PČELINJIH PROIZVODA ("Sl. list SFRJ", br. 4/85 i 7/92 i "Sl. list SCG", br. 45/2003 - dr. pravilnik)

I OPŠTE ODREDBE

Član 1

Ovim pravilnikom propisuju se metode za kontrolu kvaliteta proizvoda, i to: metode uzimanja uzoraka i metode fizičkih i hemijskih analiza za proizvode.

Fizičke i hemijske analize za proizvode vrše se po metodama koje su odštampane uz ovaj pravilnik i čine njegov sastavni deo.

Čl. 2-41

(Prestali da važe)

V METODE ZA KONTROLU KVALITETA MEDA I DRUGIH PČELINJIH PROIZVODA

Član 42

Metode kojima se vrši kontrola kvaliteta meda i drugih pčelinjih proizvoda jesu:

1) metode uzimanja uzoraka;

2) metode fizičkih i hemijskih analiza.

Metode iz stava 1 ovog člana odštampane su uz ovaj pravilnik i čine njegov sastavni deo.

Član 43

Metodama uzimanja uzoraka meda i drugih pčelinjih proizvoda utvrđuju se postupci i načini uzimanja uzoraka na kojima se vrši kontrola kvaliteta tih proizvoda.

Član 44

Metodama fizičkih i hemijskih analiza meda i drugih pčelinjih proizvoda utvrđuju se uslovi i postupci za vršenje fizičkih i hemijskih ispitivanja proizvoda radi proveravanja kvaliteta.

Član 45

Svi reagensi koji se upotrebljavaju za hemijske analize proizvoda na koje se odnose odredbe ovog pravilnika moraju biti propisane analitičke čistoće, a voda mora biti destilovana.

Član 46

Preciznost određivanja fizičkih i hemijskih metoda analiza, shodno ovom pravilniku, utvrđuje se prema principima analitičke prakse, a izražava se kao relativno odstupanje od proseka dobijenog iz najmanje dva paralelna određivanja. Dozvoljena razlika rezultata dva pojedinačna određivanja, koja je izvršio uporedno ili ubrzo jedno za drugim, na istom uzorku za ispitivanje, istom metodom, u istim uslovima isti analitičar i u istoj laboratoriji, mora biti u granicama propisane metode, ako je to utvrđeno ovim pravilnikom.

1. Metode uzimanja uzoraka

Član 47

Uzorci meda i drugih pčelinjih proizvoda uzimaju se:

1) u uslovima proizvodnje - na proizvodnim partijama;

2) u uslovima prometa - na ambalažnim jedinicama pošiljke.

Član 48

Uzorke proizvoda, shodno ovom pravilniku, mora uzimati stručno lice.

Član 49

Uzeti uzorak za ispitivanje mora predstavljati prosečan sastav celokupne količine proizvoda od koga se uzorak uzima.

Član 50

Pod proizvodnom partijom, u smislu ovog pravilnika, podrazumeva se odgovarajuća količina proizvoda iste vrste, proizvedena istog dana, odgovarajuće zapremine, sa obaveznom oznakom za identifikaciju.

Pod ambalažnim jedinicama meda i drugih pčelinjih proizvoda podrazumevaju se utvrđene količine proizvoda iste vrste, upakovane u pojedinačna pakovanja odgovarajuće mase, sa obaveznom oznakom za identifikaciju. Ambalažne jedinice mogu biti upakovane u zbirna transportna pakovanja, na koja se primenjuju odredbe ovog pravilnika.

Pod "pošiljkom" se podrazumeva istovremeno isporučena količina iste vrste proizvoda u pojedinačnim i zbirnim pakovanjima koja se stavljaju u promet.

Član 51

Uzorak za ispitivanje proizvoda čine najmanje tri identične ambalažne jedinice od ukupno uzetog uzorka, s tim da te jedinice moraju biti identičnog sastava i jednake zapremine.

Član 52

O uzimanju uzoraka proizvoda zapisnik obavezno sačinjava lice koje uzima uzorak za ispitivanje u koji unosi podatke značajne za rezultat ispitivanja: mesto, datum i vreme uzimanja uzoraka, svrhu uzimanja uzoraka, vrstu i količinu proizvoda od koga se uzima uzorak, broj pojedinačno uzetih uzoraka i količinu ukupno uzetog uzorka, oznake za identifikaciju uzorka i količinu uzorka koja se dostavlja za ispitivanje.

Zapisnik potpisuju stručno lice koje uzima uzorak, kao i predstavnik organizacije udruženog rada.

Član 53

Uzorak se pakuje u staklene ili plastične sudove koji se zatvaraju čistim i suvim zatvaračima i označavaju tako da se oznaka ne može lako skinuti ili izbrisati, a zatim se utiskuje službeni pečat ili stavlja plomba.

Uzeti uzorci čuvaju se pod uslovima propisanim ovim pravilnikom za odgovarajuće proizvode.

Ako su proizvodi upakovani u originalne ambalažne jedinice manjih zapremina ili masa, uzeti uzorak može biti svaka nasumice uzeta pojedinačna jedinica.

Član 54

Broj jedinica uzetog uzorka za ispitivanje zavisi od vrste proizvoda i veličine proizvodne partije, odnosno pošiljke.

