PRAVILNIK O PARAMETRIMA I METODAMA ZA ANALIZU I UTVRĐIVANJE KVALITETA ŠIRE, VINA I DRUGIH PROIZVODA OD GROŽĐA, ŠIRE, KLJUKA I VINA KOJI SE KORISTE U PROIZVODNJI VINA ("Sl. glasnik RS", br. 107/2014 i 72/2023)

Član 1

Ovim pravilnikom se bliže propisuju parametri i metode za analizu i utvrđivanje kvaliteta šire, vina i drugih proizvoda od grožđa, šire, kljuka i vina koji se koriste u proizvodnji vina (u daljem tekstu: drugi proizvodi).

Član 2

Kvalitet šire, vina i drugih proizvoda utvrđuje se na osnovu vrednosti sledećih parametara:

1) gustine i relativne gustine na 20°C;

2) alkoholne jačine;

3) sadržaja ukupnog suvog ekstrakta;

4) sadržaja redukujućih šećera;

5) sadržaja pepela;

6) pH vrednosti;

7) sadržaja ukupnih kiselina;

8) sadržaja isparljivih kiselina;

9) sadržaja neisparljivih kiselina;

10) sadržaja slobodnog i ukupnog sumpor dioksida;

11) sadržaja limunske kiseline;

12) sadržaja ugljen dioksida;

13) sadržaja šećera određenog refraktometrom;

14) relativnog odnosa neizmenljivih atoma deuterijuma i vodonika u etanolu primenom instrumentalne tehnike TC/EA - IRMS;

15) distribucije deuterijuma u etanolu dobijenom fermentacijom grožđane šire, koncentrovane grožđane šire, grožđanog šećera (rektifikovane grožđane šire) i vina primenom nuklearne magnetne rezonancije (SNIF-NMR/RMN-FINS);

16) sadržaja saharoze;

17) sadržaja glukoze i fruktoze;

18) alkaliteta pepela;

19) relativnog odnosa stabilnih izotopa ugljenika (13C/12C) u vinskom etanolu ili etanolu dobijenom fermentacijom grožđane šire, koncentrovane šire ili grožđanog šećera primenom masene spektrometrije za merenje izotopskih odnosa (IRMS - Isotope Ratio Mass Spectrometry);

20) relativnog odnosa stabilnih izotopa kiseonika (18O/16O) u vodi vina i vodi šire primenom izotopske masene spektrometrije (IRMS);

21) sadržaja hlorida;

22) sadržaja sulfata;

23) sadržaja vinske kiseline;

24) sadržaja mlečne kiseline;

25) sadržaja L-jabučne kiseline;

26) sadržaja D-jabučne kiseline;

27) sadržaja ukupne jabučne kiseline;

28) sadržaja sorbinske kiseline;

29) sadržaja L-askorbinske kiseline;

30) sadržaja natrijuma;

31) sadržaja kalijuma;

32) sadržaja magnezijuma;

33) sadržaja kalcijuma;

34) sadržaja gvožđa;

35) sadržaja bakra;

36) sadržaja kadmijuma;

37) sadržaja srebra;

38) sadržaja cinka;

39) sadržaja olova;

40) sadržaja fluorida;

41) sadržaja derivata cijanida;

42) hromatskih osobina;

43) Folin-Ciocalteu indeksa;

44) sadržaja diglukozid malvidola;

45) sadržaja bromida;

46) sadržaja bora;

47) sadržaja ukupnog fosfora kao P2O5;

48) sadržaja glicerina;

49) sadržaja veštačkih boja;

50) sadržaja arsena;

51) sadržaja fluora;

52) sadržaja metanola;

53) senzornih osobina;

54) mikrobioloških analiza.

Pored parametara iz stava 1. ovog člana, kvalitet drugih proizvoda, i to: rektifikovane koncentrovane šire koji se utvrđuje specijalnim i posebnim metodama utvrđuje se i na osnovu vrednosti sledećih parametara:

1) alil izocijanata;

2) sadržaja ukupnih katjona;

3) provodljivosti;

4) sadržaja hidroksimetil furfurala;

5) sadržaja teških metala;

6) hemijskog određivanja etanola;

7) sadržaja mezo-inozitola, scilo-inozitola i saharoze.

Član 3

Metode za analizu i ispitivanje osnovnih parametara kvaliteta šire, vina i drugih proizvoda su određivanje:

1) gustine i relativne gustine na 20°C;

2) alkoholne jačine;

3) sadržaja ukupnog suvog ekstrakta;

4) sadržaja redukujućih šećera;

5) sadržaja pepela;

6) pH vrednosti;

7) ukupnih kiselina;

8) isparljivih kiselina;

9) neisparljivih kiselina;

10) sadržaja slobodnog i ukupnog sumpor dioksida;

11) limunske kiseline;

12) ugljen dioksida;

13) sadržaja šećera određenog refraktometrom.

Metode iz stava 1. ovog člana date su u Prilogu 1. - Metode analize kojima se ispituju osnovni parametri kvaliteta (u daljem tekstu: Prilog 1), koji je odštampan uz ovaj pravilnik i čini njegov sastavni deo.

Član 4

Pored metoda iz člana 3. ovog pravilnika, koriste se i metode koje su navedene u Tabeli 1 - Metode analize za ispitivanje parametara kvaliteta šire, vina i drugih proizvoda, kao i druge metode koje se sprovode po međunarodnim standardima prihvaćenim od strane Republike Srbije (rezolucije OIV-a - Organisation Internationale de Vigne et du Vin) i standardima i srodnim dokumentima priznatih i donetih od strane nacionalnog tela za standardizaciju u Republici Srbiji.

Tabela 1 - Metode analize za ispitivanje parametara kvaliteta šire, vina i drugih proizvoda

