PRAVILNIKO UTVRĐIVANJU MERA ZA RANO OTKRIVANJE, DIJAGNOSTIKU, SPREČAVANJE ŠIRENJA, SUZBIJANJE I ISKORENJIVANJE ZARAZNE BOLESTI ENZOOTSKE LEUKOZE GOVEDA, NAČINU NJIHOVOG SPROVOĐENJA, KAO I NAČINU UTVRĐIVANJA STATUSA GAZDINSTVA SLOBODNOG OD ENZOOTSKE LEUKOZE GOVEDA("Sl. glasnik RS", br. 51/2009) |
Ovim pravilnikom utvrđuju se mere za rano otkrivanje, dijagnostiku, sprečavanje širenja, suzbijanje i iskorenjivanje zarazne bolesti enzootrske leukoze goveda, način njihovog sprovođenja, kao i način utvrđivanja statusa gazdinstva slobodnog od enzootrske leukoze goveda.
Pojedini izrazi upotrebljeni u ovom pravilniku imaju sledeće značenje:
1) stado čini životinja ili grupa životinja koje se drže u gazdinstvu, a ako se u gazdinstvu odvojeno drži više od jednog stada, sva stada moraju imati isti zdravstveni status;
2) stado službeno slobodno od enzootske leukoze goveda jeste stado koje ispunjava uslove propisane u članu 17. ovog pravilnika;
3) područje ili država službeno slobodna od enzootske leukoze goveda jeste deo teritorije ili teritorija Republike Srbije za koje ispunjava uslove propisane u članu 21. ovog pravilnika;
4) područje jeste deo teritorije Republike Srbije površine od najmanje 2000 m2 koji je pod nadzorom ministarstva nadležnog za poslove veterinarstva (u daljem tekstu: Ministarstvo) i uključuje područje najmanje jednog upravnog okruga ili grada Beograda.
Dijagnostičkom ispitivanju na enzootsku leukozu podležu:
1) goveda starija od 24 meseca;
2) goveda koja se izlažu na sajmovima, smotrama i izložbama, ili se uvoze iz drugih zemalja.
Sumnjivim na enzootsku leukozu smatraju se goveda:
1) koja pokazuju klinički manifestne promene (otok limfnih čvorova i sl.) karakteristične za enzootsku leukozu goveda;
2) kod kojih nisu ustanovljene tumorozne promene na koži, limfnim čvorovima i organima, a serološko ispitivanje daje sumnjivu reakciju;
3) koja potiču iz zapata u kojima je utvrđena enzootska leukoza goveda ili sumnja na enzootsku leukozu;
4) kod kojih su, prilikom klanja ili uginuća, utvrđene karakteristične tumorozne promene, a nije izvršeno patohistološko ispitivanje;
5) kod kojih je prilikom hematološkog ispitivanja utvrđena leukocitoza sa izrazitom limfocitozom (65%).
II MERE RANOG OTKRIVANJA ENZOOTSKE LEUKOZE GOVEDA, DIJAGNOSTIKE I NAČIN NJIHOVOG SPROVOĐENJA
Sumnja na pojavu enzootske leukoze
U slučaju sumnje na pojavu enzootske leukoze goveda sprovode se sledeće mere:
1) stavljanje stada pod nadzor;
2) izdvajanje i izolaciju unutar stada goveda sumnjivih na enzootsku leukozu;
3) zabranu osemenjavanja i pripusta goveda sumnjivih na enzootsku leukozu;
4) zabranu korišćenja i isporuke mleka krava iz stada sumnjivog na enzootsku leukozu u objekte za obradu i preradu mleka osim radi odgovarajuće termičke obrade, ne dovodeći u pitanje posebne propise;
5) zabranu iznošenja hrane za životinje koja je bila ili je mogla biti u kontaktu sa govedima sumnjivim na enzootsku leukozu goveda;
6) zabranu upotrebe zajedničkih napajališta;
7) zabranu iznošenja stajskog đubriva i osoke sa gazdinstva;
8) zabranu uvođenja u stado ili stavljanja u promet goveda iz stada, osim upućivanja na prinudno klanje.
Mere iz stava 1. ovog člana primenjuju se sve dok se sumnja na pojavu enzootske leukoze goveda u stadu službeno ne isključi.