Broj jedinica uzetog uzorka utvrđuje se na osnovu sledeće tabele:

Uzimanje uzoraka meda i drugih pčelinjih proizvoda

Vrste pakovanja	Količina od koje se uzima uzorak				Broj ambalažnih jedinica koje se uzimaju kao uzorak	Masa ukupno uzetog uzorka (u gramima)
Kante ili		1		jedinica	1	500
burad		2 do	5	"	2	500
	preko	5 do	60	"	3	1000
	preko	60 do	80	"	4	1000
	preko	80 do	100	"	5	1000
Za svaku dalju stotinu ili započetu stotinu kanti, odnosno buradi broj kanti, odnosno buradi za uzimanje uzoraka povećava se za 1.
Tegle		1 do	100	jedinica	1	500
(do 1 kg)	preko	100 do	500	"	2	500
	preko	500 do	1000	"	3	500
	preko	1000 do	10000	"	4	500
Ako je isporuka veća od 10000 tegli, na svakih daljih 2500 tegli uzima se još po jedan uzorak.
Ostale vrste pakovanja (do 0,250 kg)		do	5000	jedinica	1	-
		za svakih daljih 2000 jedinica			1	-

Član 55

Ako ukupno uzeti uzorak meda iznosi više od tri ambalažne jedinice, obrazuje se posebno uzorak, s tim da svaka ambalažna jedinica uzetog uzorka ima istu mogućnost da bude izdvojena kao ambalažna jedinica uzorka uzetog za ispitivanje.

Član 56

Za uzimanje uzoraka meda koristi se metalna sonda sa odeljcima (slika 1). Metalna sonda sastoji se od dve koncentrične cevi koje ulaze jedna u drugu. Donji deo sonde je zašiljen. Unutrašnja cev sonde ima ručicu čijim se okretanjem za 90oC sonda može zatvoriti.

Uzorak meda uzima se tako što se zatvorena, čista i osušena sonda potopi u med do kraja zajedničkog otvora. U medu se sonda otvori pa zatvori i sa uzetim uzorkom izvuče iz proizvoda.

2. Metode fizičkih i hemijskih analiza

Član 57

Metode fizičkih i hemijskih analiza kojima se vrši kontrola kvaliteta meda i drugih pčelinjih proizvoda jesu:

1) metoda pripremanja uzoraka za analizu;

2) određivanje redukovanih šećera;

3) određivanje saharoze;

4) određivanje vode u medu;

5) određivanje materija nerastvorljivih u vodi (gravimetrijska metoda);

6) određivanje pepela;

7) određivanje kiselosti;

8) određivanje aktivnosti dijastaze;

9) određivanje hidroksimetilfurfurola (fotometrijska metoda po Winkleru);

10) polenova analiza za med;

11) određivanje vode u matičnom mleču i polenu;

12) određivanje proteina u matičnom mleču;

13) određivanje ekstrakta propolisa u alkoholnom rastvoru.

Čl. 58 i 59

(Prestali da važe)

 

METODE FIZIČKIH I HEMIJSKIH ANALIZA KOJIMA
SE VRŠI KONTROLA KVALITETA MEDA I DRUGIH PČELINJIH PROIZVODA

1. Metoda pripremanja uzorka za analizu

Zavisno od konzistencije meda, uzorci za analizu pripremaju se na različite načine.

Ako je med u tečnom stanju, pre početka analize lagano se izmeša štapićem ili mućkanjem.

Ako je med granuliran, zatvorena posuda sa uzorkom stavi se u vodeno kupatilo i zagreva 30 minuta na temperaturi 60oC, a po potrebi - i na 65oC. U toku zagrevanja može se promešati štapićem ili kružno promućkati, a zatim brzo prohladiti.

Ako se određuje dijastaza ili hidroksimetilfurforol, med se ne zagreva.

Ako med sadrži strane materije, kao što je vosak, delovi pčela ili delovi saća, uzorak se zagreva na temperaturi 40oC u vodenom kupatilu, a zatim procedi kroz tkaninu koja se stavlja na lepak zagrevan toplom vodom.

Ako je med u saću, saće se otvori, procedi kroz žičano sito sa kvadratnim otvorom dimenzije 0,5 x 0,5 mm. Ako deo saća i voska prođe kroz sito, uzorak se zagreje u vodenom kupatilu na temperaturi 60oC, a, po potrebi, zagreva se 30 minuta i na 65oC. U toku zagrevanja promeša se štapićem ili promućka kružnim pokretima, a zatim brzo prohladi.

Ako je med u saću granuliran, zagreva se da bi se otopio vosak, promeša se i ohladi. Posle hlađenja, vosak se odstrani.

2. Određivanje redukovanih šećera

Princip

Princip ove metode zasniva se na redukciji Felingovog rastvora titracijom rastvorom redukovanih šećera meda uz korišćenje metilen-plavog kao indikatora.

Reagensi

1) Felingov rastvor

Rastvor A: rastvori se 69,28 g bakar-sulfata (CuSO4 · 5H2O) i do jednog litra dopuni destilovanom vodom. Rastvor se priprema dan ranije pre postupka titracije.

Rastvor B: rastvori se 346 g natrijum-kalijum-tartarata (C4H4KNaO6 · 4H2O) i 100 g natrijum-hidroksida (NaOH) u jednom litru destilovane vode. Rastvor se zatim filtrira.