Redni Broj	Metoda određivanja	Referentni dokument
	1	2
1.	Određivanje sadržaja saharoze	OIV-MA-AS311-03
2.	Određivanje sadržaja glukoze i fruktoze	1) OIV-MA-AS311-02 2) OIV-MA-AS311-03 3) OIV-MA-AS311-07 4) OIV-MA-AS311-08
3.	Određivanje alkaliteta pepela	OIV-MA-AS2-05
4.	Određivanje doslađivanja i/ili razblaživanja grožđanog kljuka, grožđane šire i vina
4.1.	Određivanje relativnog odnosa neizmenljivih atoma deuterijuma i vodonika u etanolu primenom instrumentalne tehnike TC/EA - IRMS	SRPS TS E.M8.031:2023
4.2.	Određivanje distribucije deuterijuma u etanolu dobijenog fermentacijom grožđane šire, koncentrovane grožđane šire, grožđanog šećera (rektifikovane grožđane šire) i vina primenom nuklearne magnetne rezonancije (SNIF-NMR/RMN-FINS)	OIV-MA-AS311-05
4.3.	Određivanje relativnog odnosa stabilnih izotopa ugljenika (13C/12C) u vinskom etanolu ili etanolu dobijenom fermentacijom grožđane šire, koncentrovane šire ili grožđanog šećera primenom masene spektrometrije za merenje izotopskih odnosa (IRMS)	OIV-MA-AS312-06
4.4.	Određivanje relativnog odnosa stabilnih izotopa kiseonika (18O/16O) u vodi vina i vodi šire primenom izotopske masene spektrometrije (IRMS - Isotope Ratio Mass Spectrometry)	OIV-MA-AS2-12
5.	Određivanje sadržaja hlorida	1) OIV-MA-SA321-02 2) Wein Analytik Rudi Franck, Junge Ch. Charlheymanns verlag KG, 1977 (*)
6.	Određivanje sadržaja sulfata	1) OIV-MA-AS321-05A 2) Wein Analytik Rudi Franck, Junge Ch. Charlheymanns verlag KG, 1977 (*) 3) Tanner H. Brunner H.R.: Getränke analytik, Verlag Heller Chemie - und Verwaltungsesellschaft mbH. D-7170 Schwäbisch Hall (*)
7.	Određivanje sadržaja vinske kiseline	1) OIV-MA-AS313-05A 2) Rebelein, H. Dtsch. Lebensmittel-Rdsch 63 (1967) 3) Wein Analytik Rudi Franck, Junge Ch. Charlheymanns verlag KG, 1977 (kolorimetrijski)
8.	Određivanje sadržaja mlečne kiseline	1) OIV-MA-AS313-07 2) Wein Analytik Rudi Franck, Junge Ch. Charlheymanns verlag KG, 1977 (kolorimetrijski)
9.	Određivanje sadržaja L-jabučne kiseline	OIV-MA-AS313-11
10.	Određivanje sadržaja D-jabučne kiseline	OIV-MA-AS313-12ª OIV-MA-AS313-12B
11.	Određivanje sadržaja ukupne jabučne kiseline	1) OIV-MA-AS313-10 2) Wein Analytik Rudi Franck, Junge Ch. Charlheymanns verlag KG, 1977 (kolorimetrijski)
12.	Određivanje limunske kiseline	1) OIV-MA-AS313-08 2) Časopis Jugoslovensko vinogradarstvo i vinarstvo 2 - 3 1986 (*)
13.	Određivanje sadržaja sorbinske kiseline	1) OIV-MA-AS313-14A 2) OIV-MA-AS313-14B 3) OIV-MA-AS313-14C 4) OIV-MA-AS313-18
14.	Određivanje sadržaja L-askorbinske kiseline	OIV-MA-AS313-22
15.	Određivanje sadržaja natrijuma	1) OIV-MA-AS322-03A 2) OIV-MA-AS322-03B 3) OIV-MA-AS323-07
16.	Određivanje sadržaja kalijuma	1) OIV-MA-AS322-02A 2) OIV-MA-AS322-02B 3) OIV-MA-AS323-07 4) Wein Analytik Rudi Franck, Junge Ch. Charlheymanns verlag KG, 1977 (*) 5) Tanner H. Brunner H.R.: Getränke analytik, Verlag Heller Chemie - und Verwaltungsesellschaft mbH. D-7170 Schwäbisch Hall (*)
17.	Određivanje sadržaja magnezijuma	1) OIV-MA-AS322-07 2) OIV-MA-AS323-07 3) Wein Analytik Rudi Franck, Junge Ch. Charlheymanns verlag KG, 1977
18.	Određivanje sadržaja kalcijuma	1) OIV-MA-AS322-04 2) OIV-MA-AS323-07 3) Wein Analytik Rudi Franck, Junge Ch. Charlheymanns verlag KG, 1977
19.	Određivanje sadržaja gvožđa	1) OIV-MA-AS322-05A 2) OIV-MA-AS322-05B 3) OIV-MA-AS323-07 4) Wein Analytik Rudi Franck, Junge Ch. Charlheymanns verlag KG, 1977 (*)
20.	Određivanje sadržaja bakra	1) OIV-MA-AS322-06 2) OIV-MA-AS323-07
21.	Određivanje sadržaja kadmijuma	1) OIV-MA-AS322-10 2) OIV-MA-AS323-07
22.	Određivanje sadržaja srebra	1) OIV-MA-AS322-09 2) OIV-MA-AS323-07
23.	Određivanje sadržaja cinka	1) OIV-MA-AS322-08 2) OIV-MA-AS323-07
24.	Određivanje sadržaja olova	OIV-MA-AS322-12
25.	Određivanje sadržaja fluorida	OIV-MA-AS321-03
26.	Određivanje sadržaja derivata cijanida	OIV-MA-AS315-06
27.	Određivanje hromatskih osobina	1) OIV-MA-AS2-07B 2) OIV-MA-AS2-11
28.	Folin-Ciocalteu indeks	OIV-MA-AS2-10
29.	Određivanje sadržaja diglukozid malvidola	OIV-MA-AS315-03
30.	Određivanje sadržaja ukupnih bromida	OIV-MA-AS321-01
31.	Određivanje sadržaja bora	OIV-MA-AS323-03
32.	Određivanje sadržaja ukupnog fosfora kao P2O5	1) OIV-MA-AS321-04 2) Tanner H. Brunner H.R.: Getränke analytik, Verlag Heller Chemie - und Verwaltungsesellschaft mbH. D-7170 Schwäbisch Hall (*)
33.	Određivanje sadržaja glicerina	1) OIV-MA-AS312-04 2) OIV-MA-AS312-05
34.	Određivanje sadržaja veštačkih boja	OIV-MA-AS315-08
35.	Određivanje sadržaja arsena	1) OIV-MA-AS323-01A 2) OIV-MA-AS323-01B
36.	Određivanje sadržaja fluora	OIV-MA-AS321-03
37.	Određivanje sadržaja metanola	1) OIV-MA-AS312-03A 2) OIV-MA-AS312-03B 3) Wein Analytik Rudi Franck, Junge Ch. Charlheymanns verlag KG, 1977 (*)
38.	Senzorno ocenjivanje vina
38.1.	Metoda pozitivnih bodova do 100	Prilog 1, glava XIV
39.	Mikrobiološke analize šire, vina i drugih proizvoda
39.1.	Detekcija, diferencijacija i brojanje mikroorganizama	OIV-MA-AS4-01
40.	Specijalne i posebne metode analize rektifikovane koncentrovane šire
40.1.	Određivanje sadržaja alil izotiocijanata	(**)
40.2.	Određivanje sadržaja ukupnih katjona	(**)
40.3.	Određivanje provodljivosti	(**)
40.4.	Određivanje sadržaja hidroksimetil furfurala	(**)
40.5.	Određivanje sadržaja teških metala	(**)
40.6.	Određivanje sadržaja etanola	(**)
40.7.	Određivanje sadržaja mezo-inozitola, scilo-inozitola i saharoze	(**)

Referentni dokument označen jednom zvezdicom (*) dat je u Prilogu 2. - Druge metode analize, koji je odštampan uz ovaj pravilnik i čini njegov sastavni deo, a referentni dokument označen sa dve zvezdice (**) dat je u Prilogu 3. - Specijalne i posebne metode analize rektifikovane koncentrovane šire, koji je odštampan uz ovaj pravilnik i čini njegov sastavni deo.

Član 5

Ovaj pravilnik stupa na snagu osmog dana od dana objavljivanja u "Službenom glasniku Republike Srbije", a primenjuje se od 1. januara 2015. godine.

 

Samostalni član Pravilnika o izmeni
Pravilnika o parametrima i metodama za analizu i utvrđivanje kvaliteta šire, vina i drugih proizvoda od grožđa, šire, kljuka i vina koji se koriste u proizvodnji vina

("Sl. glasnik RS", br. 72/2023)

Član 2

Ovaj pravilnik stupa na snagu osmog dana od dana objavljivanja u "Službenom glasniku Republike Srbije".

 

 

Prilog 1

METODE ANALIZE KOJIMA SE ISPITUJU OSNOVNI PARAMETRI KVALITETA

 

I. ODREĐIVANJE GUSTINE I RELATIVNE GUSTINE NA 20°C

Gustina je masa vina ili šire po jedinici zapremine na temperaturi od 20°C. Izražena je u gramima po mililitru i označena simbolom P20°C.

Relativna gustina na 20°C/20°C (ili specifična težina pri 20°C) je odnos gustine neke određene zapremine vina ili šire na 20°C prema gustini iste zapremine vode na istoj temperaturi i označava se simbolom d 20/20.

Gustina i relativna gustina na 20°C mere se na eksperimentalnom uzorku korišćenjem referentne metode (piknometrija) ili uobičajne metode (hidrometrija ili denzimetrija upotrebom hidrostatičke vage). Za vrlo precizno merenje potrebna je korekcija gustine zbog sadržaja sumpor dioksida, a prema formuli:

ρ20°C = ρ'20°C - 0,0006 × S

gde je:

ρ20°C - korigovana gustina

ρ'20°C - ispitana gustina

S - količina sumpor dioksida u gramima po litru.

Ako vino (ili šira) sadrži značajne količine ugljen dioksida, sprovodi se prethodna priprema uzorka tako što se glavni deo ugljen dioksida ukloni mućkanjem 250 ml vina u boci od 1000 ml ili filtriranjem pod smanjenim pritiskom kroz 2 g vate smeštene u produženoj cevčici.

1.1. Referentna metoda

a) Aparatura

Uobičajena laboratorijska oprema, a posebno:

- piknometar od Pireks stakla, zapremine oko 100 ml sa odvojivim brušenim termometrom, kalibrisanim na desetinke stepeni od 10 do 30°C (slika 1: Piknometar i njegova tara posuda).

Slika 1: Piknometar i njegova tara posuda

Termometar mora biti standardizovan. Piknometar ima bočnu cevčicu dužine 25 mm, unutrašnjeg prečnika od 1 mm (maksimalno), koja završava konusnim brušenim spojem. Ova bočna cevčica može se zatvoriti zatvaračem koji se sastoji od cevčice sa brušenim konusnim spojem i završava se rezervoarom. Ovaj zatvarač služi kao ekspanziona komora. Ova dva brušena spoja treba pripremati s velikom pažnjom;

- tara posuda koja se sastoji od piknometra iste spoljne zapremine (razlika u zapreminama može biti najviše 1 ml) kao piknometar, a masom je jednaka masi piknometra ispunjenog tečnošću sa specifičnom težinom 1,01 (2,0% (m/v) rastvor natrijum hlorida);

- termički izolovana posuda koja tačno odgovara obliku piknometra;

- vaga sa dva tasa (twin-pan) s rasponom od najmanje 300 g i osetljivosti od 0,1 mg ili vaga s jednim tasom (single-pan) s rasponom od najmanje 200 g i osetljivosti od 0,1 mg.

b) Kalibracija piknometra

Kalibracija piknometra uključuje određivanje sledećih vrednosti:

- masu praznog piknometra;

- zapreminu piknometra na 20°C;

- masu piknometra napunjenog vodom na 20°C.

