PRAVILNIKO NAČINU VRŠENJA SLUŽBENE KONTROLE ŽIVOTINJA PRE I POSLE NJIHOVOG KLANJA NA PRISUSTVO TRIHINELE U MESU("Sl. glasnik RS", br. 48/2022) |
Ovim pravilnikom bliže se propisuju način i uslovi za dobijanje zdravstvenog statusa u odnosu na trihinelu, kao i način vršenja službene kontrole životinja pre i posle njihovog klanja na prisustvo trihinele u mesu.
Pojedini izrazi upotrebljeni u ovom pravilniku imaju sledeće značenje:
1) kontrolisani uslovi držanja jesu uslovi koji se odnose na tip uzgoja svinja, u kome se svinje sve vreme drže u uslovima koje subjekt u poslovanju hranom kontroliše u pogledu hranjenja i smeštaja;
2) monitoring jeste sprovođenje niza planiranih aktivnosti koje se odnose na praćenje ili merenje, kako bi se dobio uvid u pravilnu primenu propisa o hrani, hrani za životinje i zdravlju životinja i obuhvata učestalost ispitivanja, broj životinja koje se ispituju i plan uzorkovanja;
3) subjekt u poslovanju hranom jeste držalac, odnosno vlasnik životinja na gazdinstvu na kojem se drže i uzgajaju životinje namenjene za klanje i proizvodnju mesa;
4) Trihinele (Trichinella) jesu sve nematode koje pripadaju vrstama roda trihinela.
Ministarstvo nadležno za poslove veterinarstva (u daljem tekstu: Ministarstvo), u skladu sa zakonom, može službeno dodeliti zdravstveni status"slobodno od trihinele" (u daljem tekstu: status"slobodno od trihinele") gazdinstvu ili kompartmentu na kojem se primenjuju kontrolisani uslovi držanja, ako subjekt u poslovanju hranom:
1) preduzme sve praktične mere predostrožnosti u pogledu izgradnje i održavanja objekta, kako bi se sprečio pristup glodarima i drugim vrstama sisara, kao i velikim pticama mesožderima u objekte u kojima se drže životinje;
2) primenjuje sopstveni program za kontrolu štetočina, posebno glodara, na efektivan način, kako bi se sprečila invazija svinja, kao i vodi podatke o sprovođenju tog programa prema zahtevima nadležnog organa;
3) obezbedi da se sva hrana za životinje doprema iz registrovanih ili odobrenih objekata koji proizvode hranu za životinje u skladu sa odredbama posebnog propisa o uslovima higijene hrane za životinje;
4) čuva hranu za životinje koja je namenjena vrstama životinja prejemčivim na trihinelozu u zatvorenim silosima ili drugim posudama u koje ne mogu da prodru glodari. Sva ostala hrana za životinje kojom se subjekt u poslovanju hranom snabdeva obrađuje se toplotom ili se proizvodi i skladišti u skladu sa odredbama posebnog propisa o uslovima higijene hrane za životinje;
5) obezbedi da se uginule životinje sakupe što je pre moguće, a najkasnije u roku od 24 sata od uginuća životinje i do neškodljivog uklanjanja drže u odgovarajućim uslovima u skladu sa posebnim propisom kojim se uređuju sporedni proizvodi životinjskog porekla. Uginula prasad mogu da se sakupe i do uklanjanja čuvaju na gazdinstvu u odgovarajućim zatvorenim kontejnerima;
6) obavesti Ministarstvo ako se u blizini gazdinstva nalazi deponija za sakupljanje komunalnog otpada, radi procene rizika;
7) obezbedi da su prasad i nabavljene svinje, koji se dopremaju na gazdinstvo, oplođeni i uzgajani u kontrolisanim uslovima držanja u integrisanom proizvodnom sistemu;
8) obezbedi da su svinje obeležene tako da svakoj životinji može da se prati poreklo do gazdinstva rođenja. Subjekt u poslovanju hranom može na gazdinstvo da primi nove životinje samo ako: one dolaze sa gazdinstava koje ima status"slobodno od trihinele", ili ako ih prati međunarodni sertifikat, overen od strane nadležnog organa zemlje izvoznice, kojim se potvrđuje da životinje dolaze sa gazdinstva koje ima status"slobodno od trihinele", ili ako se te životinje drže izdvojene, dok se ne dokaže da su rezultati seroloških ispitivanja, koje je odobrila nacionalna referentna laboratorija/referentna laboratorija Evropske unije, negativni. Uzimanje uzoraka za serološka ispitivanje može da počne tek pošto su životinje provele četiri nedelje na tom gazdinstvu;
9) obezbedi da nijedna svinja namenjena klanju ne izlazi izvan objekta za vreme trajanja celog proizvodnog procesa.
Subjekt u poslovanju hranom čije je gazdinstvo dobilo status"slobodno od trihinele" obaveštava Ministarstvo ako uslovi iz člana 3. ovog pravilnika više nisu ispunjeni, odnosno o drugim promenama koje mogu uticati na status gazdinstva u odnosu na prisustvo trihinele.
Službena kontrola na gazdinstvu koje je dobilo status"slobodno od trihinele" obavlja se periodično na osnovu procene rizika, uzimajući u obzir istoriju bolesti i prevalencu, prethodne nalaze, geografsko područje, prijemčivost životinja na trihinelu na tom području, praksu uzgajanja životinja, veterinarski nadzor i usaglašenost uzgajivača.
U toku sprovođenja službene kontrole kod domaćih svinja koje potiču sa gazdinstva koje ima status"slobodno od trihinele", vrši se uzorkovanje u skladu sa članom 8. ovog pravilnika.
U toku sprovođenja službene kontrole vrši se monitoring populacije domaćih svinja koje potiču sa gazdinstva ili kompartmenta koji ima status"slobodno od trihinele", kako bi se proverilo stvarno odsustvo trihinele kod te populacije.
Uzorci mesa uzimaju se i pregledaju na prisustvo parazita trihinele, u skladu sa metodama datim u Glavi I i II, Priloga 1 - Metode ispitivanja, koji je odštampan uz ovaj pravilnik i čini njegov sastavni deo (u daljem tekstu: Prilog 1).
Monitoring može da obuhvati i serološke metode kao dodatne metode za pregled.
Ako se u toku službene kontrole utvrdi da uslovi iz člana 3. ovog pravilnika više nisu ispunjeni, kao i u slučaju pozitivnog rezultata ispitivanja na trihinelu kod domaćih svinja, gazdinstvu se ukida status"slobodno od trihinele".
U slučaju pozitivnog rezultata ispitivanja na trihinelu kod domaćih svinja sa gazdinstva koje ima status"slobodno od trihinele" preduzima se i sledeće:
1) pregledaju se sve domaće svinje sa tog gazdinstva u vreme klanja;
2) pronalaze se i ispituju sve priplodne životinje koje su stigle na to gazdinstvo i, ako je to moguće, sve životinje koje su napustile gazdinstvo u periodu od šest meseci pre pozitivnog rezultata. U tu svrhu, uzorci mesa prikupljaju se i ispituju na prisustvo trihinele koristeći metode detekcije iz Glave I i II, Priloga 1. ovog pravilnika;
3) ispituje se širenje zaraze parazitom trihinele usled distribucije mesa domaćih svinja zaklanih u periodu pre pozitivnog rezultata, kada je to od značaja i u meri u kojoj je izvodljivo;
4) pokreće se epidemiološko ispitivanje kako bi se razjasnio uzrok zaraze, kada je to od značaja;
5) ako se nijedan zaraženi trup ne može identifikovati u klanici, preduzima se sledeće:
(1) povećanje veličine svakog uzorka mesa prikupljenog za ispitivanje sa trupova za koje postoji sumnja da su zaraženi trihinelom, ili
(2) proglašavanje trupova neodgovarajućim za ishranu ljudi, i
(3) neškodljivo uništavanje trupova ili delova trupa za koje postoji sumnja da su zaraženi trihinelom, kao i onih koji se tokom ispitivanja pokažu kao pozitivni.
Posle ukidanja statusa"slobodno od trihinele", gazdinstvo može ponovo dobiti status"slobodno od trihinele" kada se utvrdi da su ispunjeni uslovi navedeni u članu 3. ovog pravilnika.
Ako je službenom kontrolom na gazdinstvu ili kompartmentu utvrđena neispunjenost uslova iz člana 4. ovog pravilnika ili pozitivan rezultat ispitivanja na prisustvo trihinele, to gazdinstvo se izopštava iz kompartmenta, dok se ponovo ne utvrdi ispunjenost uslova.
Trupovi domaćih svinja uzorkuju se u objektima za klanje kao deo post mortem pregleda u zavisnosti od zdravstvenog statusa gazdinstva.