2) Standardni rastvor invertnog šećera (10 g/l vode): odmeri se 9,5 g čiste saharoze, doda 5 ml rastvora hlorovodonične kiseline (oko 36,5%) i dopuni destilovanom vodom do 100 ml. Rastvor se može čuvati nekoliko dana, zavisno od temperature: na temperaturi 12o do 15oC do sedam dana, na temperaturi 20o do 25oC do tri dana. Pripremljeni rastvor dopuni se vodom do jednog litra. Neposredno pre upotrebe, odgovarajuća zapremina rastvora neutrališe se sa 1 mol/1 rastvorom NaOH, i zatim se razblaži do zahtevane potrebne koncentracije (2 g/l) - standardni rastvor.

Napomena: 1%-ni zakiseljen rastvor invertnog šećera stabilan je nekoliko meseci.

3) Rastvor metilen-plavog: rastvori se 2 g metilen-plavog u destilovanoj vodi, a zatim do jednog litra razblaži vodom.

4) Stipsa

Rastvor stipse: pripremi se hladno zasićen rastvor (K2SO4Al2(SO4)3 · 24H2O) u vodi. Zatim se, uz konstantno mešanje štapićem, doda amonijum-hidroksid dok rastvor postane alkalan, što se utvrđuje lakmusom. Rastvor se ostavi da slegne i ispira vodom uz dekantovanje sve dok voda daje blag pozitivan test na sulfate, što se utvrđuje rastvorom barijum-hlorida. Višak vode se odlije, a preostala pasta ostavlja u boci sa šlifovanim zatvaračem.

Pripremanje uzorka

I Postupak - Primenljivo za med koji može da sadrži talog

a) Odmeri se 25 g (W1) homogenizovanog meda i prenese u odmernu tikvicu zapremine 100 ml, doda 5 ml stipse, dopuni se vodom do oznake pri temperaturi od 20oC, i filtrira.

b) U odmernu tikvicu zapremine 500 ml pipetira se 10 ml uzorka pod "a" i razblaži destilovanom vodom do oznake (razblaženi rastvor meda).

II Postupak

a) Odmeri se 2 g homogenizovanog meda (W2), prenese u odmernu tikvicu zapremine 200 ml, rastvori u vodi i dopuni vodom do oznake (rastvor meda).

b) Odmeri se 50 ml rastvora meda pod "a" i dopuni destilovanom vodom do 100 ml (razblaženi rastvor meda).

Standardizacija Felingovog rastvora

Felingov rastvor standardizuje se tako što se otpipetira 5 ml Felingovog rastvora A i pomeša sa 5 ml rastvora B (Felingov rastvor). Taj rastvor mora ukupno reagovati sa 0,050 g invertnog šećera dodatog u količini od 25 ml kao standardni rastvor invertnog šećera (2 g/l).

Prethodna titracija

Ukupna zapremina materija koje reaguju na kraju redukcione titracije mora iznositi 35 ml, što se postiže dodavanjem određene količine vode pre početka titracije. S obzirom na to da se ovim pravilnikom za med propisuje više od 60% redukovanih šećera (računato kao invertni šećer), potrebno je prethodno obaviti titraciju da bi se utvrdila tačna zapremina vode koja se dodaje, kako bi se u postupku analize obezbedila redukcija pri konstantnoj zapremini. Zapremina potrebne količine vode dobija se oduzimanjem utrošene zapremine razblaženog rastvora meda u prethodnoj titraciji ("X ml") od 25 ml (25 ml - "X").

Pipetom se odmeri 5 ml Felingovog rastvora A i prenese u konusnu erlenmajer tikvicu, zapremine 250 ml, doda se 5 ml Felingovog rastvora B, 7 ml destilovane vode, malo plovućca ili drugog sličnog sredstva i 15 ml razblaženog rastvora meda iz birete. Medna mešavina zagreva se do ključanja i dve minute održava umanjeno ključanje. Zatim se, za vreme ključanja rastvora, doda 1 ml 0,2%-nog rastvora metilen-plavog i titracija završi za ukupno tri minute, uz ponovljeno dodavanje razblaženog rastvora meda, sve dok iščezne boja indikatora. Utrošena zapremina razblaženog rastvora meda koji je kompletno redukovan obeležava se sa "X ml".

Određivanje

Pipetom se odmeri 5 ml Felingovog rastvora A i prenese u konusnu erlenmajer-tikvicu zapremine 250 ml i doda 5 ml Felingovog rastvora B. Zatim se doda (25 ml - "X ml") destilovane vode, malo kamena polovušca ili drugog odgovarajućeg sredstva i iz birete doda razblaženi rastvor meda, tako da za kompletnu titraciju ostane oko 1,5 ml (X ml - 1,5ml). Zatim se hladna mešavina zagreva do ključanja i dve minute održava umereno ključanje. U toku ključanja doda se 1,0 ml 0,2%-nog rastvora metilen-plavog, pa se titracija, dodavanjem razblaženog rastvora meda do obezbojenja indikatora, mora završiti za tri minute ukupnog ključanja. Utrošena količina razblaženog rastvora meda obeležava se sa "Y ml".

Izračunavanje

Invertni šećer izražava se u g/100 g (%) i izračunava se zavisno od načina pripremanja uzoraka (I ili II postupak).