1) Metode za upotrebu vage s dva tasa (twin-pan):

Postaviti tara posudu na levi tas vage, a čist i suv piknometar, opremljen zatvaračem rezervoara, na desni tas vage. Dodati tegove na tas na kome je piknometar i zabeležiti masu potrebnu da se uspostavi ravnoteža: neka ta masa bude p grama.

Piknometar pažljivo napuniti destilovanom vodom na sobnoj temperaturi i ubaciti termometar. Pažljivo obrisati piknometar i staviti ga u termički izolovanu posudu. Mešati okretanjem posude dok temperatura očitana na termometru ne postigne konstantnu vrednost. Poravnati nivo vode na vrhu bočne cevčice, brisanjem je osušiti i zatvoriti zatvaračem. Pažljivo očitati temperaturu t°C, ako je potrebno korigovati s obzirom na tačnost skale termometra. Izmeriti vodom napunjeni piknometar u odnosu na tara posudu i zabeležiti masu p' u gramima potrebnu da se uspostavi ravnoteža.

Izračunavanje:

- Tariranje praznog piknometra:

masa praznog piknometra = p + m,

gde je m masa vazduha u piknometru: m = 0,0012 (p - p').

- Zapremina na 20°C:

V20°C = (p + m - p') x Ft

gde je: Ft faktor (tabela 1. ovog priloga) za temperaturu t°C.

V20°C mora biti određen sa tačnošću od +/- 0,001 ml.

- Masa vode na 20°C:

M20°C = 0,998203 x V20°C

gde je: 0,998203 gustina vode na 20°C.

2) Metode za upotrebu vage sa jednim tasom (single-pan)

Odrediti:

- masu čistog i suvog piknometra: P;

- masu piknometra, napunjenog vodom na t°C (kao što je to opisano u odeljku 1.1. pododeljak b) tačka 1) ove glave): P1;

- masu tara posude: T0.

Izračunavanje:

- Tariranje praznog piknometra:

masa praznog piknometra = P - m,

gde je m masa vazduha u piknometru: m = 0,0012 × (P1 - P).

- Zapremina na 20°C:

V20°C = [(P1 - (P - m)] × Ft,

gde je Ft faktor (tabela 1. ovog priloga) za temperaturu t°C; zapremina na 20°C mora biti određena sa tačnošću od +/- 0,001 ml.

- Masa vode na 20°C:

M20°C = 0,998203 x V20°C

gde je 0,998203 gustina vode na 20°C.

v) Metode merenja

1) Metoda sa upotrebom vage sa dva tasa (twin-pan):

Napuniti piknometar sa pripremljenim uzorkom sledeći postupak opisan u odeljku 1.1. pododeljak b) tačka 1) ove glave.

Masa tečnosti u piknometru = p+ m - p'';

p'' = masa (u gramima) potrebna da se uspostavi ravnoteža na temperaturi od t°C.

Gustina na temperaturi t°C je:

ρt°c = (p + m - p'')/V20ºC

Za izračunavanje gustine na 20°C koristiti tabele za korekciju temperature, u skladu sa vrstom merenog uzorka: za suvo vino (tabela 2. ovog priloga), za prirodnu ili koncentrovanu širu (tabela 3. ovog priloga), za slatko vino (tabela 4. ovog priloga).

Relativnu gustinu vina ili šire izračunavati:

d20/20 = ρv / ρH2O = ρ20 / 0,998203

gde je ρ20 gustina vina na 20°C (korigovana za slobodni i ukupni sumpor dioksid) u gramima po litru i 0,998203 je gustina vode na 20°C u gramima po litru.

2) Metoda sa upotrebom vage sa jednim tasom (single-pan)

Izmeriti tara posudu; masu označiti sa T1, izračunati: dT = T1 - T0; masa praznog piknometra u vreme merenja = P - m + dT, izmeriti piknometar napunjen pripremljenim uzorkom kao što je to opisano u ovoj glavi; njegovu masu na t°C označiti sa P2.

Masa tečnosti u piknometru na t°C = P2 - (P - m + dT), gustina na t°C:

ρt°c = P2 - (P - m + dT)/V20ºC

Izračunati gustinu ispitivane tečnosti na 20°C (suvo vino, prirodna ili koncentrovana šira, slatko vino) kako je opisano u odeljku 1.1. pododeljak v) tačka 1) ove glave.

Relativnu gustinu uzorka izračunati tako što njegovu gustinu na 20°C treba podeliti sa 0,998203.

3) Ponovljivost merenja gustine (r):

- za suva i polusuva vina: r = 0,00010,

- za slatka vina: r = 0,00018.

4) Reproduktivnost merenja gustine (R):

- za suva i polusuva vina: R = 0,00037,

- za slatka vina: R = 0,00045.

1.2. Uobičajene metode

1.2.1. Hidrometrija

a) Aparatura

- hidrometar:

Hidrometri svojim dimenzijama i podelom skale moraju odgovarati ISO standardima. Oni moraju imati cilindričnu kuglu i cevčicu prečnika najmanje 3 mm. Za suva vina moraju imati skalu od 0,983 do 1,003 sa podelom od 0,0010 i 0,0002. Svaka oznaka od 0,0010 mora biti razdvojena od sledeće oznake za najmanje 5 mm. Za merenje gustine bezalkoholnih vina, slatkih vina i šira mora se koristiti niz od pet hidrometara sa skalom od 1,000 do 1,030; od 1,030 do 1,060; od 1,060 do 1,090; od 1,090 do 1,120; od 1,120 do 1,150. Ovi hidrometri moraju biti graduisani za gustine na 20°C sa podelom za najmanje svakih 0,0010 i 0,0005, a svaka oznaka 0,0010 mora biti odvojena od sledeće takve oznake najmanje 3 mm.

Hidrometri moraju biti graduisani tako da se mogu očitati "na vrhu meniskusa". Označavanje gustine ili relativne gustine na 20°C i očitavanje "na vrhu meniskusa" mora se vršiti na graduisanoj skali ili na listu papira umetnutom u staklenu kuglu. Kalibrisanje hidrometara mora vršiti nadležan organ za mere i dragocene metale;

- termometar koji ima skalu sa minimalnom podelom od 0,5°C;

- merni cilindar s unutrašnjim prečnikom od 36 mm i visinom od 320 mm, koji stoji uspravno pomoću zavrtnja za nivelaciju.

b) Postupak

- Metoda merenja:

Sipati 250 ml pripremljenog uzorka u merni cilindar (navedeno u odeljku 1.2.1. pododeljak a) alineja treća ove glave) i u njega uroniti termometar i hidrometar. Uzorak dobro promešati, sačekati jedan minut radi izjednačavanja temperature i potom očitati temperaturu. Izvaditi termometar i posle još jednog minuta na skali hidrometra očitati gustinu na t°C.

Korigovati gustinu određenu pri t°C na 20°C korišćenjem pripadajućih tabela: za suva vina (tabela 5. ovog priloga), za širu (tabela 6. ovog priloga), za slatka vina (tabela 7. ovog priloga).

Relativnu gustinu vina ili šire izračunati tako što se podeli određena gustina pripremljenog uzorka na 20°C sa 0,998203.

1.2.2. Denzimetrija upotrebom hidrostatičke vage

a) Aparatura

- Hidrostatička vaga sa maksimalnim kapacitetom od najmanje 100 g i osetljivosti 0,1 mg;

- dva identična plovka od Pireks-stakla, zapremine od najmanje 20 ml pričvršćena ispod svakog tasa pomoću niti prečnika ne većeg od 0,1 mm;

- plovak obešen pod desnim tasom mora biti takav da se može umetnuti u merni cilindar koji nosi oznaku nivoa. Merni cilindar mora imati unutrašnji prečnik najmanje 6 mm širi od prečnika plovka. Plovak mora biti takav da se može potpuno uroniti u zapreminu mernog cilindra ispod oznake. Uranjanje u površinu tečnosti koja se meri sme se obaviti samo pomoću niti. Temperatura tečnosti u mernom cilindru meri se termometrom sa podelom skale od 0,2°C;

- može se koristiti i jednostrana vaga.

b) Postupak

- Kalibrisanje hidrostatičke vage:

Sa oba plovka u vazduhu, uspostaviti ravnotežu stavljajući tegove na desni tas. Označiti masu dodatih tegova p. Napuniti merni cilindar čistom vodom do oznake, promućkati i pročitati temperaturu t°C posle dva ili tri minuta. Ponovo uspostaviti ravnotežu stavljajući tegove na desni tas: masu dodatih tegova označiti sa p'.

Zapremina plovka na 20°C prikazana je formulom:

V20°C = (p' - p) (F + 0,012);

gde je:

F faktor za temperaturu t°C (tabela 1. ovog priloga), a p i V20°C su karakteristike plovka.