Svi trupovi sa gazdinstva koje nema status"slobodno od trihinele" sistematski se ispituju na prisustvo trihinele.
Svi trupovi priplodnih krmača i nerastova i/ili najmanje 10% trupova životinja poslatih na klanje svake godine, sa svakog gazdinstva koje ima status"slobodno od trihinele" ispituju se na trihinelu.
Sa svakog trupa uzima se uzorak i ispituje na prisustvo trihinele u laboratoriji ovlašćenoj u skladu sa zakonom, primenom jedne od sledećih metoda:
1) referentna metoda ispitivanja, koja je propisana u Glavi I, Priloga 1. ovog pravilnika; ili
2) ekvivalentna metoda ispitivanja, koja je propisana u Glavi II, Priloga 1. ovog pravilnika.
Trupovi konja, divljih svinja i drugih vrsta domaćih ili divljih životinja koji su prijemčivi na infekciju trihinelom, sistematski se uzorkuju u objektu za klanje ili objektima za rasecanje divljači u okviru post mortem pregleda.
Uzorak iz stava 5. ovog člana uzima se sa svakog trupa i ispituje u ovlašćenoj laboratoriji u skladu sa Prilogom 1. ovog pravilnika i Prilogom 2 - Ispitivanje mesa drugih vrsta životinja, koji je odštampan uz ovaj pravilnik i čini njegov sastavni deo.
U zavisnosti od rezultata ispitivanja na prisustvo trihinele i pod uslovom da subjekat u poslovanju hranom garantuje punu sledljivost, trupovi domaćih svinja i konja mogu da se raseku na najviše šest delova u objektu za klanje ili u delu za rasecanje koji se nalazi u istim prostorijama kao i delatnost klanja.
Izuzetno od stava 7. ovog člana, trupovi domaćih svinja i konja mogu da se raseku u objektu za rasecanje koji se nalazi uz klanicu ili je odvojen od klanice, pod uslovom da:
1) postupak bude u skladu za zakonom;
2) se trup ili njegovi delovi otpremaju u samo jedan objekat za rasecanje kao odredište;
3) se objekat za rasecanje nalazi na teritoriji Republike Srbije;
4) se u slučaju pozitivnog rezultata ispitivanja, svi delovi trupa proglase nebezbednim za ishranu ljudi.
Trupovi i meso nezalučene domaće prasadi, mlađih od pet nedelja, ne ispituju se na prisustvo trihinele.
Izuzetno od člana 8. st. 1-3. ovog pravilnika trupovi i meso domaćih svinja ne ispituju se na prisustvo trihinele, ako životinje potiču sa gazdinstva ili kompartmenta koje ima status"slobodno od trihinele" i ako:
1) u poslednje tri godine nije otkrivena autohtona zaraza trihinelom kod domaćih svinja koje se drže na gazdinstvima koja imaju status"slobodno od trihinele", a u tom periodu je vršeno stalno ispitivanje u skladu sa članom 8. ovog pravilnika; ili
2) istorijski podaci o stalnom ispitivanju koje je vršeno nad populacijom zaklanih svinja daju najmanje 95% sigurnosti da prevalenca trihinele nije veća od jedan od milion u datoj populaciji.
Ispitivanje mesa svinja trihinoskopskim pregledom/metodom kompresije u skladu sa Glavom III, Priloga 1 ovog pravilnika, vrši se samo kod odstupanja koja se odnose na male subjekte u poslovanju hranom životinjskog porekla u skladu sa posebnim propisom.
Trupovi iz člana 8. ovog pravilnika ili njihovi delovi, osim trupova iz člana 8. stav 8. ovog pravilnika, mogu da napuste objekat tek kada se utvrdi da je rezultat ispitivanja na prisustvo trihinele negativan.
Drugi delovi životinje namenjeni za ishranu ljudi ili životinja, koji sadrže tkivo poprečno-prugastih mišića, mogu da napuste objekat tek kada se utvrdi da je rezultat ispitivanja na prisustvo trihinele negativan.
Sporedni proizvodi životinjskog porekla koji nisu namenjeni za upotrebu kod ljudi i koji ne sadrže tkivo poprečno-prugastih mišića, mogu da napuste objekat pre nego što se utvrdi da je rezultat ispitivanja na trihinelu negativan.
U slučaju iz stava 3. ovog člana može da se izvrši ispitivanje na prisustvo trihinele ili prethodni tretman sporednih proizvoda životinjskog porekla, pre nego što se dozvoli da ovi proizvodi napuste objekat.
Ako u objektima za klanje postoji odobrena procedura kojom se obezbeđuje da svi delovi pregledanih trupova mogu da napuste objekat tek kada se utvrdi da je rezultat ispitivanja na prisustvo trihinele negativan, odnosno u slučaju iz člana 8. stav 8. ovog pravilnika, oznaka zdravstvene ispravnosti uređena propisom kojim se uređuje način i postupak vršenja službene kontrole hrane životinjskog porekla i način vršenja službene kontrole životinja pre ili posle klanja, može se upotrebiti pre nego što su poznati rezultati ispitivanja na trihinelu.
Metode laboratorijskog ispitivanja propisane Glavom I i II, Priloga 1. ovog pravilnika, koriste se za ispitivanje uzoraka navedenih u članu 8. ovog pravilnika, u službenoj laboratoriji koja je akreditovana u skladu sa važećim standarom ISO/IEC 17025.
Izuzetno od stava 1. ovog člana ispitivanje mesa na prisustvo trihinele, može da se obavlja u veterinarskim ambulantama, veterinarskim stanicama i veterinarskim klinikama i objektima za klanje, ako su ispunjeni sledeći uslovi:
1) da je jedina aktivnost laboratorije ispitivanje mesa na prisustvo trihinele;
2) poseduje stručnost, opremu i infrastrukturu potrebnu za otkrivanje prisustva Trichinella spp. u mesu;
3) raspolaže kvalifikovanim, osposobljenim i iskusnim osobljem koje redovno učestvuje u međulaboratorijskom ispitivanju i ima zadovoljavajuće rezultate u uporednim ispitivanjima ili proverama kvaliteta rada koje organizuje nacionalna referentna laboratorija za metode koje se upotrebljavaju za otkrivanje Trichinella spp. u mesu.
Svi pozitivni uzorci šalju se u referentnu laboratoriju da bi se utvrdila tipizacija vrste trihinele u uzorku koji je pozitivan.
Ako se utvrdi prisustvo na Trichinella spp. sprovodi se:
1) utvrđivanje sledljivosti zaraženih trupova i njihovih delova koji sadrže mišićno tkivo;
2) neškodljivo uklanjanje zaraženih trupova i njihovih delova;
3) ispitivanje izvora zaraze i eventualnog širenja među životinjama koje žive slobodno u prirodi;
4) povlačenje proizvoda iz maloprodaje ili od potrošača;
5) utvrđivanje vrste trihinele.
Danom stupanja na snagu ovog pravilnika prestaje da važi Pravilnik o merama za suzbijanje trihineloze životinja ("Službeni list SRJ", broj 20/95) i član 36. Pravilnika o načinu i postupku sprovođenja službene kontrole hrane životinjskog porekla i načinu vršenja službene kontrole životinja pre i posle njihovog klanja ("Službeni glasnik RS", broj 99/10).
Ovaj pravilnik stupa na snagu osmog dana od dana objavljivanja u "Službenom glasniku Republike Srbije", osim odredaba koje se odnose na status "slobodno od trihinele" koje se primenjuju od 1. januara 2023. godine.