Ako se primeni postupak I, izračunavanje se vrši po sledećoj formuli:

	25		1000
procent invertnog šećera     C=	---------	x	-----------
	W1		Y1

gde je:

C - invertni šećer, u g;

W1 - masa uzetog uzorka, u g;

Y1 - zapremina razblaženog rastvora meda utrošenog za     određivanje, u ml.

Ako se primeni postupak II, izračunavanje se vrši po sledećoj formuli:

	2		1000
procent invertnog šećera     C=	---------	x	-----------
	W2		Y2

gde je:

C - invertni šećer, u g;

W2 - masa uzetog uzorka, u g;

Y2 - zapremina razblaženog rastvora meda utrošenog za određivanje, u ml.

Napomena:	Za preciznost i ponovljivost rezultata neophodno je da se za svaku probu odredi potrebna zapremina dodate vode da bi ukupna zapremina iznosila 35 ml. U sledećoj tabeli date su približne vrednosti pod pretpostavkom da je početna masa uzorka iznosila 25 g, odnosno 2 g.
	Sadržaj invertnog šećera, u procentima	Potrebna količina vode, u ml
	60	8,3
	65	9,6
	70	10,7
	75	11,6

Ponovljivost:

Razlika između titracija dva određivanja izvršena uporedo ili ubrzo jedno za drugim ne iznosi više od 0,1 ml.

3. Određivanje saharoze

Princip

Princip ove metode zasniva se na hidrolizi saharoze, redukciji Felingovog rastvora titracijom sa redukovanim šećerima iz hidrolizata meda uz metilen-plavo.

Reagensi

1) Felingov rastvor (A i B), utvrđen metodom određivanja redukovanih šećera

2) Standardni rastvor invertnog šećera, utvrđen metodom određivanja redukovanih šećera

3) Hlorovodonična kiselina c(HCl) = 6,34 mol/l

4) Rastvor natrijum-hidroksida c(NaOH) = 5 mol/l

5) 2%-tni rastvor metilen-plavog (2 g/1)

Pripremanje uzorka

I Postupak

Odmeri se 25 g (W1) homogenizovanog meda i prenese u odmernu tikvicu zapremine 100 ml, doda se 5 ml stipse, dopuni se vodom do oznake, pri temperaturi od 20oC, i filtrira.

Odmeri se 10 ml tog rastvora i dopuni destilovanom vodom do 250 ml rastvora meda (za određivanje saharoze).

II Postupak

Odmeri se 2 g (W2) homogenizovanog meda i prenese u odmernu tikvicu, rastvori u destilovanoj vodi i dopuni u tikvici do 200 ml (rastvor meda).

Hidroliza uzorka

Rastvor meda (50 ml) prenese se u odmernu tikvicu zapremine 100 ml i doda 25 ml destilovane vode. Termometar se zaroni u pripremljeni uzorak i zagreva se do 65oC u ključalom vodenom kupatilu. Tikvica se zatim iznese iz vodenog kupatila i doda 10 ml hlorovodonične kiseline (c HCl = 6 mol/1). Rastvor se ostavi da se hladi 15 minuta, zatim se temperatura podesi na 20oC i neutrališe 5 mol rastvorom NaOH/l, uz korišćenje lakmus-papira kao indikatora, ponovo ohladi (20oC) i dopuni do 100 ml (razblaženi rastvor meda).

Određivanje

Određivanje je istovetno kao i određivanje redukovanih šećera, a odnosi se na prethodnu titraciju i postupak određivanja količine invertnog šećera pre inverzije.

Izračunavanje

Najpre se obračunava procent invertnog šećera posle inverzije, s tim što se pri tom koristi formula predviđena za određivanje procenta invertnog šećera pre inverzije.

Saharoza se izražava u g/100 g meda i izračunava se po sledećoj formuli:

Masa saharoze, g/100 g =

količina invertnog šećera posle inverzije - količina invertnog šećera pre inverzije x 0,95

4. Određivanje vode u medu

Princip

Princip ove metode zasniva se na refraktometrijskom određivanju.

Aparatura i pribor

Pored uobičajene laboratorijske opreme, potreban je i refraktometar.

Pripremanje uzorka

Uzorak se priprema na način predviđen za metodu pripremanja uzorka za analizu, a zatim se indeks refrakcije uzorka odredi refraktometrom, pri konstantnoj temperaturi od 20oC. Na osnovu indeksa refrakcije, izračunava se količina vode (% m/m), pri čemu se koristi priložena tablica. Ako određivanje indeksa nije vršeno na temperaturi od 20oC, uzima se u obzir korekcija temperature i rezultati se svode na temperaturu od 20oC.

Tabela za proračunavanje sadržaja vode u medu

Indeks refrakcije (20oC)	Sadržaj vode (%)	Indeks refrekcije (20oC)	Sadržaj vode (%)	Indeks refrekcije (20oC)	Sadržaj vode (%)
1.5044	13.0	1.4935	17.2	1.4830	21.4
1.5038	13.2	1.4930	17.4	1.4825	21.6
1.5033	13.4	1.4925	17.6	1.4820	21.8
1.5028	13.6	1.4920	17.8	1.4815	22.0
1.5023	13.8	1.4915	18.0	1.4810	22.2
1.5018	14.0	1.4910	18.2	1.4805	22.4
1.5012	14.2	1.4905	18.4	1.4800	22.6
1.5007	14.4	1.4900	18.6	1.4795	22.8
1.5002	14.6	1.4895	18.8	1.4790	23.0
1.4997	14.8	1.4890	19.0	1.4785	23.2
1.4992	15.0	1.4885	19.2	1.4780	23.4
1.4987	15.2	1.4880	19.4	1.4775	23.6
1.4982	15.4	1.4875	19.6	1.4770	23.8
1.4976	15.6	1.4870	19.8	1.4765	24.0
1.4971	15.8	1.4865	20.0	1.4760	24.2
1.4966	16.0	1.4860	20.2	1.4755	24.4
1.4961	16.2	1.4855	20.4	1.4750	24.6
1.4956	16.4	1.4850	20.6	1.4745	24.8
1.4951	16.6	1.4845	20.8	1.4740	25.0
1.4946	16.8	1.4840	21.0
1.4940	17.0	1.4835	21.2