Dijagnostičko ispitivanje na enzootsku leukozu goveda
Dijagnostička ispitivanja na enzootsku leukozu goveda vrše se primenom jednom od metoda, i to:
1) imuno-difuzionog testa u skladu sa uslovima iz čl. 7. i 8. ovog pravilnika;
2) imunoenzimskog testa (ELISA) u skladu sa uslovima iz člana 9. ovog pravilnika.
Metoda imuno difuzije može se primeniti samo za pojedinačne testove.
Ako postoji opravdana sumnja na rezultate primenjenog testa, dodatna provera se sprovodi primenom imuno-difuzionog testa.
Agar gel imunodifuzni test sprovodi se tako što:
1) antigen koji se koristi u testu mora sadržati glikoproteine virusa uzročnika enzootske leukoze goveda. Antigen mora biti standardizovan prema EI serumu koji se nabavlja u State Veterinary Serum Laboratory, Kopenhagen;
2) standardizovani antigeni koji se koriste u laboratoriji moraju se najmanje jednom godišnje testirati u referentnim laboratorijama EU prema službenom standardizovanom serumu EU. Osim ove standardizacije, antigen koji se koristi može se menjati u skladu sa članom 8. ovog pravilnika;
3) reagensi za test moraju da se sastoje od:
(1) antigena: mora da sadrži specifične glikoproteine virusa uzročnika enzootske leukoze goveda koji je standardizovan prema EI serumu,
(2) serum testa,
(3) poznatog pozitivnog kontrolnog seruma,
(4) agar gela:
- 0,8% agara,
- 8,5% NaCl,
- 0,05 M Tris-puffer pH 7,2,
15 ml agara mora se uneti u Petrijevu šolju prečnika 8,5 mm, sa rezultatom od 2,6 mm dubine agara;
4) kalup sa sedam udubljenja slobodnih od vlage raspoređuje se u agar do dna posude: kalup se sastoji od središnjeg i šest okolnih udubljenja koja su raspoređena u krug; prečnik središnjeg udubljenja je 4 mm; prečnik perifernih udubljenja je 6 mm; udaljenost između središnjeg i perifernih udubljenja je 3 mm;
5) središnje udubljenje je ispunjeno standardizovanim antigenom, a periferna udubljenja 1 i 4 poznatim pozitivnim serumom, udubljenja 2, 3, 5 i 6 ispunjena su sa serumima testa. Udubljenja se moraju puniti dok se ne izravnaju sa površinom;
6) kao rezultat toga dobijaju se sledeće količine:
- antigena - 32 μl,
- kontrolnog seruma - 73 μl,
- serum testa - 73 μl;
7) inkubacija traje 72 sata na sobnoj temperaturi (od 20 do 27°C) u zatvorenoj vlažnoj komori;
8) se test može očitati nakon 24 ili 48 sati, ali se konačni rezultat može dobiti tek po isteku 72 sata, i to:
(1) test serum je pozitivan ako stvara specifičnu precipitacionu liniju sa antigenom virusa bovine leukoze i kompletnu identifikacionu liniju sa kontrolnim serumom,
(2) serum test je negativan ako ne stvara specifičnu precipitacionu liniju sa antigenom virusa bovine leukoze i ako ne iskrivljuje liniju kontrolnog seruma,
(3) reakcija se ne može smatrati konačnom ako liniju kontrolnog seruma iskrivljuje prema antigenu virusa bovine leukoze bez stvaranja vidljive precipitacione linije sa antigenom ili se ne može očitati ni kao pozitivna ni kao negativna.
Mogu se koristiti i drugi oblici testova, s tim da se E4 serum razređen u odnosu 1:10 u negativnom serumu detektuje kao pozitivan.
U sumnjivim reakcijama test se može ponoviti i koristiti koncentrovani serum.
Rastvori i materijali koji se koriste za standardizaciju antigena su:
1) 40 ml 1,6% agaroza u puferiranom 0,05 M Tris/HCl, pH 7,2 sa 8,5 NaCl;
2) 15 ml seruma koji sadrži antitela samo na glikoproteine virusa enzootske leukoze goveda, razređen u odnosu 1:10 u puferiranom 0,05 M Tris/HCl, pH 7,2 sa 8,5 NaCl;
3) 15 ml seruma leukoze goveda koji sadrži antitela samo na glikoproteine virusa enzootske leukoze goveda, razređen u odnosu 1:5 M Tris/HCl, pH 7,2 sa 8,5 NaCl;
4) četiri plastične Petrijeve šolje prečnika 85 mm;
5) punč promera od 4 do 6 mm;
6) referentni antigen;
7) antigen koji se mora normirati;
8) vodeno kupatilo (56 °C).