- Metoda merenja:

Desni plovak uroniti u odmerni cilindar ispunjen vinom (ili širom) do oznake. Očitati temperaturu t°C vina (ili šire) i masu tegova potrebnih da se uspostavi ravnoteža i označiti sa p''.

Gustina ρt°C se dobija iz formule:

ρtºC = [(p'‚ - p)/V] + 0,0012

Ako je plovak od Pireks-stakla ova se gustina koriguje na 20°C korišćenjem tabela 2, 3. ili 4. ovog priloga.

Tabela 1. Faktor F sa kojim se množi masa vode na temperaturi °C za preračunavanje zapremine piknometra na temperaturu od 20°C

Tabela 2. Temperaturne korekcije za gustinu suvih i bezalkoholnih vina, merene Pireks piknometrom na t°C, za proračun rezultata na 20°C
ρ20 = ρt ± c/1000
"+" ako je t°C veća od 20°C
"-" ako je t°C manja od 20°C

Napomene:

- Alkoholna jačina izražena je u % vol;

- ova tabela se može koristiti za prevođenje dt/20 u d20/20.

Tabela 3. Temperaturne korekcije za gustinu prirodne ili koncentrovane šire, merene Pireks piknometrom na t°C, za proračun rezultata na 20°C
ρ20 = ρt ± c/1000
"+" ako je t°C veća od 20°C
"-" ako je t°C manja od 20°C

Napomene:

- Gustina je izražena u g/ml;

- ova tabela se može koristiti za prevođenje dt/20 u d20/20.

Tabela 4. Temperaturne korekcije za gustinu vina alkoholne jačine 13% vol i veće, sa ostatkom šećera, merene Pireks piknometrom na t°C, za proračun rezultata na 20°C
ρ20 = ρt ± c/1000
"+" ako je t°C veća od 20°C
"-" ako je t°C manja od 20°C

Napomena:

- Gustina vina izražena je u g/ml.

Tabela 5. Temperaturne korekcije za gustinu suvih i bezalkoholnih vina merene običnim staklenim piknometrom ili hidrometrom na t°C, za proračun rezultata na 20°C
ρ20 = ρt ± c/1000
"+" ako je t°C veća od 20°C
"-" ako je t°C manja od 20°C

Napomene:

- Alkoholna jačina izražena je u % vol;

- ova tabela se može koristiti za prevođenje dt/20 u d20/20.

Tabela 6. Temperaturne korekcije za gustinu prirodne ili koncentrovane šire, merene običnim staklenim piknometrom ili hidrometrom na t°C, za proračun rezultata na 20°C
ρ20 = ρt ± c/1000
"+" ako je t°C veća od 20°C
"-" ako je t°C manja od 20°C

Napomene:

- Gustina je izražena u g/ml;

- ova tabela se može koristiti za prevođenje dt/20 u a d20/20.

Tabela 7. Temperaturne korekcije za gustinu vina alkoholne jačine 13% vol i veće, sa ostatkom šećera, merene običnim staklenim piknometrom ili hidrometrom na t°C, za preračun rezultata na 20°C
ρ20 = ρt ± c/1000
"+" ako je t°C veća od 20°C
"-" ako je t°C manja od 20°C

Napomena:

Gustina je izražena u g/ml.

Napomena:

Gustina je izražena u g/ml.

 

II. ODREĐIVANJE ALKOHOLNE JAČINE

Alkoholna jačina izražena zapreminom predstavlja broj litara etanola sadržanog u 100 litara vina, pri čemu su obe zapremine merene na temperaturi od 20°C, a izražava se simbolom "% vol".

Napomena: homolozi etanola, zajedno sa etanolom i homolozima estara etanola, uključeni su u alkoholnu jačinu, jer su prisutni u destilatu.

Principi metoda:

2.1. Metoda za dobijanje destilata: destilacija vina kojem je dodata suspenzija kalcijum hidroksida. Merenje alkoholne jačine destilata.

2.2. Referentna metoda: merenje gustine destilata piknometrom.

2.3. Uobičajene metode:

2.3.1. merenje alkoholne jačine destilata hidrometrom,

2.3.2. merenje alkoholne jačine destilata denzimetrijski upotrebom hidrostatičke vage,

2.3.3. merenje alkoholne jačine destilata refraktometrijski.

Napomena: za izračunavanje alkoholne jačine iz gustine destilata treba koristiti tabele 8, 9. i 10. ovog priloga.

Tabela 8. ovog priloga sadrži opštu formulu koja povezuje alkoholnu jačinu izraženu zapreminom i gustinu smeše alkohol-voda kao funkciju temperature.

2.1. Metoda za dobijanje destilata

a) Aparatura

- Uređaj za destilaciju koji se sastoji od: boce od 1 litra, sa okruglim dnom i spojevima od brušenog stakla; kolone za rektifikaciju od oko 20 cm visine ili bilo kog sličnog hladnjaka; izvora toplote (piroliza ekstrakta mora se sprečiti odgovarajućim postupkom); hladnjaka koji se završava izvučenom cevčicom koja vodi destilat do dna odmerne tikvice koja sadrži nekoliko mililitara vode;

- aparat za destilaciju vodenom parom koji se sastoji od: generatora pare; cevi za paru; kolone za rektifikaciju i hladnjaka.

Može se koristiti bilo koji tip destilacije ili destilacija vodenom parom pod uslovom da zadovoljava sledeći test:

Destilovati smešu etanol-voda alkoholne jačine 10% vol pet puta za redom. Destilat mora imati alkoholnu jačinu od najmanje 9,9% vol posle pete destilacije, tj. gubitak alkohola za vreme svake pojedine destilacije ne sme biti veći od 0,02% vol.

b) Reagensi

Suspenzija kalcijum hidroksida 2 M, koja se dobije tako što se pažljivo ulije jedan litar vode temperature od 60°C do 70°C na 120 g živog (negašenog) kreča (CaO).

v) Priprema uzorka

Kod mladih i penušavih vina uklonimo najveći deo ugljen dioksida mešajući 250 do 300 ml vina u tikvici od 500 ml.

g) Postupak

U odmernu tikvicu od 200 ml uliti vino do crte i zabeležiti temperaturu. Vino preliti u destilacionu tikvicu i staviti cev za paru. Odmernu tikvicu od 200 ml isprati četiri puta sa po 5 ml vode i te zapremine preliti u destilacionu tikvicu. Dodati 10 ml kalcijum hidroksida iz odeljka 2.1. pododeljak b) ove glave i nekoliko kuglica za ključanje. Sakupljati destilat u odmernu tikvicu od 200 ml ranije upotrebljenu za merenje zapremine vina. Destilisati do otprilike 3/4 početne zapremine ako se radi destilacijom ili zapremine od 198 do 199 ml destilata ako je primenjena destilacija vodenom parom. Dopuniti do 200 ml destilovanom vodom, održavajući destilat na temperaturi koja se najviše za 2°C razlikuje od početne temperature. Mešati sa velikom pažnjom kružnim pokretima.

Napomena: u slučaju vina koja sadrže velike koncentracije amonijumovih jona, destilat se može destilovati ponovo na način opisan u odeljku 2.1. pododeljak g) ove glave, ali tako da se suspenzija kalcijum hidroksida zameni sa 1 ml razblažene sumporne kiseline 10:100.

2.2. Referentna metoda

Alkoholnu jačinu destilata meriti piknometrom.

a) Aparatura

- Koristiti piknometar koji je opisan u glavi I. odeljak 1.1. pododeljak a) alineja prva ovog priloga.

b) Postupak

Izmeriti gustinu destilata (odeljak 2.1. pododeljak g) ove glave) na t°C kako je opisano u glavi I. odeljak 1.1. pododeljak v) ovog priloga. Ovu gustinu označiti kao ρt°C.

v) Iskazivanje rezultata

1) Izračunavanje:

Odrediti alkoholnu jačinu na 20°C korišćenjem tabele 8. ovog priloga. U vodoravnoj koloni ove tabele koja odgovara temperaturi T (izraženoj celim brojem) neposredno ispod t°C, pronaći najmanju gustinu koja je veća od ρt°C. Tabelarnu razliku ispod ove gustine upotrebiti za proračun gustine ρ na temperaturi T.

U liniji temperature T naći gustinu ρ neposredno iznad ρ' pa izračunati razliku između gustina ρ i ρ'. Ovu razliku deliti sa tabelarnom razlikom koja se nalazi desno od ρ'. Koeficijent daje decimalni deo alkoholne jačine, dok se njeni celi brojevi nalaze na vrhu kolone u kojoj se nalazi gustina ρ'.

Napomena: Ova korekcija temperature inkorporirana je u jedan kompjuterski program pa postoji mogućnost da se izvede automatski.

2) Ponovljivost, (r): r = 0,10% vol.

3) Reproduktivnost, (R): R = 0,19% vol.