METODE ISPITIVANJA
REFERENTNA METODA ISPITIVANJA
Veštačka digestija zbirnih uzoraka pomoću magnetske mešalice
1. Oprema, pribor i hemikalije:
(a) nož ili makaze (krive) i pinceta za sečenje uzoraka;
(b) tacne (posude) podeljene na 50 odvojenih kvadratnih pregrada od kojih u svaku može da se stavi najmanje 2 g mesa, ili druga oprema koja u potpunosti osigurava pojedinačno uzimanje i sledljivost uzoraka;
(v) uređaj za usitnjavanje mesa/seckalica za meso sa oštrim sečivom. Ako su uzorci veći od 3 g, mora da se koristi uređaj za mlevenje mesa sa promerom otvora rešetke/ploče od 2 do 4 mm ili makaze. Uzorak zamrznutog mesa ili jezika (posle uklanjanja površinskog vezivno-tkivnog sloja, koji ne može da se digestuje/svari), usitnjava se u uređaju za mlevenje mesa, a veličina uzorka mora srazmerno da se poveća;
(g) magnetne mešalice sa termostatski kontrolisanom pločom za zagrevanje i magnetnim štapićima za mešanje presvučenim teflonom, dužine oko 5 cm;
(d) konusni stakleni levkovi za odvajanje (sedimentaciju/separaciju/taloženje), kapaciteta najmanje 2 l, poželjno je da je sa ugrađenim teflonskim sigurnosnim ventilom/zatvaračem/slavinom;
(đ) stalkovi (stoni, metalni), prstenovi (držači levka) i štipaljke;
(e) sita spoljašnjeg promera/prečnika 11 cm, sa mrežicom od nerđajućeg čelika čiji su otvori promera 180 µm (mikrona);
(ž) levkovi unutrašnjeg promera/prečnika ne manjeg od 12 cm, za postavljanje sita;
(z) staklena posuda (čaša) kapaciteta 3 l;
(i) stakleni merni cilindri (menzure) kapaciteta 50 do 100 ml ili kivete za centrifugiranje;
(j) trihinoskop sa horizontalnom pločom/stalkom ili stereomikroskop sa sopstvenim izvorom svetlosti čiji intenzitet može da se podešava;
(k) Petrijeve šolje prečnika 9 cm (upotrebljavaju se sa stereomikroskopom) označene mrežom kvadratnih polja veličine 10 × 10 mm sa spoljašnje strane dna;
(l) posuda/korito/bazen za brojanje larvi (upotrebljava se sa trihinoskopom), izrađena od akrilnih (pleksiglas) ploča debljine 3 mm, sledeće konstrukcije:
- dno posude (korita) je veličine 180 × 40 mm i iscrtano je na kvadrate veličine 10 x 10 mm,
- stranice su veličine 230 x 20 mm,
- krajevi (ručke) su veličine 40 × 20 mm. Dno i krajevi moraju da se umetnu između stranica, tako da se na krajevima formiraju dve ručke. Gornja ivica stranica mora da bude izdignuta 7 do 9 mm iznad baze okvira koga čine stranice i krajevi. Svi delovi moraju da se spoje lepkom koji odgovara za lepljenje upotrebljenog materijala;
(lj) aluminijumska folija;
(m) 25% hlorovodonična kiselina;
(n) pepsin jačine 1:10 000 NF (US National Formulary), što odgovara 1:12 500 BP (British Pharmacopoea) i 1:2 000 FIP (Federation Internationale de Pharmacie) ili stabilizirajući pepsin sa najmanje 660 jedinica evropske farmakopeje/ml;
(nj) voda iz slavine/za piće zagrejana na 46-48°C;
(o) vaga sa najvećim dozvoljenim odstupanjem od 0,1 g;
(p) metalne posude kapaciteta 10 do 15 litara za sakupljanje ostatka digestivne tečnosti;
(r) pipete različite zapremine/veličine (1, 10 i 25 ml) i držači pipeta;
(s) termometar sa mernim opsegom od 1-100°C, sa tačnošću od 0,5°C;
(t) sifon/odvod za vodu iz slavine.
2. Prikupljanje i količina uzoraka za digestiju:
(a) u slučaju uzorkovanja trupova domaćih svinja, uzorak uzet sa korena dijafragme, na prelazu mišićnog u tetivasti deo, mora da ima težinu najmanje 1 g. Mogu da se koriste i posebna klješta (forceps) da bi se obezbedila tačnost od 1,00 do 1,15 g uzetog uzorka.
U slučaju priplodnih krmača i nerastova, mora da se uzme veći uzorak korena dijafragme, na prelazu mišićnog u tetivasti deo, težine najmanje 2 g.
U nedostatku korena dijafragme, mora da se uzme dvostruko teži uzorak, odnosno 2 g (ili 4 g u slučaju priplodnih krmača i nerastova), sa rebarnog ili grudnog dela dijafragme ili sa žvakaćih mišića, jezika ili trbušnih mišića;
(b) za meso rasečeno u komade, mora da se uzme uzorak težine najmanje 5 g poprečno-prugastih mišića sa što manje masnog tkiva, po mogućnosti što bliže kosti ili fasciji. Uzorak iste veličine se uzima od mesa koje nije namenjeno kuvanju ili bilo kom drugom načinu prerade;
(v) Od zamrznutog mesa, za ispitivanje mora da se uzme najmanje 5 g poprečno-prugastog mišićnog tkiva.
Težina uzoraka za ispitivanje odnosi se uzorak mesa bez masnog i vezivnog tkiva.
Posebnu pažnju potrebno je obratiti pri uzimanju uzorka mišićnog tkiva jezika, kako bi se izbegla kontaminacija površinskim slojem jezika, koji ne može da se digestuje/svari i može da spreči/oteža vidljivost/prozirnost i ispitivanje sedimenta.
3. Postupak rada
3.1. Potpuni zbirni uzorak (u ukupnoj količini od 100 g za istovremenu digestiju)
(a) 16 ± 0,5 ml hlorovodonične kiseline dodaje se u staklenu posudu od 3 l u kojoj se nalazi 2 l prethodno zagrejane vode iz slavine na 46-48°C; magnetni štapić se spušta na dno posude, koja se stavlja na već zagrejanu magnetnu mešalicu i uključuje mešanje pomoću magneta;
(b) mešavini vode i kiseline dodaje se 10 ± 0.2 g pepsina ili 30 ± 0.5 g tečnog pepsina;
(v) 100 g mišićnog tkiva prikupljenog u skladu sa odeljkom 2. ove glave, secka se u uređaju za usitnjavanje;
(g) usitnjeno meso se prenosi/stavlja u staklenu posudu od 3 l koja sadrži vodu, pepsin i hlorovodoničnu kiselinu;
(d) nož uređaja za usitnjavanje više puta se uranja u posudu sa digestivnom tečnošću, a posuda u kojoj se meso usitnjavalo, ispira se malom količinom digestivne tečnosti, kako bi se uklonili svi ostaci mesa koji su na zidu posude uređaja za usitnjavanje;
(đ) posuda se prekriva aluminijumskom folijom;
(e) magnetna mešalica mora da se podesi tako da održava stalnu temperaturu od 44-46°C i rotaciju magneta na dovoljno velikoj brzini da se stvori duboki vrtlog, da se pritom tečnost ne preliva ili prska iz posude;
(ž) digestivna tečnost se meša i traje sve dok se komadići mesa ne razgrade (oko 30 minuta). Mešalica se tada isključi i digestivna tečnost se sipa kroz sito u levak za odvajanje (sedimentaciju). Duže vreme digestije može da bude potrebno (ne preko 60 minuta) kada se digestuje/svare određeni delovi mišićnog tkiva (jezik, mišićno tkivo divljači itd.);
(z) efekat digestije smatra se zadovoljavajućim, ako na situ zaostane najviše 5% ostatka tkiva od početne količine zbirnog uzorka;
(i) dozvoljeno je da digestivna tečnost stoji u levku 30 minuta;
(j) posle 30 minuta, uzorak od 40 ml sedimenta digestivne tečnosti naglo se odlije u menzuru ili kivetu za centrifugiranje;
(k) digestivna tečnost i druge otpadne tečnosti, čuvaju se u posebnim posudama do očitavanja rezultata ispitivanja;
(l) 40 ml sedimenta/uzorka u menzuri/kiveti ostavi se da stoji 10 minuta, a zatim se 30 ml površinskog sloja tečnosti pažljivo odstrani usisavanjem, tako da u menzuri/kiveti ostane zapremina od najviše 10 ml;
(lj) ostatak sedimenta od 10 ml izlije se u posudu (korito) za brojanje larvi ili u Petrijevu šolju;
(m) menzura ili kiveta za centrifugiranje ispira se sa ne više od 10 ml vode iz slavine i dodaje uzorku u posudi (korito) za brojanje larvi ili Petrijevoj šolji. Zatim, uzorak se pregleda trihinoskopom ili stereomikroskopom pri uvećanju od 15-20 puta. Dozvoljena je detekcija larvi upotrebom drugih tehnika ili optičkih uređaja, pod uslovom da je ispitivanje pozitivnih kontrolnih uzoraka dalo jednake ili bolje rezultate od tradicionalnih metoda vizuelnog pregleda. U svim slučajevima sumnjivih polja ili pojave parazitima - sličnih oblika, mora da se koristi veće uvećanje - od 60 do 100 puta;
(n) sedimenti digestivne tečnosti moraju da se pregledaju čim su pripremljeni. Pregled ni pod kakvim okolnostima ne sme da se odloži za sledeći dan.