Postupak za standardizaciju antigena je sledeći:
1) agaroza se razredi (1,6%) u puferiranom Tris/HCl uz pažljivo zagrevanje do 100 °C;
2) zagrevanje u vodenom kupatilu na 56 °C traje sat vremena. Takođe, razređeni serum koji sadrži antitela samo na glikoproteine virusa enzootske leukoze goveda zagreva se u vodenom kupatilu na 56 °C. Potom se izmeša 15 ml rastvorene agaroze na 56 °C sa 15 ml seruma ( 1:10), protrese se i ulije 15 ml u obe Petrijeve šolje. Postupak se ponovi sa serumom koji je razređen u odnosu 1:5. Kad se agaroza stvrdne u njoj se naprave rupice, nakon čega se dodaje antigen;
3) dodavanje antigena vrši se u sve četiri Petrijeve šolje prema sledećem rasporedu:
(1) Petrijeve šolje 1 i 3:
- bunarčić A - nerazređen referentni antigen,
- bunarčić B - 1:2 razređen referentni antigen,
- bunarčić C i E - referentni antigen,
- bunarčić D - nerazređeni test antigen,
(2) Petrijeve šolje 2 i 4:
- bunarčić A - nerazređen test antigen,
- bunarčić B - 1:2 razređen test antigen,
- bunarčić C - 1:4 razređen test antigen,
- bunarčić D - 1:8 razređen test antigen.
Pri sprovođenju ogleda potrebno je pratiti i sledeća uputstva:
1) ogled se izvodi sa dva razređenja seruma (1:5 i 1:10) da bi se postigla optimalna precipitacija;
2) ako je prečnik precipitacionog prstena mali pri oba razređenja, tada se serum mora dalje razrediti;
3) ako je prečnik precipitacionog prstena pri oba razređenja prevelik i slabo vidljiv, tada se mora odabrati slabije razređen serum;
4) konačna koncentracija agaroze mora biti 0,8%, odnosno 5% i 10% posto seruma;
5) izmerene veličine prečnika uneti u koordinantni sistem. Razređenje antigena koji treba testirati sa istim promerom kao i referentni antigen koji predstavlja radno razređenje.
Pri sprovođenju imunoenzimskog testa (ELISA) za otkrivanje enzootske leukoze goveda koriste se sledeći materijali i reagensi:
1) mikropločice čvrste faze, cevčice ili neka druga čvrsta faza;
2) antigen koji se fiksira na čvrstu fazu sa ili bez poliklonalnih ili monoklonalnih antitela. Ako antigen u potpunosti obloži čvrstu fazu, svi uzorci testa koji imaju pozitivnu reakciju moraju se ponovo testirati na kontrolni antigen u slučaju enzootske leukoze goveda. Kontrolni antigen treba da bude istovetan sa antigenom, osim kod antigena ELG. Ako antitela oblože čvrstu fazu, antitela ne smeju reagovati na antigene, osim ELG antigena;
3) biološka tečnost koju treba testirati;
4) odgovarajuća pozitivna i negativna kontrola;
5) konjugat;
6) supstrat prilagođen korišćenom enzimu;
7) blokirajući rastvor, ako je potreban;
8) rastvor za razređivanje uzoraka testa za pripremu reagensa;
9) sistem očitavanja koji odgovara korišćenom supstratu.
Osetljivost ELISA testa mora biti na nivou na kojem E4 serum ima pozitivan rezultat kada je razređen 10 puta (serumski uzorci) ili 250 puta (mlečni uzorci) više nego razređenje koje se postiže individualnim uzorcima kada su uključeni u grupne uzorke. U grupama gde se uzorci (serum i mleko) testiraju individualno, E4 serum razređen 1:10 (u negativnom serumu) ili 1:250 (u negativnom mleku) mora imati pozitivan rezultat kad se testira u istom razređenju probe koja se koristi za individualne uzorke testa.