Napomena: Korekcija temperature - indeks refrakcije:

- temperatura preko 20oC - dodati 0,00023 za svaki oC;

- temperatura do 20oC - oduzeti 0,00023 za svaki oC.

5. Određivanje nerastvorljivih materija u vodi (gravimetrijska metoda)

Pripremanje uzorka

Odmeri se 20 g uzorka sa tačnošću ±10 mg, rastvori se u određenoj količini destilovane vode na temperaturi od 80oC i dobro izmeša.

Određivanje

Pripremljeni uzorak se najpre filtrira kroz osušen i odmeren sinterovani levak, veličine pora 15 do 40 mm. Talog se ispere vrelom vodom (80oC), pri čemu se oslobodi šećer, što se utvrđuje testom po Mohru. Levak se osuši za jedan čas na temperaturi od 135oC, ohladi i meri sa tačnošću od 0,1 mg.

Izračunavanje

Količina materija nerastvorljivih u vodi izražava se u procentima (m/m) i izračunava po sledećoj formuli:

	100 x količina ostatka
procent materija nerastvorljivih u vodi	= --------------------------------------------
	odmereni uzorak

6. Određivanje pepela

Princip

Princip ove metode zasniva se na postupku sagorevanja uzorka na 600oC do konstantne mase.

Aparatura i pribor

Pored uobičajene laboratorijske opreme, koristi se i:

1) platinska posuda ili posuda od silicijuma;

2) vodeno kupatilo;

3) peščano kupatilo;

4) peć za žarenje.

Određivanje

U ižarenu odmernu platinsku posudu odmeri se 5 do 10 g uzorka i zagreva na vodenom kupatilu dok veći deo vode ispari. Posle toga uzorak se stavi na peščano kupatilo, do ugljenisanja. Ostatak se zatim žari u peći za žarenje, na temperaturi 600oC, do konstantne mase. Pre merenja, uzorak se ohladi.

Izračunavanje

Masa pepela se izražava u g/100 g proizvoda i izračunava po sledećoj formuli:

	ostatak x 100
masa pepela g/100 g	= --------------------------------------------
	odmereni uzorak

7. Određivanje kiselosti

Princip

Pripremljeni uzorak titrira se u prisustvu fenolftaleina rastvorom 0,1 mol/l natrijum-hidroksida do pojave svetloružičaste boje.

Aparatura i pribor

Pri određivanju stepena kiselosti koristi se uobičajena laboratorijska oprema.

Reagensi

1) Rastvor natrijum-hidroksida, c(NaOH) = 0,1 mol/l (bez karbonata)

2) 1%-ni rastvor fenolftaleina (m/V) u etalonu, neutralisan

3) destilovana voda bez CO2, dobijena kuvanjem a zatim ohlađena.

Određivanje

Odmeri se 10 g uzorka i rastvori u 75 ml destilovane vode.

Pripremljeni uzorak titrira se sa 0,1 mol rastvorom (NaOH)/l, uz četiri do pet kapi fenolftaleina kao indikatora. Na kraju titracije boja se mora održati 10 sekundi.

Za uzorke tamne boje odmerava se manja količina uzorka.

Alternativno se može koristiti pH-metar i titrirati uzorak do pH-8,3.

Izračunavanje

Kiselost se izražava u milimolima kiseline/kg i izračunava se po formuli:

kiselost = 10 x V

gde je:

V - broj utrošenih ml 0,1 mol (NaOH)/1 za neutralizaciju 10 g meda.

8. Određivanje aktivnosti dijastaze

Princip

Princip ove metode zasniva se na hidrolizi 1%-nog rastvora skroba enzimom iz 1 g meda u toku jednog časa na temperaturi od 40oC.

Aparatura i pribor

Pored uobičajene laboratorijske opreme, koriste se i:

1) odmerne tikvice zapremine jedan litar; 0,5 litra; 0,1 litra;

2) konusna tikvica zapremine 0,250 litra;

3) plamenik;

4) vodeno kupatilo na 40  ± 0,2oC;

5) spektrofotometar sa očitavanjem na 660 nm.

Reagensi

1) Matični rastvori joda: rastvori sa 8,3 g joda p.a. pomeša se sa 22 g kalijum-jodida i rastvori u 30-40 ml vode, a zatim razblaži do jednog litra.

	J2
2) Rastvor joda c(	-------	0,0007 mol/l): u odmernoj tikvici
	2

zapremine 500 ml rastvori se 20 g K-jodida p.a u 30-40 ml vode. Zatim se doda 5 ml matičnog rastvora joda i dopuni vodom do oznake.