Ako sediment nije pregledan u roku od 30 minuta od ispuštanja u menzuru ili kivetu za centrifugiranje, mora da se izbistri na sledeći način: završni uzorak od 40 ml sedimenta izlije se u menzuru ili kivetu i ostavi da stoji 10 minuta. Zatim se površinski sloj tečnosti od 30 ml pažljivo odstrani usisavanjem, tako da ostane količina od 10 ml, koja se dopuni sa 30 ml vode iz slavine do ukupne količine/zapremine od 40 ml. Posle daljeg/ponovnog taloženja u trajanju od 10 minuta, 30 ml površinskog sloja tečnosti pažljivo se odstrani usisavanjem, tako da ostane količina od 10 ml sedimenta za ispitivanje u Petrijevoj šolji ili u posudi (koritu) za brojanje larvi. Menzura ili kiveta ispira se sa ne više od 10 ml vode iz slavine i ispirak se dodaje uzorku, koji se nalazi u Petrijevoj šolji ili posudi (koritu) za brojanje larvi za ispitivanje.
Ako se pri ispitivanju utvrdi da sediment nije bistar, uzorak mora da se sipa u menzuru ili kivetu i doda se 40 ml vode iz slavine i ponavlja se prethodno opisani postupak. Ovaj postupak može da se ponovi 2-4 puta, dok tečnost ne bude dovoljno bistra za pouzdano čitanje rezultata.
3.2. Zbirni uzorak manji od 100 g
Ako je potrebno, zbirnom uzorku od 100 g može da se doda do 15 g i ispita zajedno sa tim uzorcima u skladu sa pododeljkom 3.1. ovog odeljka.
Ako je uzorak veći od 15 g, mora da se pregleda kao zaseban zbirni uzorak.
Za zbirne uzorke do 50 g, digestivna tečnost i ostali sastojci mogu da se smanje na 1 litar vode, 8 ml hlorovodonične kiseline i 5 g pepsina.
3.3. Pozitivni ili sumnjivi/nepouzdani rezultati
Kada je rezultat ispitivanja zbirnog uzorka pozitivan ili sumnjiv/nepouzdan, uzima se novi uzorak od 20 g od svake svinje u skladu sa odeljkom 2. tačka (a) ove glave.
Uzorci od pet svinja po 20 g ispituju se kao zbirni uzorak prema postupku u skladu sa pododeljkom 3.1. ovog odeljka. Na ovaj način biće ispitani uzorci od 20 grupa po pet svinja.
Kada je utvrđena Trichinella u jednom zbirnom uzorku od pet svinja, uzima se dodatnih 20 g uzorka od svake svinje iz te grupe i svaki od njih se pregleda posebno prema postupku u skladu sa pododeljkom 3.1 i 3.2 ovog odeljka.
Uzorci sa parazitima čuvaju se u 90 % etil-alkoholu u cilju konzervisanja i identifikacije vrste u referentnoj laboratoriji Evropske unije ili u nacionalnoj referentnoj laboratoriji.
Posle sakupljanja/utvrđivanja parazita, tečnosti pozitivnog uzorka (digestivna tečnost, površinski sloj tečnosti, ispirci i dr.), moraju da se dekontaminiraju zagrevanjem na najmanje 60 ºC.
3.4 Postupak čišćenja i dekontaminacije nakon pozitivnog ili sumnjivog rezultata
Ako se ispitivanjem zbirnog ili pojedinačnog uzorka ili pojedinačnog uzorka dobije pozitivan ili sumnjiv rezultat, svi materijali u kontaktu sa mesom (mešalica i oštrica, posuda, štapić za mešanje, senzor temperature, konični levak za filtraciju, sito i pincete) moraju se pažljivo dekontaminirati pranjem u toploj vodi (65 do 90°C). Ako se pri pranju upotrebljava deterdžent, preporučuje se da se radi njegova uklanjanja svaki deo temeljno ispere.
EKVIVALENTNE METODE
A. METODA POMOĆU MEHANIČKE DIGESTIJE ZBIRNOG UZORKA - TEHNIKA SEDIMENTACIJE -
1. Oprema, pribor i hemikalije:
(a) nož ili makaze za sečenje uzoraka;
(b) tacne (posude) podeljene na 50 odvojenih kvadratnih pregrada od kojih u svaku može da se stavi najmanje 2 g mesa, ili druga oprema koja u potpunosti osigurava pojedinačno uzimanje i sledljivost uzoraka;
(v) uređaj za mlevenje mesa ili električni uređaj za usitnjavanje mesa/seckalica za meso;
(g) mešalica tipa Stomacher lab-blender 3500 termo model;
(d) plastične kese, odgovarajuće za Stomacher lab-blender;
(đ) konusni stakleni levkovi za odvajanje (sedimentaciju/separaciju/taloženje), kapaciteta najmanje 2 l, poželjno je da je sa ugrađenim teflonskim sigurnosnim ventilom/zatvaračem;
(e) stalkovi (stoni, metalni), prstenovi (držači levka) i štipaljke (fiksirane na stativu pomoću dvostrukog naglavka sa hvataljkama - 23 x 40 mm);
(ž) sita spoljašnjeg promera/prečnika 11 cm, sa mrežicom od nerđajućeg čelika ili mesinga čiji su otvori promera 180 µm (mikrona);
(z) levkovi unutrašnjeg prečnika ne manjeg od 12 cm, za postavljanje sita;
(i) stakleni merni cilindri (menzure) od 100 ml;
(j) termometar sa mernim opsegom od 1-100°C, sa tačnošću od 0,5°C;
(k) uređaj za vibriranje, npr. električni aparat za brijanje (bez nastavaka);
(l) sklopka koja se uključuje i isključuje u razmacima/intervalima od jedan minut;
(lj) trihinoskop sa horizontalnom pločom/stalkom ili stereomikroskop sa sopstvenim izvorom svetlosti čiji intenzitet može da se podešava;
(m) posuda/korito/bazen za brojanje larvi i veći broj Petrijevih šolja prečnika 9 cm, kao u Glavi I, odeljak 1. tačka (k) i (l) ovog priloga;
(n) 17,5 % hlorovodonična kiselina;
(nj) pepsin jačine 1:10 000 NF (US National Formulary), što odgovara 1:12 500 BP (British Pharmacopoea) i 1:2 000 FIP (Federation Internationale de Pharmacie) ili stabilizirajući pepsin sa najmanje 660 jedinica evropske farmakopeje/ml;
(o) veći broj posuda od 10 litara za dekontaminaciju aparature, npr. formalin, kao i za preostalu digestivnu tečnost posle digestije pozitivnih uzoraka;
(p) vaga sa najvećim dozvoljenim odstupanjem od 0,1 g.
2. Sakupljanje uzoraka za digestiju
Uzorci za digestiju sakupljaju se na način utvrđen u Glavi I, odeljak 2. ovog priloga.
3. Postupak
3.1. Usitnjavanje/Mlevenje
Ako se uzorci mesa prethodno usitne u uređaju za mlevenje mesa, poboljšava se kvalitet digestije. Kada se koristi, električna seckalica se uključuje tri do četiri puta u trajanju od jedne sekunde.
3.2. Postupak digestije
Postupak može da se sprovodi na potpunim zbirnim uzorcima od 100 g mesa (u ukupnoj količini od 100 g za istovremenu digestiju), ili na zbirnim uzorcima manjim od 100 g.
(a) Potpuni zbirni uzorak (100 g od 100 uzoraka za istovremenu digestiju)
- na uređaj Stomacher lab-blender 3500 stavlja se dvostruka plastična kesa. Temperatura se podešava na 40 do 41 ºC;
- u unutrašnju plastičnu kesu nalije se 1.5 litar prethodno zagrejane vode na 40 do 41 ºC;
- 25 ml 17,5 % hlorovodonične kiseline dodaje se vodi u plastičnoj kesi;
- tome se doda 100 uzoraka, svaki težine oko 1 g (na temperaturi od 25 do 30 ºC), uzetih na način koji je opisan u odeljku 2. ovog dela;
- na kraju, dodaje se 6 g pepsina. Ovaj redosled mora strogo da se poštuje da bi se izbegla razgradnja pepsina;
- zatim, Stomacher "meša" sadržaj kese u toku 25 minuta;
- plastična kesa se vadi iz Stomachera i digestivna tečnost se filtrira kroz sito u laboratorijsku čašu od 3 l;
- plastična kesa se ispira sa oko 100 ml vode. Ispirkom se dalje ispira sito i na kraju dodaje filtratu u laboratorijskoj čaši;
- zbirnom uzorku od 100 pojedinačnih uzoraka može da se doda do 15 pojedinačnih uzoraka i ispita zajedno sa tim uzorcima.