Naučni ili specijalistički instituti koji sprovode dijagnostička ispitivanja primenom ELISA metode za otkrivanje enzootske leukoze goveda odgovorni su za proveru kvaliteta ELISA testa, a naročito za određivanje, za svaku seriju proizvodnje broja uzoraka koji se udružuju na temelju vrednosti dobijenih za E4 serum.
E4 serum nabavlja se od National Veterinary Laboratory, Kopenhagen.
ELISA test može se koristiti na uzorku mleka ili surutke uzetih iz mleka prikupljenog na farmi od najmanje 30% muznih krava u fazi mlečnosti. Ako se koristi ta metoda, moraju se preduzeti mere kako bi se osiguralo da se uzeti uzorci mogu identifikovati sa životinjama od kojih su mleko ili ispitivani serumi uzeti.
III MERE ZA SPREČAVANJE ŠIRENJA, SUZBIJANJA I ISKORENJIVANJA ENZOOTSKE LEUKOZE GOVEDA
Potvrda enzootske leukoze goveda
Gazdinstvo se smatra zaraženim ako se kod jednog ili više goveda potvrdi enzootska leukoza goveda.
Obolelim od enzootske leukoze goveda smatraju se goveda kod kojih se:
1) serološkim ispitivanjem, primenom agar-gel imunodifuziona ili ELISA metode utvrdi pozitivna reakcija;
2) prilikom klanja, u organima ili tkivima utvrde morfološke i patohistološke promene karakteristične za enzootsku leukozu.
Goveda obolela od enzootske leukoze ne leče se.
Protiv enzootske leukoze ne vrši se vakcinacija.
Kada se potvrdi enzootska leukoza goveda, pored mera iz člana 5. ovog pravilnika, sprovode se sledeće mere:
1) ishrana životinja mlekom od zaraženih krava dozvoljena je samo nakon odgovarajuće termičke obrade ili nakon što je mleko upućeno u mlekaru gde se termički obrađuje, dok se hranjenje goveda mlekom koje nije prošlo termičku obradu može vršiti samo u stadima u kojima su sva goveda namenjena klanju, u skladu sa članom 13. ovog pravilnika;
2) obrada celih trupova, polutki, četvrtina, komada trupova i iznutrica zaraženih goveda koje su namenjene hranjenju životinja, na način kojim se sprečava širenje enzootske leukoze goveda.
Kada je enzootska leukoza goveda službeno potvrđena u stadu, veterinarski inspektor mora sprovesti nadzor nad objektima za preradu otpadaka životinjskog porekla kako bi utvrdio da nema opasnosti od širenja enzootske leukoze goveda putem životinjskih proizvoda proizvedenih u navedenim objektima.
Vlasnik je dužan da obavesti veterinara ili veterinarskog inspektora o svakom uginuću ili prinudnom klanju goveda na svom gazdinstvu.
U uverenje o zdravstvenom stanju koje prati goveda upućena na klanje kod kojih je utvrđena enzootska leukoza upisuje se: "Enzootska leukoza goveda".
Klanje goveda kod kojih je potvrđena enzootska leukoza goveda
U cilju iskorenjivanja enzootske leukoze goveda izvršiće se klanje svih goveda iz stada u kome je enzootska leukoza potvrđena, najkasnije u roku od 30 dana nakon što je vlasnik ili držalac životinja obavešten o rezultatima testiranja.
U slučaju upućivanje goveda iz člana 13. ovog pravilnika na klanje nijedno goveče ne sme napustiti stado bez odobrenja veterinarskog inspektora.
Sva goveda koja potiču iz stada u kome je potvrđena enzootska leukoza goveda moraju se dijagnostički ispitati na tu bolest.
Goveda koja potiču iz stada koja nisu zaražena enzootskom leukozom goveda, mogu se koristiti za obnovu stada.
Posle klanja goveda iz člana 13. ovog pravilnika, a pre uvođenja novih životinja u stado vrši se čišćenje, pranje, dezinfekcija štale i drugih objekata u kojima se drže goveda, kao i kontejnera i opreme, pod nadzorom veterinarskog inspektora.
Prevozna sredstva, kontejneri i oprema peru se, čiste i dezinfikuju nakon prevoza goveda ili materijala koji potiču od zaraženih goveda, kao i opreme i pratećih predmeta koji su bili u kontaktu sa tim životinjama. Posle upotrebe mesta za utovar se čiste i dezinfikuju.