Rastvor se mora pripremati svaki drugi dan.

3) Acetatni pufer - pH 5,3: rastvori se 87 g natrijum-acetata (CH3COONa · 3H2O) u 400 ml vode, doda oko 10,5 ml ledene sirćetne kiseline i dopuni vodom do 500 ml. Ako je to potrebno, pH-vrednost se dotera natrijum-acetatom ili sirćetnom kiselinom do 5,3, uz korišćenje pH-metra, po potrebi.

4) Rastvor natrijum-hlorida, c(NaCl) = 0,5 mol/l: rastvori se 14,5 g natrijum-hlorida u prokuvanoj destilovanoj vodi i dopuni do 50 ml. Rok trajanja tog rastvora je ograničen.

5) Pripremanje topivog skroba: u konusnu tikvicu s povratnim hladnjakom, koja je uronjena u vodeno kupatilo, odmeri se 20 g skroba, doda se mešavina 100 ml 95%-nog etanola i 7 ml 1 mol/l hlorovodonične kiseline i ostavi da ključa jedan čas. Rastvor se ohladi, filtrira, kroz filtar (veličine pora 90 do 150 mm) i ispira vodom sve dok voda za ispiranje prestane da pokazuje reakciju na hloride.

Skrob se potpuno osuši na vazduhu čija je temperatura 35oC. Rastvor skroba mora se čuvati u dobro zatvorenoj tikvici.

6) Određivanje vode u topivom skrobu

Odmeri se oko 2 g topivog skroba i u tankom sloju rasporedi na dno posudice prečnika 5 cm. Suši se 1,5 čas na temperaturi od 180oC. Zatim se ohladi u oksikatoru i premeri.

Gubitak mase u odnosu na 100 g jeste količina vode. Količina vode pripremljenog skroba mora iznositi 7 do 8% (m/m), zavisno od vlažnosti vazduha na kome je uzorak osušen.

7) Rastvor skroba

Koristi se skrob čija je plava vrednost između 0,5 do 0,55 određena prema niže opisanom postupku i očitana u kiveti od 1 cm.

Odmeri se količina skroba koja odgovara masi od 2,0 g bezvodnog skroba i izmeša sa 90 ml vode u konusnoj tikvici zapremine 250 ml. Odmah se prenese do plamenika preko koga je postavljena azbestna mrežica i ostavi da blago ključa tri minute. Potom se rastvor skloni sa plamenika, pokrije i ostavi da se postepeno ohladi do sobne temperature. Rastvor se zatim prenese u odmernu bocu od 100 ml i stavi na vodeno kupatilo zagrejano na 40oC. Kad rastvor dostigne tu temperaturu, dopuni se vodom do oznake.

Utvrđivanje plave vrednosti skroba

Količina skroba koja odgovara masi od 1 g bezvodnog skroba rastvori se po gore opisanom postupku, ohladi se i doda 2,5 ml acetatnog pufera i dopuni vodom u odmernoj tikvici do 100 ml. U odmernu tikvicu zapremine 100 ml doda se 75 ml vode, 1ml

	J
1 mol/l (HCl) i 1,5 ml rastvora 0,02 mol/l	(-------)	.
	2

Rastvor se ostavi jedan čas na tamnom mestu i očita apsorbancija na spektrofotometru pri 660 nm, u kiveti od 1 cm, prema slepoj probi koja sadrži sve sastojke osim rastvora skroba.

Očitana apsorbancija = plava vrednost.

Određivanje

Pripremanje uzorka za određivanje

Uzorak za analizu ne sme se zagrevati. Odmeri se 10 g uzorka i prenese u čašu zapremine 50 ml, doda 5 ml acetatnog pufera i 20 ml vode da bi se uzorak rastvorio, i promeša štapićem. Uzorak se već na hladno potpuno rastvori. Zatim se u odmernu tikvicu zapremine 50 ml, doda 3 ml rastvora natrijum-hlorida i otopljen rastvor meda i dopuni vodom do oznake.

Uzorak mora biti puferizovan pre mešanja sa natrijum-hloridom.

Pripremanje standardnog rastvora

Rastvor skroba zagreva se na temperaturi 40oC, a zatim se 5 ml rastvora otpipetira u 10 ml vode, čija je temperatura 40oC, i dobro izmeša. Od pripremljenog rastvora otpipetira se 1 ml i doda u 10 ml

	J2
0,0007 mol/l	(---------)	rastvora joda, razblaži sa 35 ml vode i dobro izmeša.
	2

Nastala boja očitava se na 660 nm prema slepoj probi.

Vrednost apsorbancije treba da bude 0,760 ± 0,020. Ako je potrebno, može se dodati određena zapremina vode, tako da se dobije ispravna apsorbancija.

Određivanje apsorbancije

Pipetom se odmeri 10 ml rastvora meda i prenese u graduisani cilindar od 50 ml i stavi u vodeno kupatilo na temperaturi od 40oC ± 0,2oC, zajedno sa posudom u kojoj je rastvor skroba. Posle 15 minuta, pipetom se odmeri 5 ml rastvora skroba i doda u rastvor meda, promeša i uključi sat. U intervalima od po pet minuta izdvoji se 1 ml alikvota

	J2
i doda u 10 ml 0,0007 mol/l	(---------)	rastvora joda.
	2

Promeša se i razblaži do zapremine 35 ml (pripremanje uzorka za određivanje). Apsorbancija se odmah određuje na 660 nm, nastavi se da se uzima alikvot sve dok se apsorbancija ne smanji do vrednosti od 0,235.