(b) Manji zbirni uzorci (manji od 100 uzoraka)
- na uređaj Stomacher lab-blender 3500 stavlja se dvostruka plastična kesa. Temperatura se podešava na 40ºC do 41ºC;
- digestivna tečnost se priprema mešanjem oko 1.5 litar vode i 25 ml 17,5% hlorovodonične kiseline. Tome se dodaje 6 g pepsina i sve se meša pri temperaturi od 40ºC do 41ºC. Ovaj redosled mora strogo da se poštuje, kako bi se izbegla razgradnja pepsina;
- od digestivne tečnosti odmerava se količina koja odgovara odnosu od 15 ml po gramu uzorka (npr. za 30 uzoraka zahtevana zapremina je 30 x 15 ml = 450 ml). Digestivna tečnost se stavlja u unutrašnju od dve plastične kese zajedno sa uzorcima mesa od 1 g (pri temperaturi od 25 do 30ºC) sakupljenim u skladu sa odeljkom 2. ovog dela;
- u spoljašnju kesu naliva se voda zagrejana na oko 41ºC, tako da ukupna zapremina obe kese iznosi 1.5 litar. U Stomacheru se sadržaj kese "meša" u toku 25 minuta;
- plastična kesa se izvadi iz Stomacher uređaja. Digestovani/svareni sadržaj se filtrira kroz sito u laboratorijsku čašu od 3 l;
- plastična kesa se ispira sa oko 100 ml vode (pri 25 do 30ºC), koja se kasnije koristi i za ispiranje sita i dodaje filtratu u laboratorijskoj čaši.
3.3. Sakupljanje larvi sedimentacijom
- Digestovanom svarenom sadržaju dodaje se led (300 do 400 g leda u listićima ili drobljenog leda), tako da se zapremina poveća na oko 2 l. Svareni sadržaj se meša dok se led ne otopi. U slučaju manjih zbirnih uzoraka (videti pododeljak 3.2 tačku (b) ovog odeljka), količina leda se proporcionalno smanjuje;
- ohlađeni svareni sadržaj se sipa u konusni stakleni levak za odvajanje (separator) zapremine 2 l, koji je opremljen uređajem za vibriranje (trešenje) na dodatnoj štipaljki;
- sedimentacija/taloženje traje 30 minuta i to sa prekidima, tj. smenjuju se jedan minut vibriranja i jedan minut mirovanja;
- posle 30 minuta, 60 ml sedimenta brzo se odlije u menzuru od 100 ml (posle upotrebe, menzura se ispere rastvorom deterdženta);
- 60 ml sedimenta ostavi se da stoji 10 minuta, a zatim se površinski sloj tečnosti pažljivo odstrani usisavanjem, tako da ostane zapremina od 15 ml, koja će se ispitati na prisustvo larvi;
- za usisavanje može da se upotrebi i brizgalica ("špric") za jednokratnu upotrebu, opremljena plastičnom cevčicom. Dužina cevčice mora biti tolika, da kada se "krilca" brizgalice postave na ivicu, u menzuri ostane 15 ml tečnosti/sedimenta;
- preostalih 15 ml sipa se u posudu za brojanje larvi ili u dve Petrijeve šolje i ispituje na trihinoskopu ili na stereomikroskopu;
- Menzura se ispira sa 5 do 10 ml vode iz slavine. Dobijeni ispirak dodaje se uzorku za ispitivanje;
- sediment mora da se ispita odmah posle pripreme.
Pregled ni pod kakvim okolnostima ne sme da se odloži za sledeći dan.
Ako sediment nije bistar, ili se ne ispita u roku od 30 minuta, potrebno ga je izbistriti na sledeći način:
- ukupna količina sedimenta od oko 60 ml sipa se u menzuru i ostavi da odstoji 10 minuta,
- zatim se usisavanjem uklanja 45 ml gornjeg sloja tečnosti,
- preostalih 15 ml tečnosti dopuni se sa 45 ml vode iz slavine,
- posle dalje sedimentacije u toku 10 minuta, opet se usisa gornji sloj tečnosti (oko 30 ml). Preostalih 15 ml, koji se koriste za ispitivanje, sipaju se u Petrijevu šolju ili u posudu za brojanje larvi,
- menzura se ispira sa 10 ml vode iz slavine. Ispirak se dodaje uzorku u Petrijevoj šolji ili u posudi za brojanje larvi za ispitivanje.
3.4. Pozitivni ili sumnjivi/nepouzdani rezultati ispitivanja
U slučaju pozitivnog ili sumnjivog/nepouzdanog rezultata ispitivanja, primenjuju se odredbe utvrđene u Glavi I, odeljak 3, pododeljak 3.3. ovog priloga.
B. METODA POMOĆU MEHANIČKE VEŠTAČKE DIGESTIJE ZBIRNOG UZORKA
- TEHNIKA "IZDVAJANJA NA FILTERU" -
1. Oprema, pribor i hemikalije:
Oprema, pribor i hemikalije koriste se kako je navedeno u delu A, odeljak 1. ove glave.
Dodatna oprema:
(a) Gelmanov separator zapremine 1 litar, opremljen držačem za filter (promer/prečnik 45 mm);
(b) filterske ploče koje se sastoje od okrugle mreže izrađene od nerđajućeg čelika sa porama/otvorima od 35 µm (promer ploče: 45 mm), dva gumena prstena debljine 1 mm (promer spoljašnjeg prstena: 45 mm; promer unutrašnjeg prstena: 38 mm), s tim da se okrugla mreža postavlja između dva gumena prstena i za njih pričvršćuje dvokomponentnim lepkom odgovarajućim za lepljenje oba materijala;
(v) Erlenmajer posuda zapremine 3 l, opremljena bočnom cevčicom za usisavanje;
(g) filterska pumpa;
(d) plastične kese, zapremine od najmanje 80 ml;
(đ) uređaj za zavarivanje/plombiranje plastičnih kesa;
(e) renilaza jačine 1:150 000 Sokslet jedinica po gramu.
2. Sakupljanje uzoraka
Uzorci se sakupljaju kako je navedeno u Glavi I, odeljak 2. ovog priloga.
3. Postupak
3.1. Mlevenje
Ako se uzorci mesa prethodno usitne u uređaju za mlevenje mesa, poboljšava se kvalitet digestije. Kada se koristi, električna seckalica se uključuje tri do četiri puta u trajanju od jedne sekunde.
3.2. Postupak digestije
Ovaj postupak može da se sprovodi na potpunim zbirnim uzorcima (u ukupnoj količini od 100 g za istovremenu digestiju), ili na zbirnim uzorcima manjim od 100 g.
(a) Potpuni zbirni uzorak (istovremeno 100 uzoraka)
Primenjuje se postupak u delu A, odeljak 3, pododeljak 3.2, tačka (a) ove glave;
(b) Manji zbirni uzorci (manje od 100 pojedinačnih uzoraka)
Primenjuje se postupak u delu A, odeljak 3. pododeljak 3.2, tačka (b) ove glave.
3.3. Sakupljanje larvi filtriranjem
(a) Digestovanom/svarenom sadržaju se dodaje led (300 do 400 g leda u listićima ili drobljenog leda), tako da se zapremina poveća na oko 2 l. Količina leda se proporcionalno smanjuje kada se digestuje/svari manja količina uzoraka;
(b) digestovani svareni sadržaj meša se dok se led ne istopi. Rashlađeni sadržaj se ostavlja najmanje tri minuta, koliko je potrebno da se larve sklupčaju;
(v) Gelmanov separator opremljen držačem za filter i diskom, stavlja se na Erlenmajer posudu koja je povezana sa filterskom pumpom;
(g) digestovani/svareni sadržaj sipa se u Gelmanov separator i filtrira. Pred kraj filtracije, prolaz tečnosti kroz filter može se pomogne usisavanjem pomoću filterske pumpe. Usisavanje mora da se prekine pre nego što filter postane suv, odnosno kada u separatoru ostane 2 do 5 ml tečnosti;
(d) kada se sva tečnost profiltrira, disk sa filterom se skida i stavlja u plastičnu kesu zapremine 80 ml zajedno sa 15 do 20 ml rastvora renilaze. Rastvor renilaze se priprema mešanjem 2 g renilaze u 100 ml vode iz slavine;
(đ) plastična kesa se dva puta zavaruje/plombira i postavlja između unutrašnje i spoljašnje kese Stomachera;
(e) Stomacher se uključuje i ostavlja da radi 3 minuta (npr. dok radi na potpunom ili nepotpunom uzorku);
(ž) posle tri minuta, plastična kesa se zajedno sa diskom sa filterom i rastvorom renilaze vadi iz Stomacher uređaja i otvara makazama. Tečni sadržaj se odlije u posudu za brojanje larvi ili u Petrijevu šolju. Kesa se ispira sa 5 do 10 ml vode. Ispirak se dodaje u posudu za brojanje larvi. Ispituje se pomoću trihinoskopa, ili stereomikroskopa;
(z) digestivna tečnost mora da se ispita odmah nakon pripreme. Ni u kom slučaju, ispitivanje ne sme da se odloži za sledeći dan.