2.3. Uobičajene metode

2.3.1. Hidrometrija

a) Aparatura

- Alkoholometar,

- Termometar sa podelom od 0,1°C, od 0°C do 40°C sa tačnošću do 1/20 stepeni (0,05°C),

- Merni cilindar prečnika 36 mm i visine 320 mm, koji se drži uspravno pomoću zavrtnja za nivelaciju.

b) Postupak

Destilat (odeljak 2.1. pododeljak g) ove glave) se ulije u merni cilindar. Cilindar se drži uspravno. Ubaci se termometar i alkoholometar. Očita se temperatura na termometru nakon jednominutnog mešanja radi uravnoteženja temperature u mernom cilindru, termometra, alkoholometra i destilata. Izvuče se termometar i očita se jačina alkohola posle jednog minuta. Očitavanje se obavlja najmanje tri puta. Alkoholnu jačinu očitanu pri temperaturi t°C korigujemo za učinak temperature pomoću tabele 9. ovog priloga. Temperatura tečnosti mora se vrlo malo razlikovati od sobne temperature (najviše 5°C).

2.3.2. Denzimetrija upotrebom hidrostatičke vage

a) Aparatura

- Koristiti hidrostatičku vagu opisanu u glavi I. odeljak 1.2.2. pododeljak a) ovog priloga.

b) Postupak

Gustinu destilata na t°C meriti kako je opisano u glavi I. odeljak 1.2.2. pododeljak b) ovog priloga.

v) Iskazivanje rezultata

Odrediti alkoholnu jačinu na 20°C sledeći metodu opisanu u odeljku 2.2. pododeljak v) tačka 1) ove glave i korišćenjem tabele 8. ovog priloga, ako je plovak od Pireks-stakla ili korišćenjem tabele 10. ovog priloga, ako je plovak od običnog stakla.

2.3.3. Refraktometrija

a) Aparatura

Refraktometar koji omogućuje merenje indeksa refrakcije u rasponu od 1,330 do 1,346. U zavisnosti od tipa opreme, merenja se izvode:

- ili na 20°C sa pogodnim instrumentom;

- ili na sobnoj temperaturi t°C korišćenjem instrumenta opremljenog termometrom koji omogućava merenje temperature sa tačnošću od 0,05°C. Tabela za korekciju temperature treba biti pridružena takvom instrumentu.

b) Postupak

Indeks refrakcije destilata, koji je dobijen kao što je to opisano u odeljku 2.1. pododeljak g) ove glave, meri se sledeći uputstva priložena uz instrument.

v) Iskazivanje rezultata

Alkoholna jačina koja odgovara indeksu refrakcije očitanom na 20°C očitava se iz tabele 11. ovog priloga.

Napomena: Tabela 11. ovog priloga, daje alkoholne jačine koje odgovaraju indeksima refrakcije za smeše alkohol-voda i za destilate. U slučaju destilata, moramo uzeti u obzir prisutne nečistoće u destilatu (uglavnom više alkohole). Prisustvo metanola snižava indeks refrakcije pa time i alkoholnu jačinu.

Tabela 8. MEĐUNARODNA TABELA ZA ALKOHOLNU JAČINU NA 20°C

Tabela gustine smeše etanol-voda (Pireks piknometar)
Gustina na t°C korigovana za održavanje na vazduhu

Tabela 9. MEĐUNARODNA TABELA ZA ALKOHOLNU JAČINU NA 20°C
Tabela korekcionih faktora koji se koriste za korekciju alkoholne jačine za učinak temperature

Vrednosti koje se dobijaju ili oduzimaju od alkoholne jačine na t°C (obični stakleni alkoholometar) navedene su u tabeli ispod.

Napomena:

Alkoholna jačina izražena u % vol.

 

Tabela 10. MEĐUNARODNA TABELA ZA ALKOHOLNE JAČINE NA 20°C
Tabela gustina smeša etanol-voda (obična staklena aparatura)
Gustina pri t°C korigovana za održavanje u vazduhu

Tabela 11. Tabela indeksa refrakcije smeše etanol-voda i destilata na 20°C i odgovarajuća alkoholna jačina na 20°C

III. ODREĐIVANJE UKUPNOG SUVOG EKSTRAKTA

Ukupan suvi ekstrakt ili ukupna suva materija uključuje sve materije koje nisu isparljive pod specifičnim fizičkim uslovima. Ovi fizički uslovi moraju biti takvi da materije koje čine ekstrakt pretrpe što je moguće manje promene u toku ispitivanja.

Ekstrakt bez šećera je razlika između ukupnog suvog ekstrakta i ukupnih šećera.

Redukovani ekstrakt je razlika između ukupnog suvog ekstrakta i ukupnih šećera iznad 1 g/l, kalijum sulfata iznad 1 g/l, prisutnog manitola ili drugih hemijskih supstanci koje su možda bile dodate u vino.

Rezidualni ekstrakt je ekstrakt bez šećera i neisparljivih kiselina izražene kao vinska kiselina.

Ekstrakt se izražava u gramima po litru i treba biti određen unutar najbližih 0,5 g.

a) Princip metode

- Merenje sa denzimetrom.

b) Postupak

Ukupan suvi ekstrakt izračunava se indirektno iz relativne gustine šire, a za vino iz relativne gustine bezalkoholnog vina. Ovaj suvi ekstrakt predstavlja količinu saharoze koja, rastvorena u 1 litru vode daje rastvor iste relativne gustine kao šira ili bezalkoholno vino. Ova je količina prikazana u tabeli 12. ovog priloga.

v) Iskazivanje rezultata

- Izračunavanje:

Relativna gustina (20/20), dr, bezalkoholnog vina izračunava se pomoću formule:

dr = dv - da + 1,000

gde je:

dv = relativna gustina vina na 20°C (korigovana za isparljive kiseline);1

_________
1 Pre ovog proračuna potrebna je korekcija relativne gustine ili gustine vina na učinak isparljivih kiselina, a korišćenjem formule:

dv =	d	20°C	- 0,0000086 x a ili dv = d20 - 0,0000086 x a,
		20°C

gde je a - isparljive kiseline izražene u miliekvivalentima po litru.

da = relativna gustina smeše voda-alkohol iste alkoholne jačine kao i vino na 20°C.

Relativna gustina (20/20), dr, se lako može izračunati iz gustine na 20°C gustine vina dv i gustine da smeše voda-alkohol iste alkoholne jačine kao i vino, a prema formuli:

dr = 1,0018 (dv - da) + 1,000,

gde se koeficijent 1,0018 približava 1, kad je dv ispod 1,05, što je najčešće i slučaj.

Za proračun ukupnog suvog ekstrakta u g/l trebalo bi koristiti tabelu 12. ovog priloga, u kojoj je ukupni suvi ekstrakt u funkciji relativne gustine dr bezalkoholnog vina ili iz relativne gustine šire d20/20

Ukupan suvi ekstrakt izražava se u g/l sa jednim decimalnim mestom.

 

Tabela 12. Tabela za preračun koncentracije ukupnog suvog ekstrakta (g/l)

Interpolacijska tabela:

 

IV. ODREĐIVANJE REDUKUJUĆIH ŠEĆERA

Redukujući šećeri su svi šećeri, koji imaju keto ili aldehidne funkcionalne grupe. Njihovo određivanje vezano je za redukciju alkalnog rastvora bakar (II) soli.

Princip metode

4.1. Prečišćavanje vina:

4.1.1. Referentna metoda: posle neutralizacije i uklanjanja alkohola, vino se propušta kroz kolonu za izmenu jona u kojoj se njegovi anjoni zamenjuju jonima acetata nakon čega sledi prečišćavanje neutralnim olovo acetatom.

4.1.2. Uobičajene metode: vino prečišćavati jednim od sledećih reagensa:

4.1.2.1. neutralni olovo acetat;

4.1.2.2. cink 2-heksacijanoferat.

4.2. Određivanje šećera

Prečišćeno vino ili šira reaguje sa određenom količinom alkalnog rastvora bakar (II) soli, a višak jona bakra određuje se jodometrijski.

4.1. Prečišćavanje vina

Koncentracija redukujućih šećera u uzorku koji se analizira mora biti od 0,5 do 5 g/l. Suva vina ne razređivati tokom prečišćavanja, slatka vina se moraju razrediti u cilju postizanja količine šećera unutar okvira propisanih u sledećoj tabeli:

Opis uzorka u svrhu ove metode	Koncentracija šećera (g/l)	Relativna gustina	Razređenje (%)
šire i mistele	iznad 125	iznad 1,038	1
slatka vina	25 do 125	1,005 do 1,038	4
poluslatka vina	5 do 25	0,997 do 1,005	20
suva vina	ispod 5	ispod 0,997	bez razređenja

4.1.1. Referentna metoda

a) Reagensi

- 1 M rastvor hlorovodične kiseline, HCl;

- 1 M rastvor natrijum hidroksida, NaOH;

- 4 M rastvor sirćetne kiseline, CH3COOH;

- 2 M rastvor natrijum hidroksida, NaOH;

- smola anjonske izmene [Dowex 3 (20-50 mesh) ili ekvivalentne smole];

- neutralni rastvor olovo acetata (približno zasićen): neutralni olovo acetat [Pb(CH3COO)2 x 3 H2O]: 250g; vrlo vruća voda: do 500 ml; mešati, dok se potpuno ne otopi;

- kalcijum karbonat (CaCO3).