Izračunavanje i izražavanje rezultata

U grafikon se unosi vrednost apsorbancije kao funkcije vremena (min).

Kroz najmanje tri poslednje tačke povuče se prava linija da bi se odredilo vreme kad reakciona smeša dostiže vrednost apsorbancije od 0,235. Podeli se 300 sa vremenom izraženim u minutama da bi se dobio broj dijastaze (DN). Taj broj izražava aktivnost dijastaze kao ml 1%-nog rastvora skroba koji je hidrolizovan enzimom u 1 g meda za vreme od jednog časa pri 40oC. Broj dijastaze odgovara broju na Gothe-skali.

Aktivnost dijastaze DN = ml 1%-nog rastvora skroba po g meda/h pri temperaturi od 40oC.

	60		0,10		1,0		300
Napomena: broj dijastaze =	------	•	--------	•	-------	=	-------,
	t		0,01		2		t

gde je t redukcija u min.

9. Određivanje hidroksimetilfurfurola (fotometrijska metoda po Winkleru)

Princip

Princip ove metode zasniva se na reakciji hidroksimetilfurfurola sa barbiturnom kiselinom i p-toluidinom, pri čemu nastaje ružičasto obojenje koje se mora meriti na talasnoj dužini od 550 nm.

Aparatura i pribor

Pored uobičajene laboratorijske opreme koriste se i:

1) odmerne tikvice zapremine 50 ml i 100 ml;

2) vodeno kupatilo;

3) spektrofotometar (očitavanje na 550 nm).

Reagensi

1) Rastvor barbiturne kiseline: odmeri se 500 mg barbiturne kiseline i sa 70 ml vode prenese u odmernu tikvicu zapremine 100 ml. Stavi se u vodeno kupatilo da se rastvori, a zatim se ohladi i dopuni vodom do oznake.

2) Rastvor p-toluidina: odmeri se 10 g p-toluidina i laganim zagrevanjem na vodenom kupatilu rastvori u približno 50 ml izopropanola. Sa izopropanolom se prenese u odmernu tikvicu zapremine 100 ml i doda 10 ml ledene sirćetne kiseline, ohladi i dopuni izopropanolom do oznake. Rastvor se čuva na tamnom mestu i ne koristi najmanje 24 časa.

3) Destilovana voda bez kiseonika: kroz vruću vodu propušta se azot. Voda se zatim ohladi.

Pripremanje uzorka

Uzorak se priprema na način predviđen za metodu pripremanja uzorka za analizu, bez zagrevanja.

Određivanje

Odmeri se 10 g uzorka i bez zagrevanja rastvori u 20 ml destilovane vode bez kiseonika. Zatim se prenese u odmernu tikvicu zapremine 50 ml i dopuni do oznake (rastvor meda). Odmah posle pripremanja nastavlja se određivanje.

Od pripremljenog uzorka odmeri se pipetom 2 ml, prenese se u svaku od dve epruvete i doda 5 ml p-toluidina. U jednu epruvetu pipetira se 1 ml vode, a u drugu 1 ml rastvora barbiturne kiseline, pa se sadržaj dobro promeša. Epruveta u kojoj je voda služi kao slepa proba. Reagens treba dodavati bez prekida i to završiti za 1 do 2 minute. Kad intenzitet boje dostigne maksimum (3 do 4 minute), očita se apsorbancija na 550 nm u kiveti od 10 mm.

Količina hidroksimetilfurfurola izražava se u mg/100 g meda i grubo izračunava prema formuli:

	apsorbancija
mg HMF/100 g meda =	-----------------------------	x 19,2
	debljina sloja

Napomena: Količina HMF može se izračunati pomoću baždarenog dijagrama, primenom standardnih rastvora od 5 do 300 mg.

10. Polenova analiza za med

Deset grama dobro izmešanog meda rastvorenog u 20 ml hladne vode prenese se u posudu za testiranje ili drugi odgovarajući stakleni sud i stavi na vodeno kupatilo (na 45oC). Rastvor se centrifugira 3 do 5 minute (2500-3000 okretaja/minuta), tečnost se dekantuje tako da se ostavi samo nekoliko kapi preko taloga. Zagrejanom platinskom petljom stavi se kap sedimenta na staklo za mikroskopiranje, pa se u sloju od 1 x 1,5 cm razmaže po površini. Radi identifikacije veličine polenovih zrnaca, pripremljeni uzorak se upoređuje sa slikom iz atlasa.

11. Određivanje vode u matičnom mleču i polenu

Princip

Princip ove metode zasniva se na predestilaciji vode iz ispitivanog uzorka u specijalnom aparatu pomoću organskog rastvarača koji se ne meša sa vodom, a zatim se predestilovana količina izmeri u graudisanoj menzuri.

Metoda se primenjuje prilikom određivanje vode u matičnom mleču i cvetnom prahu.

Aparatura i pribor

Pored uobičajene laboratorijske opreme, koriste se i:

1) aparat za određivanje vode po Dean-Starku (sl. 2), zapremine 250 ml;

2) analitička vaga;

3) menzure zapremine 10 ml i 100 ml.