Napomena: Disk sa filterom ne sme da se koristi ako nije potpuno čist. Ne sme da se dozvoli da se nečisti disk sa filterom osuši. Disk sa filterom može da se čisti uranjanjem u rastvor renilaze u toku noći. Pre upotrebe, pere se u svežem rastvoru renilaze u Stomacheru.
3.4. Pozitivni ili sumnjivi/nepouzdani rezultati ispitivanja
Kada je rezultat pozitivan ili sumnjiv, primenjuju se odredbe navedene u Glavi I, odeljak 3, pododeljak 3.3. ovog priloga.
V. METODA AUTOMATSKE VEŠTAČKE DIGESTIJE ZBIRNIH UZORAKA TEŽINE DO 35 g
1. Oprema, pribor i hemikalije:
(a) nož ili makaze za sečenje uzoraka;
(b) tacne (posude) podeljene na 50 odvojenih kvadratnih pregrada od kojih u svaku može da se stavi najmanje 2 g mesa, ili druga oprema koja u potpunosti osigurava pojedinačno uzimanje i sledljivost uzoraka;
(v) mešalica Trichomatic 35® sa umetkom za filtriranje;
(g) hlorovodonična kiselina - 8,5 ± 0,5% težine;
(d) prozirni polikarbonatni membranski filteri sa promerom od 50 mm i veličinom pora/otvora od 14 µm;
(đ) pepsin jačine 1:10 000 NF (US National Formulary), što odgovara 1:12 500 BP (British Pharmacopoea) i 1:2 000 FIP (Federation Internationale de Pharmacie) ili stabilizirajući pepsin sa najmanje 660 jedinica evropske farmakopeje/ml;
(e) vaga sa najvećim dozvoljenim odstupanjem od 0,1 g;
(ž) pinceta sa ravnim vrhovima;
(z) više mikroskopskih stakala dužine bočnih stranica najmanje 5 cm ili više Petrijevih šolja sa promerom od najmanje 6 cm, koje su zašiljenim alatom sa donje strane iscrtane u kvadrate površine 10 × 10 mm;
(i) stereomikroskop (povećanje 15 do 60 puta), sa sopstvenim izvorom svetla, ili trihinoskop sa horizontalnom pločom/stalkom;
(j) posuda za sakupljanje otpadnih tečnosti;
(k) veći broj posuda od 10 litara za dekontaminaciju aparature, npr. formalin, kao i za preostalu digestivnu tečnost posle digestije pozitivnih uzoraka;
(l) termometar sa opsegom merenja od 1 do 100 ºC, sa tačnošću od 0,5 ºC.
2. Sakupljanje uzoraka
Uzorci se sakupljaju kako je navedeno u Glavi I, odeljak 2. ovog priloga.
3. Postupak
3.1. Postupak digestije
(a) Filter se postavlja se u mešalicu, spoji se odvodna cev i postavi tako da se odliva u posudu za otpad;
(b) kada se mešalica uključi, počinje i zagrevanje;
(v) pre toga se otvori i zatvori ventil na dnu, koji je smešten ispod reakcione komore;
(g) zatim, dodaje se do 35 uzoraka, od kojih je svaki težak oko 1 g (pri 25 ºC do 30 ºC), a koji su uzeti od pojedinačnih uzoraka u skladu sa odeljkom 2. ovog dela.
Potrebno je proveriti da li su odstranjeni veći komadi tetiva, jer mogu da začepe membranski filter.
(d) sipa se voda do ivice komore za tečnost koja je spojena sa mešalicom (oko 400 ml);
(đ) sipa se oko 30 ml hlorovodonične kiseline (8,5%) do ivice manje, spojene komore za tečnost;
(e) postavi se membranski filter ispod grubog filtera u držač uloška filtera,
(ž) na kraju, dodaje se 7 g pepsina ili 21 g tečnog pepsina. Ovaj redosled mora strogo da se poštuje da bi se izbegla razgradnja pepsina;
(z) zatvori se poklopac reakcione komore i komore za tečnost;
(i) odabere se vreme trajanja digestije. Kratko vreme digestije (5 minuta) određuje se za uzorke svinja normalne starosti za klanje, a za druge uzorke, određuje se duže vreme (8 minuta);
(j) kada se uključi prekidač za početak rada mešalice, automatski počinje postupak pripreme i digestije, posle čega sledi filtriranje. Posle 10 do 13 minuta, postupak je završen i automatski se prekida;
(k) posle provere da li je komora prazna, otvori se poklopac reakcione komore. Ako je u komori ostalo pene ili bilo koje druge digestivne tečnosti, potrebno je ponoviti postupak u skladu sa pododeljkom 3.5. ovog odeljka.
3.2. Sakupljanje larvi
(a) Odstrani se držač filtera i prenese se membranski filter na mikroskopsko staklo ili Petrijevu šolju;
(b) membranski filter se pregleda stereomikroskopom ili trihinoskopom.
3.3. Čišćenje opreme
(a) U slučaju pozitivnog rezultata ispitivanja, reakciona komora mešalice se napuni ključalom vodom do dve trećine svoje zapremine. Voda iz slavine se sipa u spojenu komoru za tečnost, tako da pokrije donji senzor. Tada počinje automatsko čišćenje.
Dekontaminira se držač filtera i sva druga oprema, npr. upotrebom formalina;
(b) Na kraju radnog dana, komora za tečnost u mešalici se napuni vodom i propusti kroz standardni ciklus rada.
3.4. Upotreba membranskog filtera
Svaki polikarbonatni membranski filter može da se upotrebi najviše pet puta. Filter nakon svake upotrebe mora da se okrene. Osim toga, posle svake upotrebe filter treba da se proveri i utvrdi da nema oštećenja zbog kojih bi bio neprikladan za dalju upotrebu.
3.5. Postupak koji se primenjuje kada je digestija nepotpuna i kada ne može da se izvede filtriranje
Kada mešalica prođe kroz automatski ciklus u skladu sa pododeljkom 3.1. ovog odeljka, otvori se poklopac reakcione komore i proveri da li je u komori ostalo pene ili bilo kakve tečnosti. U tom slučaju, potrebno je učiniti sledeće:
(a) zatvori se donji ventil ispod reakcione komore;
(b) ukloni se držač filtera i prenese membranski filter na laboratorijsko staklo ili u Petrijevu šolju;
(v) stavi se novi membranski filter u držač filtera i pričvrsti se držač filtera;
(g) komora za tečnost mešalice napuni se vodom, dok se ne pokrije donji senzor;
(d) izvede se ciklus automatskog čišćenja;
(đ) kada je ciklus automatskog čišćenja gotov, otvori se poklopac reakcione komore i proveri da li ima zaostale tečnosti;
(e) ako je komora prazna, izvadi se držač filtera i pomoću pincete prenese membranski filter na laboratorijsko staklo ili u Petrijevu šolju;
(ž) pregledaju se oba membranska filtera u skladu sa pododeljkom 3.2. ovog odeljka. Ako filteri ne mogu da se pregledaju, ponovi se ceo proces digestije sa dužim vremenom digestije u skladu sa pododeljkom 3.1. ovog odeljka.
3.6. Pozitivni ili sumnjivi/nepouzdani rezultati
Kada je rezultat pozitivan ili sumnjiv, primenjuju se odredbe navedene u Glavi I, odeljak 3. pododeljak 3.3. ovog priloga.
G. METODA POMOĆU MEHANIČKE VEŠTAČKE DIGESTIJE - TEHNIKA "IZDVAJANJA NA FILTERU" I DETEKCIJA LARVI POMOĆU "LATEKS TESTA AGLUTINACIJE"
Ova metoda se smatra ekvivalentnom samo za ispitivanje mesa domaćih svinja.