Priprema kolone za anjonsku izmenu:

Na dno birete staviti mali umetak staklene vune i dodati 15 ml anjonske smole (odeljak 4.1.1. pododeljak a) alineja peta ove glave). Pre upotrebe, smolu dva puta regenerisati tako što je naizmenično prelivati sa 1 M rastvorom hlorovodične kiseline (odeljak 4.1.1. pododeljak a) alineja prva ove glave) i 1 M rastvorom natrijuma hidroksida (odeljak 4.1.1. pododeljak a) alineja druga ove glave). Nakon ispiranja sa 50 ml destilovane vode, premestiti smolu u čašu, dodati 50 ml 4 M rastvora sirćetne kiseline (odeljak 4.1.1. pododeljak a) alineja treća ove glave) i mešati pet minuta. Ponovo napuniti biretu smolom i na nju doliti 100 ml 4 M rastvora sirćetne kiseline.

Napomena: poželjno je imati zalihu smole spremljenu u boci napunjenoj sa 4 M rastvorom sirćetne kiseline.

Kolonu ispirati destilovanom vodom dok eluat ne postane neutralan.

Regenerisanje smole:

U kolonu naliti 150 ml 2 M rastvora natrijum hidroksida (odeljak 4.1.1. pododeljak a) alineja četvrta ove glave) da se odstrani kiselina i većina pigmenata vezanih za smolu. Isprati sa 100 ml vode i na to naliti 100 ml 4 M rastvora sirćetne kiseline (odeljak 4.1.1. pododeljak a) alineja treća ove glave). Kolonu ispirati sa destilovanom vodom dok eluat ne postane neutralan.

b) Postupak

- Suva vina:

Sipati 50 ml vina u čašu prečnika od oko 10 do 12 cm, dodati 1/2 (n - 0,5) ml 1 M rastvora natrijum hidroksida (odeljak 4.1.1. pododeljak a) alineja druga ove glave), (n je zapremina 0,1 M rastvora natrijum hidroksida potrebnog za titraciju ukupnih kiselina u 10 ml vina), pa uparavati na vodenom kupatilu do oko 20 ml. Ovu tečnost propustiti kroz smolu anjonske izmene u obliku acetata (odeljak 4.1.1. pododeljak a) alineja peta ove glave) po 3 ml svaka dva minuta. Eluat sakupljati u tikvicu od 100 ml. Ispirati posudu i kolonu šest puta sa po 10 ml destilovane vode. Tokom mešanja, eluatu dodati 2,5 ml zasićenog rastvora olovo acetata (odeljak 4.1.1. pododeljak a) alineja šesta ove glave) i 0,5 g kalcijum karbonata (odeljak 4.1.1. pododeljak a) alineja sedma ove glave), nekoliko puta promućkati i pustiti da odstoji najmanje 15 minuta. Tikvicu dopuniti do oznake i filtrirati. 1 ml ovoga filtrata odgovara 0,5 ml vina.

- Šire, mistele, slatka i poluslatka vina:

Razređenja se prave prema uputstvima:

(1) Šire i mistele: pripremiti 10% rastvor uzorka i za analizu uzeti 10 ml razređenog uzorka;

(2) slatka vina, pojačana ili ne, relativne gustine između 1,005 i 1,038: pripremiti 20% rastvor uzorka i uzeti 20 ml razređenog uzorka;

(3) poluslatka vina relativne gustine na 20°C između 0,997 i 1,005: uzeti 20 ml nerazređenog vina.

Propuštati gore navedenu zapreminu vina ili šire kroz kolonu anjonske izmene u obliku acetata brzinom od 3 ml svaka dva minuta. Eluat sakupljati u tikvicu od 100 ml, kolonu ispirati vodom dok se ne dobije oko 90 ml eluata. Eluatu dodati 0,5 g kalcijum karbonata i 1 ml zasićenog rastvora olovo acetata. Promućkati, ostaviti da odstoji najmanje 15 minuta mešajući ga povremeno. Doliti vodu do oznake i filtrirati.

U slučajevima iz podtač. (1), (2) i (3) ovog pododeljka, razređenja odgovaraju sledećim količinama:

- 1 ml filtrata odgovara 0,01 ml šire ili mistele,

- 1 ml filtrata odgovara 0,04 ml slatkog vina,

- 1 ml filtrata odgovara 0,20 ml poluslatkog vina.

4.1.2. Uobičajene metode

4.1.2.1. Prečišćavanje sa neutralnim olovo acetatom

a) Reagensi

- Rastvor neutralnog olovo acetata, približno zasićenog (u odeljku 4.1.1. pododeljak a) alineja šesta ove glave);

- kalcijum karbonat.

b) Postupak

1) Suva vina:

50 ml vina uliti u odmernu tikvicu od 100 ml, dodati 1/2 (n - 0,5) ml 1 M rastvora natrijum hidroksida (u odeljku 4.1.1. pododeljak a) alineja druga ove glave); gde je n zapremina 0,1 M natrijum hidroksida upotrebljena za određivanje ukupnih kiselina u 10 ml vina. Uz mešanje dodati 2,5 ml zasićenog rastvora olovo acetata (u odeljku 4.1.1. pododeljak a) alineja šesta ove glave) i 0,5 g kalcijum karbonata (u odeljku 4.1.1. pododeljak a) alineja sedma ove glave). Sadržaj tikvice promućkati nekoliko puta i ostaviti da odstoji najmanje 15 minuta. Dopuniti do oznake vodom i filtrirati. 1 ml filtrata odgovara 0,5 ml vina.

2) Šire, mistele, slatka i poluslatka vina:

Razređenja se prave prema uputstvima:

(1) Šire i mistele: pripremiti 10% rastvor uzorka i za analizu uzeti 10 ml toga razređenog uzorka;

(2) slatka vina, pojačana ili ne, relativne gustine između 1,005 i 1,038: pripremiti 20% rastvor uzorka i uzeti 20 ml razređenog uzorka;

(3) poluslatka vina gustine između 0,997 i 1,005 na 20°C: uzeti 20 ml nerazređenog uzorka.

Dodati 0,5 g kalcijum karbonata, oko 60 ml vode i 0,5, 1 ili 2 ml zasićenog rastvora olovo acetata. Promešati i ostaviti da stoji najmanje 15 minuta, mešajući povremeno. Dopuniti vodom do oznake i filtrirati.

U slučajevima iz podtač. (1), (2) i (3) ove tačke razređenja odgovaraju sledećim količinama:

- 1 ml filtrata odgovara 0,01 ml šire ili mistele,

- 1 ml filtrata odgovara 0,04 ml slatka vina,

- 1 ml filtrata odgovara 0,20 ml poluslatka vina.

4.1.2.2. Prečišćavanje sa cink-2-heksacijanoferatom

Ovaj postupak koristiti samo za bela vina, svetla slatka vina i šire.

a) Reagensi

- Rastvor I: kalijum 2-heksacijanoferata:

Kalijum 2-heksacijanoferat [K4Fe(CN)6 x 3H2O], 150 g; dopunimo vodom do 1000 ml.

- Rastvor II: cink sulfata:

Cink sulfat, ZnSO4 x 7H2O, 300 g; dopunimo vodom do 1000 ml.

b) Postupak

U odmernu tikvicu od 100 ml uliti uzorak vina (ili šire ili mistele); razređenja su navedena prema sledećim uputstvima:

1) Šire i mistele: pripremiti 10% rastvor uzorka i za analizu uzeti 10 ml razređenog uzorka;

2) slatka vina, pojačana ili ne, relativne gustine između 1,005 i 1,038: pripremiti 20% rastvor uzorka i uzeti 20 ml razređenog uzorka;

3) poluslatka vina relativne gustine između 0,997 i 1,005: uzeti 20 ml nerazređenog uzorka;

4) suva vina: uzeti 50 ml nerazređenog uzorka.

Dodati 5 ml rastvora I, kalijum 2-heksacijanoferata (odeljak 4.1.2.2. pododeljak a) alineja prva ove glave) i 5 ml rastvora II, cink sulfata (odeljak 4.1.2.2. pododeljak a) alineja druga ove glave). Promešati, dopuniti vodom do oznake, ostaviti da stoji 10 minuta i filtrirati.

U slučajevima iz tač. 1), 2), 3) i 4) ovog pododeljka razređenja odgovaraju sledećim količinama:

- 1 ml filtrata odgovara 0,01 ml šire ili mistele;

- 1 ml filtrata odgovara 0,04 ml slatkog vina;

- 1 ml filtrata odgovara 0,20 ml poluslatkog vina;

- 1 ml filtrata odgovara 0,50 ml suvog vina.