Reagens: ksilol

Određivanje

Odmeri se 5 g matičnog mleča, odnosno 30 g polena, stavi u tikvicu za destilaciju i prelije sa 150 ml ksilola. Zatim se aparat sastavi, voda pusti kroz hladnjak i pristupi destilaciji. Smeša se lagano destiliše, pri čemu se vodena para i para organskog rastvarača kondenzuju i skupljaju u graduisanoj cevi, a višak rastvarača vraća se natrag. Destilacija traje sve dok kondenzat ne postane potpuno bistar. Tada se zagrevanje prekida i kondenzat ostavi izvesno vreme da se voda potpuno izdvoji. Donji (vodeni sloj) ispusti se u menzuru i očita se količina vode.

Izračunavanje

Količina vode izražava se u procentima i izračunava po sledećoj formuli:

	100 a
procent vode =	--------------
	b

gde je:

a - broj ml očitane vode,

b - odmereni uzorak, u g.

12. Određivanje proteina u matičnom mleču

Princip

Princip ove metode zasniva se na biuret-reakciji, odnosno reakciji bakra sa peptidnom vezom, pri čemu nastaje ljubičasta boja, koja se određuje spektrofotometrijski na 546 nm. Izmerena apsorbancija je srazmerna koncentraciji proteina u rastvoru.

Aparatura i pribor

Pored uobičajene laboratorijske opreme, koriste se i:

1) spektrofotometar;

2) analitička vaga;

3) centrifuga;

4) odmerni balon zapremine 100 ml i 1000 ml;

5) kiveta;

6) pipeta od 1 ml i 10 ml.

Reagensi

1) Biuretski reagens: 4,5 g kalijum-natrijum-tartarata rastvori se u 40 ml NaOH 0,2 mol/l, doda se 1,5 g CuSO4 x 5H2O prethodno rastvorenog u 10 ml destilovane vode i 0,5 g kalijum-jodida. Rastvor se lagano izmeša, kvantitativno prenese u odmernu tikvicu zapremine 100 ml i dopuni do 100 ml sa 0,2 mol/l rastvora NaOH.

Rastvor mora biti bistar i bez taloga.

2) Rastvor natrijum-hidroksida, c(NaOH) = 0,2 mol/l; u odmerni balon zapremine 1000 ml rastvori se 3,4 g NaOH u oko 950 ml destilovane vode.

Rastvor se ohladi i dopuni vodom do oznake.

3) Rastvor za stabilizaciju: rastvori se 5 g kalijum-jodida u 0,2 mol/l NaOH i dopuni rastvorom 0,2 mol/l NaOH do 1000 ml.

4) Proteinski standard 6 g/l: serum krvi u kome je poznata količina proteina ili kristalisan ljudski albumin.

Određivanje

Na aluminijumskoj foliji dimenzija 15 mm x 15 mm odmeri se na analitičkoj vagi 100 mg matičnog mleča. Sve se prenese u kivetu za centrifugiranje i pomoću staklenog štapića potopi do dna kivete. Pipetom se doda 8 ml rastvora za stabilizaciju i još jednom dobro promeša da bi se mleč rastopio. Centrifugira se 10 min na 3000 obrtaja. Posle centrifugiranja, odmeri se 4 ml rastvora mleča, prenese u drugu kivetu i doda 1 ml biuretskog reagensa.

Istovremeno se pripremi slepa proba od 4 ml reagensa za stabilizaciju i 1 ml biuretskog reagensa. Posle 30 minuta meri se apsorbancija na talasnoj dužini od 546 nm.

Pod istim uslovima odredi se i apsorbancija standardnog rastvora.

Izračunavanje

Količina proteina izražava se u procentima i izračunava po sledećoj formuli:

	(Av - Asl/f x 2 x 100)
procent proteina =	--------------------------------------------
	a

gde je:

Av - apsorbancija uzorka;

Asl - apsorbancija slepe probe;

	As - As1
f - faktor =	------------------	;
	Cs

a - količina uzorka, u mg;

As - apsorbancija standarda;

Cs - količina proteina u standardu.

13. Određivanje ekstrakta propolisa u alkoholnom rastvoru

Aparatura i pribor

Za određivanje ekstrakta propolisa u alkoholnom rastvoru koristi se uobičajena laboratorijska oprema.

Reagens: etanol

Određivanje

Odmeri se 5 g propolisa i prenese u konusnu tikvicu (erlenmajer) i prelije sa 50 g etanola i ostavi na sobnoj temperaturi da se ekstrahuje preko noći. Posle toga tečnost se filtrira i uzima alikvot od tri grama filtrata koji se dva časa suši u sušnici, na temperaturi od 105oC. Posle dva časa, uzorak se izvadi iz sušnice, stavi u eksikator i ohladi. Ohlađen uzorak se meri.

Izračunavanje

Količina suve materije (ekstrakta) izražava se u procentima i izračunava po sledećoj formuli:

	100 x b x c
procent ekstrakta =	--------------------------
	d (a - c)

gde je:

a - masa filtrata, u g;

b - masa rastvarača, u g;

c - masa suvog ostatka, u g;

d - masa uzorka, u g.

Mere u mm

Slika 1.

¾¾¾¾¾ Spoljašnja cev

¾¾¾¾¾ Unutrašnja cev

Slika 2.

Aparat za destilaciju po Dean-Starku