Vlasnik ili držalac životinja sprečava kontakt svojih životinja sa govedima iz stada koja nisu istog zdravstvenog statusa.
IV NAČIN UTVRĐIVANJA STATUSA GAZDINSTVA SLOBODNOG OD ENZOOTSKE LEUKOZE GOVEDA
Status gazdinstva službeno slobodnog od enzootske leukoze goveda stiče se ako se utvrdi da je stado službeno slobodno od enzootske leukoze goveda, u skladu sa ovim pravilnikom.
Stado je službeno slobodno od enzootske leukoze ako:
1) nema dokaza, kliničkih ili na osnovu rezultata laboratorijskih ispitivanja, o postojanju enzootske leukoze goveda u stadu i nijedan ovakav slučaj nije potvrđen prethodne dve godine;
2) su sva goveda starija od 24 meseca reagovala negativno tokom prethodnih 12 meseci na dva testa obavljena u skladu sa čl. 6. do 9. ovog pravilnika u intervalima od najmanje 4 meseca ili stado ispunjava uslove iz tačke 1) ovog člana i nalazi se u području službeno slobodnom od enzootske leukoze goveda.
Goveda zadržavaju status stada službeno slobodnog od enzootske leukoze ako:
1) su ispunjeni uslovi iz člana 17. stav 2. tačka 1) ovog pravilnika;
2) goveda koja se uvode u stado potiču iz stada službeno slobodnog od enzootske leukoze goveda;
3) goveda starija od 24 meseca i dalje reaguju negativno na test obavljen u skladu sa čl. 6. do 9. ovog pravilnika, u intervalima od tri godine.
Status stada službeno slobodnog od enzootske leukoze goveda ukinuće se ako:
1) nisu ispunjeni uslovi iz člana 18. ovog pravilnika;
2) se laboratorijskim ili kliničkim pregledom posumnja da jedno ili više goveda ima enzootsku leukozu goveda, pri čemu se sumnjiva goveda odmah šalju na klanje.
Ako je status stada službeno slobodnog od enzootske leukoze goveda ukinut u skladu sa članom 19. ovog pravilnika, status se može ponovo steći ako:
1) je makar jedno goveče u stadu službeno slobodnom od enzootske leukoze goveda reagovalo pozitivno na jedan od testova iz člana 6. ovog pravilnika ili ako se kod jednog govečeta posumnja na infekciju, a sprovedene su sledeće mere:
(1) govedo koje je reagovalo pozitivno, a u slučaju krave i svako njeno tele, je napustilo stado i upućeno je na klanje pod nadzorom veterinarskog inspektora,
(2) sva goveda u stadu starija od 12 meseci reagovala su negativno na dva serološka testa (u intervalu od četiri do 12 meseci) obavljena u skladu sa čl. 6. do 9. ovog pravilnika najmanje tri meseca nakon uklanjanja pozitivnih životinja i njihovog mogućeg potomstva,
(3) je obavljeno epizootiološko ispitivanje sa negativnim rezultatom, a stada epizootiološki povezana sa zaraženim stadom, kod kojeg su sprovedene mere iz tačke 1) podtačka (2) ovog člana.
Izuzetno, Ministarstvo može odobriti izuzeće od obaveznog klanja teladi zaraženih krava, ako su odvojena od majke odmah nakon teljenja i ako ispunjavaju uslove iz tačke 2) podtačka (3) ovog člana;
2) je više goveda iz stada službeno slobodnog od enzootske leukoze goveda reagovalo pozitivno na jedan od testova navedenih u članu 6. ovog pravilnika ili kada se na neki drugi način posumnja na infekciju više goveda u stadu tako da:
(1) su sva goveda reagovala pozitivno, a u slučaju krava, i njihova telad, upućena su na klanje pod nadzorom veterinarskog inspektora,
(2) su sva goveda u stadu starija od 12 meseci reagovala negativno na dva testa, obavljena u skladu sa čl. 6. do 9. ovog pravilnika i to u intervalima od četiri do 12 meseci,
(3) sva goveda u stadu moraju posle identifikacije ostati u objektu sve do starosti od 24 meseca, kada se testiraju, u skladu sa čl. 6. do. 9. ovog pravilnika, izuzev ako Ministarstvo ne dozvoli slanje tih goveda direktno na klanje pod nadzorom veterinarskog inspektora,
(4) je obavljeno epizootiološko ispitivanje pokazalo negativan rezultat, a sva stada, epizootiološki povezana sa zaraženim stadom, su podvrgnuta merama tačke 2) podtačka (2) ovog člana.