1. Oprema, pribor i hemikalije:
(a) nož ili makaze za sečenje uzoraka;
(b) tacne (posude) podeljene na 50 odvojenih kvadratnih pregrada, od kojih u svaku može da se stavi najmanje 2 g mesa, ili druga oprema koja u potpunosti osigurava pojedinačno uzimanje i sledljivost uzoraka;
(v) uređaj za usitnjavanje mesa/seckalica za meso, sa oštrim sečivom. Ako su uzorci veći od 3 g, mora da se koristi uređaj za mlevenje mesa sa promerom otvora rešetke/ploče od 2 do 4 mm, ili makaze. Uzorak zamrznutog mesa ili jezika (posle uklanjanja površinskog vezivno-tkivnog sloja, koji ne može da se svari/digestira), usitnjava se u uređaju za mlevenje mesa, a veličina uzorka mora srazmerno da se poveća;
(g) magnetne mešalice sa termostatski kontrolisanom pločom za zagrevanje i magnetnim štapićima za mešanje presvučenim teflonom, dužine oko 5 cm;
(d) konusni stakleni levkovi za odvajanje (sedimentaciju/separaciju/taloženje), kapaciteta najmanje 3 l; poželjno je sa ugrađenim teflonskim sigurnosnim ventilom/zatvaračem/slavinom;
(đ) sita spoljašnjeg promera/prečnika 11 cm, sa mrežicom od nerđajućeg čelika čiji su otvori promera 180 µm (mikrona);
(e) čelični filtracioni aparat sa mrežastim filterima veličine 20 µm sa čeličnim levkom;
(ž) Vakuum pumpa;
(z) metalni ili plastični rezervoari, zapremine 10-15 litara, za sakupljanje digestivnog soka;
(i) 3D giratorna klackalica ("3D gyratory rocker");
(j) aluminijumska folija;
(k) 25% hlorovodonična kiselina;
(m) pepsin jačine 1:10 000 NF (US National Formulary), što odgovara 1:12 500 BP (British Pharmacopoea) i 1:2 000 FIP (Federation Internationale de Pharmacie) ili stabilizirajući pepsin sa najmanje 660 jedinica evropske farmakopeje/ml;
(l) voda iz slavine/za piće zagrejana na 46-48°C;
(lj) vaga sa najvećim dozvoljenim odstupanjem od 0,1 g;
(m) pipete različitih veličina (1,10 i 25 ml), mikropipete u skladu sa uputstvima proizvođača lateksne aglutinacije i držači pipeta;
(n) najlonski mrežasti filteri prečnika 20 mikrona koji se uklapa u sistem za filtriranje;
(nj) plastična ili čelična forceps klješta od 10-15 cm;
(o) konusne bočice od 15 ml;
(p) pištolj sa teflonskim ili čeličnim konusnim vrhom koji može da stane u konusne bočice;
(r) termometar sa mernim opsegom od 1-100°C, sa tačnošću od 0,5°C;
(s) latek aglutinacijske karte u sklopu Trichin-L antigen test kita, validirane pod šifrom EURLP_D_001/2011;
(t) puferski rastvor sa konzervansom (razblaživač uzorka) u sklopu Trichin-L antigen test kita, validirane pod šifrom EURLP_D_001/2011;
(ć) pufer sa dodatkom konzervansa (negativna kontrola) u sklopu Trichin-L antigen test kita validirane pod šifrom EURLP_D_001/2011;
(u) pufer sa dodatkom antigena Trichinella spiralis i konzervansom (pozitivna kontrola) u sklopu Trichin-L antigen test kita, validirane pod šifrom EURLP_D_001/2011;
(f) pufer sa polistirenskim česticama prekrivenim antitelima dopunjenim konzervansom (lateks kuglice) u sklopu Trichin-L antigen test kita, validirane pod šifrom EURLP_D_001/2011;
(h) štapići za jednokratnu upotrebu.
2. Prikupljanje i količina uzoraka
Za prikupljanje i količinu uzorka pratiti postupak predviđen u Glavi I, odeljku 2. ovog priloga.
3. Postupak rada
3.1. Potpuni zbirni uzorak (100 g od 100 uzoraka za istovremenu aglutinaciju)
(a) 16 ± 0,5 ml hlorovodonične kiseline dodaje se u staklenu posudu od 3 l u kojoj se nalazi 2 l ± 200 ml prethodno zagrejane vode iz slavine, na 46-48°C; magnetni štapić se spušta na dno posude, koja se stavlja na već zagrejanu magnetnu mešalicu i uključuje mešanje pomoću magneta;
(b) mešavini vode i kiseline dodaje se 10 ± 1 g pepsina u prahu (ili 30 ± 3 ml tečnog pepsina);
(v) 100 do 115 g uzoraka uzetih u skladu sa odeljkom 2. ovog dela usitnjava se u mešalici sa 150 ml +/- 15 ml prethodno zagrejanog digestivnog pufera;
(g) usitnjeno meso prebacuje se u posudu od 3 l, u kojoj se nalaze voda, pepsin i hlorovodonična kiselina;
(d) nož uređaja za usitnjavanje se više puta uranja u posudu sa digestivnim sokom, a posuda u kojoj se usitnjavalo meso, ispere se malom količinom digestivnog soka da bi se uklonilo sve meso koje se zadržalo;
(đ) posuda se pokrije aluminijskom folijom;
(e) magnetna mešalica mora da se podesi tako da tokom rada održava stalnu temperaturu od 44 do 46°C. Tokom mešanja, digestivni sok mora da se rotira dovoljnom brzinom da bi se stvorio duboki vir, tako da ne dolazi do prskanja sadržaja iz posude;
(ž) digestivni sok se meša dok se delovi mesa ne razgrade (oko 30 minuta). Tada se mešalica isključi, a digestivni sok izlije kroz sito u sedimentni levak. Duže vreme digestije (najduže 60 minuta) može biti potrebno ako se "vare" određene vrste mesa (jezik, meso divljači itd.) ;
(z) postupak veštačke digestije smatra se zadovoljavajućim kada na situ ne ostane više od 5 % početne težine uzorka;
(i) najlonski filtar sa otvorima od 20 mikrona stavlja se na filtracijsku podlogu. Čelični konusni levak za filtraciju fiksira se na podlogu sistemom za blokiranje i čelično sito sa otvorima promera 180 mikrona stavlja se na levak. Vakuumska pumpa spojena je sa filtracionom podlogom i sa metalnom ili plastičnom posudom za skupljanje digestivnog soka;
(j) mešanje se zaustavlja i digestivni sok se kroz sito izliva u levak za filtraciju. Posuda se ispira sa oko 250 ml tople vode. Tečnost za ispiranje izliva se u posudu za filtraciju nakon što je digestivni sok uspešno filtriran;
(k) membrana za filtraciju uzima se pincetama, držeći membranu za rub. Membrana za filtraciju presavija se najmanje četiri puta i stavlja u konusnu cevčicu od 15 ml. Odabir konusnu cevčice mora se prilagoditi tučku;
(l) membrana za filtraciju gura se na dno konusne cevčice od 15 ml pomoću tučka i snažno pritiska, vršeći oko 20 uzastopnih pokreta napred-nazad tučkom, koji bi trebalo pozicionirati u pregibe membrane za filtraciju prema uputstvima proizvođača;
(lj) pipetom se dodaje 0,5 ml ± 0,01 ml uzorka razređivača u konusnu cevčicu od 15 ml, a membrana za filtraciju se homogenizuje pomoću tučka uzastopnim kratkim pokretima napred-nazad tekom 30 sekundi, izbegavajući nagle pokrete, kako bi se ograničilo prskanje sadržaja prema uputstvima proizvođača;
(m) svaki uzorak, negativna i pozitivna kontrola, raspoređuju se pomoću pipete u razna polja kartice za aglutinaciju prema uputstvima proizvođača;
(n) lateks kuglice dodaju se pipetom u svako polje kartice za aglutinaciju, prema uputstvima proizvođača, tako da se ne dovedu u kontakt sa uzorcima i kontrolama. U svakom polju, lateks kuglice se lagano mešaju štapićem za jednokratnu upotrebu, dok homogeni sadržaj ne prekrije celo polje;
(nj) kartica za aglutinaciju stavlja se u trodimenzionalnu mešalicu i mešaju se tokom 10 +/- 1 minuta prema uputstvima proizvođača;
(o) nakon isteka vremena određenog prema uputstvima proizvođača, mešanje se zaustavlja i kartica za aglutinaciju stavlja se na ravnu ploču i rezultati reakcije čitaju se odmah prema uputstvima proizvođača. Ako je uzorak pozitivan, moraju se pojaviti agregati kuglica. Ako je uzorak negativan, suspenzija ostaje homogena bez agregata kuglica.
3.2. Uzorci manji od 100 g kako je utvrđeno u Glavi I, odeljak 3. pododeljak 3.2. ovog priloga.
Za uzorke manje od 100 g primenjuje se postupak utvrđen u Glavi I, odeljak 3, pododeljak 3.2. ovog priloga.
3.3. Pozitivni ili sumnjivi rezultati
Ako se pregledom zbirnog uzorka dobije pozitivan ili sumnjiv rezultat lateks aglutinacije, uzima se dodatni uzorak od 20 g od svake svinje, u skladu sa Glavom I, odeljak 2, tačka (a) ovog priloga. Uzorci od po 20 g od pet svinja ispituju se kao zbirni uzorak primenom metode opisane u pododeljku 3.1. ovog odeljka. Na taj se način moraju ispitati uzorci iz 20 zbira od po pet svinja.
Ako se od pet svinja dobije pozitivna lateks aglutinacija, uzima se dodatnih 20 uzoraka od pojedinih svinja iz zbira i svaki se ispituje odvojeno pomoću metode opisane u pododeljku 3.1. ovog odeljka.