4.2. Određivanje šećera

a) Reagensi

- Alkalni rastvor soli bakra:

bakar (II) sulfat, (CuSO4 x 5H2O): 25 g; limunska kiselina (C6H8O7 x H2O): 50 g; natrijum karbonat (Na2CO3 x 10H2O): 388 g; voda: do 1000 ml. Bakar (II) sulfat rastvoriti u 100 ml vode, limunsku kiselinu u 300 ml vode i natrijum karbonat u 300 do 400 ml vruće vode. Pomešati rastvore limunske kiseline i natrijum karbonata. Dodati im rastvor bakar (II) sulfata i dopuniti vodom do 1 litra;

- 30% rastvor kalijum jodida:

kalijum jodid (KI): 30g; voda: do 100 ml; rastvor čuvati u tamnoj boci;

- 25% rastvor sumporne kiseline:

koncentrovana sumporna kiselina (H2SO4), ρ20 = 1,84 g/ml: 25 g; voda: do 100 ml. Kiselinu polako dodavati u vodu, pričekati da se ohladi i dopuniti sa vodom do 100 ml;

- rastvor skroba, 5 g/l:

5 g skroba pomešati sa oko 500 ml vode. Uz stalno mešanje grejati do ključanja, ostaviti da vri 10 minuta. Dodati 200 g natrijum hlorida (NaCl), ohladiti i dopuniti vodom do 1 litre;

- 0,1 M rastvor natrijum tiosulfata;

- rastvor invertnog šećera, 5 g/l, (za proveru metode određivanja).

U odmernu tikvicu od 200 ml dodati: čistu suvu saharozu (C12H22O11): 4,75 g; vodu: približno 100 ml; koncentrovanu hlorovodoničnu kiselinu (HCl), ρ20 = od 1,16 do 1,19 g/ ml: 5 ml. Tikvicu grejati na vodenom kupatilu na 60°C dok temperatura rastvora ne dostigne 50°C; temperaturu održavati 15 minuta. Tikvicu hladiti na vazduhu 30 minuta i tada je uroniti u hladnu vodu. Rastvor preneti u odmernu tikvicu od 1 litra i dopuniti do oznake. Ovaj rastvor je postojan mesec dana. Kad se koristi, ispitivani uzorak (rastvor ima aproksimativno 0,06 M HCl) neutralisati rastvorom natrijum hidroksida.

b) Postupak

U tikvici od 300 ml pomešati 25 ml alkalnog rastvora soli bakra (odeljak 4.2. pododeljak a) alineja prva ove glave), 15 ml vode i 10 ml prečišćenog rastvora uzorka (odeljak 4.2. pododeljak a) alineja šesta ove glave). Ova zapremina rastvora ne sme sadržati više od 60 mg invertnog šećera. Dodati nekoliko kuglica za ključanje, na tikvicu namestiti povratni hladnjak i zagrejati do ključanja u roku od dva minuta. Neka mešavina ključa tačno 10 minuta. Ohladiti tikvicu u mlazu hladne vode. Kad se potpuno ohladi, dodati 10 ml 30% rastvora kalijum jodida (odeljak 4.2. pododeljak a) alineja druga ove glave), 25 ml 25% sumporne kiseline (odeljak 4.2. pododeljak a) alineja treća ove glave) i 2 ml rastvora skroba (odeljak 4.2. pododeljak a) alineja četvrta ove glave). Titrirati sa 0,1 M rastvorom natrijum tiosulfata (odeljak 4.2. pododeljak a) alineja peta ove glave), broj utrošenih mililitara natrijum tiosulfata označiti sa n. Za titraciju slepe probe, 10 ml rastvora šećera zameniti sa 10 ml destilovane vode, broj mililitara utrošenog natrijum tiosulfata za titraciju slepe probe označiti sa n'.

v) Iskazivanje rezultata

1) Izračunavanje:

Masa redukujućih šećera, izražena kao invertni šećer, sadržana u uzorku data je u tabeli 13. ovog priloga, kao funkcija broja (n' - n) utrošenih mililitara natrijum tiosulfata. Masu redukujućih šećera izražavati u gramima invertnog šećera po litru, na jedno decimalno mesto, uzimajući u obzir razređenje u toku prečišćavanja i zapreminu ispitivanog uzorka.

2) Ponovljivost, (r): r = 0,015xi

gde je xi koncentracija invertnog šećera u g/l uzorka.

3) Reproduktivnost, (R): R = 0,058 xi

gde je xi koncentracija invertnog šećera u g/l uzorka.

Tabela 13. Odnos između zapremine 0,1 M rastvora natrijum tiosulfata (n' - n) u ml i količine redukujućih šećera u mg

Na2S2O3 (ml 0,1 M)	Redukujući šećeri (mg)	Razlika	Na2S2O3 (ml 0,1 M)	Redukujući šećeri (mg)	Razlika
1	2,4	2,4	13	33,0	2,7
2	4,8	2,4	14	35,7	2,8
3	7,2	2,5	15	36,5	2,8
4	9,7	2,5	16	41,3	2,9
5	12,2	2.5	17	44,2	2,9
6	14,7	2,6	18	47,2	2,9
7	17,2	2,6	19	50,0	3,0
8	19,8	2,6	20	53,0	3.0
9	22,4	2,6	21	56,0	3,1
10	25,0	2,6	22	59,1	3,1
11	27,6	2,7	23	62,2
12	30,3	2,7

 

V. ODREĐIVANJE PEPELA

Sadržaj pepela definiše se kao suvi nesagorivi ostatak koji zaostaje posle isparavanja isparljivih sastojaka i sagorevanja (spaljivanja) organskih materija. Spaljivanje se izvodi tako da se svi katjoni (isključivši katjon amonijuma) pretvore u karbonate ili druge bezvodne neorganske soli.

a) Princip metode

Ekstrakt vina žariti na temperaturi između 500°C i 550°C do potpune oksidacije organskih materija.

b) Aparatura

- vodeno kupatilo;

- vaga sa tačnošću 0,1 mg;

- rešo ili infra-crveni evaporator;

- električna peć sa kontrolisanom temperaturom;

- platinska posuda ravnog dna, prečnika 70 mm i visine 25 mm.

v) Postupak

U prethodno izmerenu platinsku posudu (početna masa P0) odpipetirati 20 ml vina. Otpariti do suvog na ključalom vodenom kupatilu, ostatak sagoreti na rešou na 200°C ili pod infra-crvenim evaporatorom dok ne započne ugljenisanje. Kad prestane da se razvija dim, staviti posude u električnu peć na 525°C +/-25°C. Nakon 15 minuta ugljenisanja, izvaditi posudu iz peći, dodati 5 ml destilovane vode, ispariti na vodenom kupatilu ili pod infra-crvenim evaporatorom i ostatak ponovo žariti na 525°C 10 minuta. Ako sagorevanje (oksidacija ugljenisanih čestica) nije potpuno, ponavljati postupak dodavanja vode, isparavanja vode i žarenja.

Napomena: za vina sa velikim sadržajem redukujućih šećera, preporučuje se dodatak nekoliko kapi čistog biljnog ulja u ekstrakt vina (pre prvog žarenja da se spreči stvaranje pene). Kada pepeo postane bele boje, platinsku posudu ohladiti u eksikatoru i meriti (masa P1). Masa pepela u uzorku (20 ml) jednaka je P = (P1 - Po) g.

g) Iskazivanje rezultata:

Masa pepela A u gramima po litru dobiće se na dva decimalna mesta izrazom:

A = 50 × P.

VI. ODREĐIVANJE pH

Meriti razliku u potencijalu između dve elektrode uronjene u ispitivanu tečnost. Potencijal jedne od elektroda je u funkciji pH vrednosti tečnosti, dok druga elektroda ima stalan i poznat potencijal pa predstavlja referentnu elektrodu.

a) Aparatura:

- pH metar sa skalom kalibrisanom u jedinicama pH, tako da omogućava merenja do tačnosti od najmanje 0,05 pH jedinice;

- elektrode: staklena elektroda koja se drži u destilovanoj vodi;

- kalomel elektroda - referentna: drži se u zasićenom rastvoru kalijum hlorida;

- ili kombinovana elektroda koja se drži u destilovanoj vodi.

b) Reagensi - puferni rastvori

- Zasićeni rastvor kalijum hidrogen tartarata, sa najmanje 5,7 g kalijum hidrogen tartarata po litru (C4H5KO6) na 20°C. (Ovaj rastvor se može držati do dva meseca ako mu se doda 0,1 g timola na 200 ml).

pH vrednost:	3,57 na 20°C;
	3,56 na 25°C;
	3,55 na 30°C.

- 0,05 M rastvor kalijum hidrogen ftalata, koji sadrži 10,211 g kalijum hidrogen ftalata (C8H5KO4) na 20°C. (Rastvor se može držati maksimalno dva meseca).

pH vrednost:	3,999 na 15°C;
	4,003 na 20°C;
	4,008 na 25°C;
	4,015 na 30°C.