Ministarstvo može proglasiti područje ili državu službeno slobodnu od enzootske leukoze goveda ako je ispunjen jedan od sledećih uslova:
1) ako su ispunjeni uslovi iz člana 17. ovog pravilnika i ako je najmanje 99,8% stada službeno slobodno od enzootske leukoze goveda;
2) ako nije potvrđen nijedan slučaj enzootske leukoze goveda u području ili državi u poslednje tri godine, a prisustvo tumora, za koje se sumnja da su posledica enzootske leukoze se obavezno prijavljuje, uz ispitivanje uzroka njihovog nastanka, a u slučaju države, sve životinje starije od 24 meseca u najmanje 10% svih stada, testirane metodom slučajnog odabira, imale su negativan rezultat u skladu sa čl. 6. do 9. ovog pravilnika u poslednja 24 meseca, a u slučaju određenog područja zemlje, sve životinje starije od 24 meseca su testirane i imale su negativan rezultat, u skladu sa čl. 9. do 12. ovog pravilnika, u prethodna 24 meseca;
3) ako svaka druga metoda pokazuje sa sigurnošću od 99% da je manje od 0,2% stada zaraženo.
Područje ili država zadržaće status službeno slobodnog od enzootske leukoze goveda ako:
1) su sve zaklane životinje na teritoriji države ili određenog područja podvrgnute postmortalnom pregledu na kome se svi tumori koji bi mogli biti posledica virusa enzootske leukoze šalju na laboratorijsku analizu;
2) Ministarstvo obaveštava Evropsku komisiju o svim slučajevima enzootske leukoze goveda koji se pojavljuju u njenom regionu;
3) se sva goveda koja reaguju pozitivno na bilo koji test iz člana 6. ovog pravilnika, zakolju, a njihova stada podležu ograničenjima sve do ponovnog vraćanja statusa, u skladu sa članom 20. ovog pravilnika;
4) sve životinje starije od dve godine su testirane ili jednom u prvih pet godina nakon dobijanja statusa, prema dijagnostičkim ispitivanjima iz čl. 6. do 9. ovog pravilnika, ili tokom prvih pet godina nakon dobijanja statusa prema procedurama koje sa sigurnošću od 99% potvrđuju da je manje od 0,2% stada zaraženo. Ako nijedan slučaj enzootske leukoze goveda u zemlji ili njenom određenom području nije zabeležen u proporciji jedno stado na 10000 stada u poslednje tri godine, može se doneti odluka, u skladu sa propisanim postupkom, da se broj rutinskih seroloških testova može smanjiti, pod uslovom da se sva goveda starija od 12 meseci u najmanje 1% stada, odabrana slučajnim uzorkom svake godine, podvrgnu testu koji se sprovodi u skladu sa čl. 6. do 9. ovog pravilnika.
Status područja ili države službeno slobodne od enzootske leukoze goveda ukinuće se u skladu sa propisanim postupkom, ako, kao rezultat ispitivanja, obavljenih u skladu sa članom 22. ovog pravilnika, postoji dokaz o značajnoj promeni situacije s obzirom na enzootsku leukozu goveda u području ili državi, koja je priznata kao službeno slobodna od enzootske leukoze goveda.
Status područja ili države službeno slobodne od enzootske leukoze goveda može se obnoviti u skladu sa propisanim postupkom iz člana 21. ovog pravilnika.
Smatra se da je enzootska leukoza goveda na gazdinstvu prestala, posle uspešno sprovedenih mera iz čl. 5. i 12. ovog pravilnika.
Danom stupanja na snagu ovog pravilnika prestaju da važe odredbe Pravilnika o merama za suzbijanje i iskorenjivanje enzootske leukoze goveda ("Službeni list SFRJ", broj 39/88).
Ovaj pravilnik stupa na snagu osmog dana od dana objavljivanja u "Službenom glasniku Republike Srbije", a odredbe čl. 17. do 23. primenjivaće se od 1. januara 2010. godine.