Ako se dobije pozitivan ili nejasan rezultat lateks aglutinacije, najmanje 20 g mišića svinja mora da se pošalje nacionalnoj referentnoj laboratoriji, radi validacije pomoću jedne od metoda opisanih u Glavi I ovog priloga.
Uzorci parazita moraju da se drže u 90% etil alkoholu radi konzerviranja i identifikacije na nivou vrste/specijesa u EU referentnoj laboratoriji ili nacionalnoj referentnoj laboratoriji.
Posle prikupljanja parazita, "pozitivna" tečnost mora da se dekontaminira zagrevanjem na najmanje 60°C.
3.4. Postupak čišćenja i dekontaminacije posle pozitivnog ili sumnjivog rezultata
Ako se ispitivanjem zbirnog ili pojedinačnog uzorka dobije pozitivan ili sumnjiv rezultat lateks aglutinacije, svi materijali u kontaktu sa mesom (posude za mešanje i oštrica, tučak, posuda, štapić za mešanje, senzor temperature, konusni levak za filtraciju, sito i pincete) moraju se pažljivo dekontaminirati potapanjem nekoliko sekundi u toploj vodi (65 do 90°C).
Ostaci mesa ili neaktivne larve koje mogu ostati na površini mesa, mogu se ukloniti čistim sunđerom i tekućom vodom. Ako je potrebno, može se dodati nekoliko kapi deterdženta radi odmašćivanja opreme. Preporučuje se zatim da se svaki komad opreme temeljno ispere kako bi se uklonio svaki trag deterdženta.
E. Test veštačke digestije za in vitro otkrivanje larvi Trichinella spp. u uzorcima mesa, PrioCHECK® Trichinella AAD kit
Metoda se smatra ekvivalentnom samo za ispitivanje mesa domaćih svinja.
PrioCHECK® Trichinella AAD kit upotrebljava se u skladu sa uputstvima za upotrebu opreme pomoću levaka za odvajanje (Lenz NS 29/32) i staklenom epruvetom od 80 ml.
TRIHINOSKOPSKI PREGLED
1. Uređaj:
a) trihinoskop opremljen lampom, sa uvećanjem 60-80 puta i 80-100 puta ili stereomikroskop sa sopstvenim izvorom svetlosti čiji intenzitet može da se podešava;
b) kompresiono staklo (kompresorijum), koje se sastoji od dve staklene ploče, od kojih je jedno staklo podeljeno (obeleženo) na polja jednake površine;
v) male zakrivljene makaze;
g) male pincete;
d) nož za sečenje uzoraka;
đ) male numerisane posude sa pregradama za odvojeno držanje uzoraka;
e) pipeta;
ž) staklena posuda sa sirćetnom kiselinom i staklena posuda sa rastvorom natrijum hidroksida za prosvetljivanje kalcifikovanih larvi i omekšavanje osušenog mesa.
2. Uzimanje uzoraka
U slučaju celih trupova, uzima se nekoliko uzoraka veličine lešnika od svake životinje:
(a) kod domaćih svinja, uzorci se uzimaju od oba korena dijafragme, na prelazu mišićnog u tetivasti deo;
(b) ako neki mišići nisu dostupni, uzima se ukupno četiri uzorka od mišića koji su na raspolaganju;
(v) od mesa u komadima, uzima se četiri uzorka veličine lešnika poprečno-prugastog mišićnog tkiva, ako je moguće bez masnog tkiva, sa različitih mesta, po mogućnosti u blizini kosti ili tetiva.
3. Postupak:
a) po pravilu, u kompresorijum se stavlja 1,0 ± 0,1 g mesa, što odgovara 28 isečaka (komadića) mesa veličine zrna ovsa sa jedne polovine trupa. Ako je neophodno, treba upotrebiti dva kompresorijuma sa ukupno 56 isečaka veličine zrna ovsa;
b) ako su prisutna oba korena dijafragme na trupu domaće svinje, službeno lice (pregledač) koje pregleda meso na prisustvo trihinele, seče po 28 komadića veličine zrna ovsa od uzoraka, što ukupno iznosi 56 isečaka;
v) ako je prisutan samo jedan koren dijafragme, 56 isečaka se seče sa različitih mesta, ako je moguće na prelazu mišićnog u tetivasti deo;
g) od svakog uzorka uzetog od druga četiri mišića divlje svinje, seče se sedam komadića veličine zrna ovsa, što ukupno iznosi 28 isečaka;
d) službeno lice (pregledač) koje pregleda meso na prisustvo trihinele, pritiska/komprimuje 56 isečaka između staklenih ploča, tako da normalan štampani/novinski tekst može da se čita kroz preparat;
đ) ako je uzorak (mesa) za ispitivanje suv i star, pre kompresije mora da se omekša u toku 10 do 20 minuta u rastvoru jednog dela natrijum hidroksida i dva dela vode;
e) od svakog uzorka uzetog od mesa u komadima, službeno lice (pregledač) koje pregleda meso na prisustvo trihinele, seče po 14 komadića veličine zrna ovsa, što ukupno iznosi 56 isečaka;
ž) mikroskopski pregled svakog preparata mora da se izvede polako i pažljivo, pri uvećanju od 60 do 80 puta;
z) ako se trihinoskopskim pregledom uoči sumnjivo polje, pregled ovog polja trihinoskopom mora da se uradi pri najvećem uvećanju (80 do 100 puta);
i) u slučaju nesigurnog rezultata, ispitivanje se ponavlja na drugim uzorcima i isečcima/preparatima sve dok se ne dobije pouzdan rezultat. Trihinoskopski pregled jednog kompresorijuma mora da traje najmanje 6 minuta;
j) minimalno vreme određeno za pregled jednog kompresorijuma, ne uključuje vreme potrebno za uzimanje uzoraka i pripremu preparata.
3.1. Pozitivni ili sumnjivi rezultati
Ako se pregledom uzorka dobije pozitivan ili sumnjiv rezultat, obavezno je uzorke pregledati, u skladu sa Glavom I ovog priloga.
3.2. Postupak čišćenja i dekontaminacije posle pozitivnog ili sumnjivog rezultata
Ako se ispitivanjem uzorka dobije pozitivan ili sumnjiv rezultat, svi materijali u kontaktu sa mesom moraju se pažljivo dekontaminirati potapanjem nekoliko sekundi u toploj vodi (65 do 90°C).
ISPITIVANJE MESA DRUGIH VRSTA ŽIVOTINJA
Meso konja, meso divljači i druge vrste mesa koje bi mogle da sadrže trihinele, ispituju se u skladu sa jednom od metoda veštačke digestije navedenih u Prilogu 1 ovog pravilnika, uz sledeće izmene:
(a) uzorci težine najmanje 10 g uzimaju se iz mišića jezika ili spoljašnjeg žvakaćeg mišića (m. masseter) konja i iz mišića prednje noge, jezika ili dijafragme (diaphragma) divljih svinja;
(b) u slučaju kada mišići iz tačke (a) ovog priloga nedostaju kod konja, uzima se veći uzorak korena dijafragme na prelazu u tetivasti deo. Sa mišića mora da se odstrani vezivno i masno tkivo;
(v) najmanje 5 g uzorka se digestira se u skladu sa referentnom metodom ispitivanja iz Priloga 1, Glave I ovog pravilnika ili u skladu sa ekvivalentnom metodom iz Priloga 1, Glave II ovog pravilnika. Ukupna težina mišića koji se ispituje u svakoj digestiji ne sme biti veća od 100 g prilikom ispitivanja metodom iz Priloga 1, Glava I i Glava II, deo A) i B) ovog pravilnika, odnosno od 35 g u slučaju ispitivanja metodom iz Priloga 1, Glava II, deo V) ovog pravilnika;
(g) kada je utvrđeno prisustvo trihinela, uzima se dodatnih 50 g uzorka za ponovno nezavisno ispitivanje,
(d) ne dovodeći u pitanje propise o očuvanju životinjskih vrsta, meso divljih životinja kao što su medvedi, sisari mesožderi (uključujući morske sisare) i gmizavci, osim divljih svinja, mora da se ispita uzimanjem 10 g uzorka mišića sa predilekcionih mesta, ili većeg uzorka, ako takva mesta nisu na raspolaganju.
Predilekciona mesta su:
- kod medveda: dijafragma, žvakaći mišić (m. masseter) i jezik,
- kod morža: jezik,
- kod krokodila: žvakaći mišići (m. masseter i m. pterygoideus) i međurebarni mišići (mm. intercostales),
- kod ptica: mišići glave (npr. m. masseter i vratni mišići);
(đ) trajanje veštačke digestije mora biti dovoljno dugo da se osigura odgovarajuća digestija tkiva ovih životinja, ali ne sme da traje duže od 60 minuta.