- Rastvor koji sadrži: monokalijum fosfat, KH2PO4: 3,402 g; dikalijum fosfat, K2HPO4: 4,354 g; voda do 1000 ml. (Rastvor se može držati maksimalno dva meseca.)

pH vrednost:	6,90 na 15°C;
	6,88 na 20°C;
	6,86 na 25°C;
	6,85 na 30°C.

Napomena: Mogu se koristiti i komercijalni referentni puferni rastvori.

v) Postupak

1) Priprema uzorka za analizu:

- Širu i vino meriti direktno.

- Rektifikovana koncentrovana šira: razrediti rektifikovanu koncentrovanu širu vodom da se dobije koncentracija od 25 +/- 0,5% (m/m) ukupnih šećera (25° Brix). Ako je P koncentracija (m/m) ukupnih šećera u rektifikovanoj koncentrovanoj širi, izmeriti masu od 2500/P i dopuniti do 100 g vodom. Provodljivost upotrebljene vode mora biti ispod 2 mikrosimensa po cm (μS/cm).

2) Nameštanje nule aparata:

Pre merenja aparaturu treba namestiti na nulu prema priloženom uputstvu.

3) Kalibracija pH metra:

pH metar kalibrisati na 20 sa puferskim rastvorima pH 6,88 i 3,57. Koristiti puferski rastvor pH 4,00 pri 20°C da bi proverili skalu.

4) Određivanje pH:

Elektrodu uroniti u uzorak na temperaturi između 20°C i 25°C i to što je moguće bliže 20°C. Vrednost pH direktno se pročita sa skale. Svaki uzorak izmerimo dva puta. Konačni rezultat je aritmetička sredina dva merenja.

g) Iskazivanje rezultata:

Vrednost pH šire, vina ili rastvora 25% (m/m) (25°Brix) rektifikovane koncentrovane šire se izražava na dva decimalna mesta.

 

VII. ODREĐIVANJE UKUPNIH KISELINA

Ukupne kiseline vina predstavljaju zbir njegovih titracionih kiselina kada se one titriraju do pH 7 sa standardnim alkalnim rastvorom. Ugljen dioksid nije uključen u ukupne kiseline.

a) Princip metode

Potenciometrijska titracija ili titracija uz indikator bromtimol plavo i upoređivanje sa završnom tačkom bojenog standarda.

b) Aparatura

- Vodena vakuum pumpa;

- vakuum tikvica od 500 ml;

- potenciometar sa skalom u vrednostima pH i elektroda. Staklena elektroda mora se držati u destilovanoj vodi. Kalomel elektroda mora se držati u zasićenom rastvoru kalijum hlorida. Kombinovana elektroda koja se koristi mora se držati u destilovanoj vodi;

- merni cilindri: za vino od 50 ml, za rektifikovane koncentrovane šire od 100 ml.

v) Reagensi

1) Puferni rastvor pH 7,0:

- monokalijum fosfat (KH2PO4): 107,3 g;

- 1 M rastvor natrijum hidroksida (NaOH): 500 ml;

- destilovana voda: do 1000 ml.

Mogu se koristiti komercijalni puferni rastvori.

2) 0,1 M rastvor natrijum hidroksida (NaOH).

3) Rastvor indikatora bromtimol plavo koncentracije 4 g/l:

- bromtimol plavo (C27H28Br2O5S): 4 g;

- neutralni etanol, 96%: 200 ml.

Spojimo rastvore i dodamo:

- degaziranu vodu (bez CO2): 200 ml;

- 1 M rastvor natrijum hidroksida, do pojave modro-zelene boje (pH 7): približno 7,5 ml.

Dopuniti destilovanom vodom do 1000 ml.

g) Postupak

1) Priprema uzorka:

- Vino:

Odstranjivanje ugljen dioksida: uliti oko 50 ml vina u vakuum tikvicu i priključiti na vodenu vakuum pumpu 1-2 minuta, mešajući ga kontinuirano.

- Rektifikovana koncentrovana šira:

Izmeriti tačno 200 g rektifikovane koncentrovane šire u odmernu tikvicu od 500 ml i dopuniti vodom do oznake i homogenizovati.

2) Potenciometrijska titracija

- Kalibracija pH metra: pH metar mora biti podešen za rad na temepraturi od 20°C u skladu s uputstvima proizvođača, sa pufernim rastvorom pH 7 na 20°C.

- Metoda merenja: u merni cilindar (pododeljak b) alineja četvrta ove glave) uliti određenu zapreminu uzorka, što je 10 ml u slučaju vina, a 50 ml rektifikovane koncentrovane šire (pododeljak g) tačka 1) ove glave). Dodati približno 10 ml destilovane vode i titrirati sa 0,1 M rastvorom natrijum hidroksida (pododeljak v) tačka 2) ove glave) iz birete dok pH ne bude 7 na 20°C. Rastvor natrijum hidroksida dodavati uz stalno mešanje. Označiti zapreminu dodatog 0,1 M rastvora natrijum hidroksida sa n (ml).

3) Titracija u prisustvu indikatora (bromtimol plavo)

- Preliminarani test: određivanje boje u završnoj tački:

U merni cilindar (pododeljak b) alineja četvrta ove glave) uliti 25 ml ključale destilovane vode, 1 ml rastvora bromtimol plavog (pododeljak v) tačka 3) ove glave) i zapreminu od 10 ml uzorka u slučaju vina, a 50 ml ako se radi o rektifikovanoj koncentrovanoj širi, (pripremljenog kako je opisano u pododeljku g) tačka 1) ove glave). Dodati rastvor 0,1 M natrijum hidroksida (pododeljak v) tačka 2) ove glave) dok se boja ne promeni u modro-zelenu. Tada dodati 5 ml pufernog rastvora pH 7 (pododeljak v) tačka 1) ove glave).

- Titracija:

U merni cilindar (pododeljak b) alineja četvrta ove glave) uliti 30 ml ključale destilovane vode, 1 ml rastvora bromtimol plavo i zapreminu uzorka (10 ml u slučaju vina, a 50 ml ako se radi o rektifikovanoj koncentrovanoj širi) pripremljenog kako je opisano u pododeljku g) tačka 1) ove glave. Dodati rastvor 0,1 M natrijum hidroksida (pododeljak v) tačka 2) ove glave) dok se ne dobije ista boja kao i u preliminarnom testu (alineja prva ove tačke). Zapreminu dodatog 0,1 M rastvora natrijum hidroksida označiti sa n ml.

d) Iskazivanje rezultata

1) Izračunavanje:

(1) Vino:

Ukupne kiseline, izražene u miliekvivalentima po litru (A) izračunavati:

A = 10 × f × n

gde je:

f - korekcioni faktor za 0,1 M natrijum hidroksida;

n - utrošak 0,1 M natrijum hidroksida. Rezultat izražavati na jedno decimalo mesto.

Ukupne kiseline izražene u gramima vinske kiseline po litru (A'), izračunavati:

A'= 0,075 × A

Rezultat izražavati na jedno decimalno mesto.

(2) Rektifikovana koncentrovana šira:

Ukupne kiseline, izražene u miliekvivalentima po kilogramu rektifikovane koncentrovane šire (A), izračunavati:

A = 5 × f × n

gde je:

f - korekcioni faktor za 0,1 M natrijum hidroksida;

n - utrošak 0,1 M natrijum hidroksida.

Ukupne kiseline, izražene u miliekvivalentima po kilogramu ukupnih šećera (A), izračunavati:

A = (500 × n) / P

gde je P koncentracija (m/m) ukupnih šećera. Rezultat izražavati na jedno decimalno mesto.

2) Ponovljivost (r) za titraciju s indikatorom:

Za bela, roza i crvena vina:

r = 0,9 mekv/l,

r = 0,07 g vinske kiseline/l.

3) Reproduktivnost (R) za titraciju s indikatorom:

Za bela i roza vina:

P = 3,6 mekv/l,

P = 0,3 g vinske kiseline/l.

Za crvena vina:

P = 5,1 mekv/l,

P = 0,4 g vinske kiseline/l.

VIII. ODREĐIVANJE ISPARLJIVIH KISELINA

Isparljive kiseline predstavljaju homologe sirćetne kiseline koji su prisutni u vinu u slobodnom obliku ili u obliku soli.

a) Princip metode

Titracija destilata i neutralizacija isparljivih kiselina izdvojenih iz vina, destilacijom vodenom parom.

Iz vina se najpre izdvoji ugljen dioksid. Kiselost destilata mora biti korigovana za kiselost slobodnog i vezanog sumpor dioksida u destilatu koji se dobija pod ovim uslovima. Kiselost sorbinske kiseline koja je dodata vinu mora se oduzeti od isparljivih kiselina.

Napomena: deo salicilne kiseline, koja se u nekim zemljama koristi za stabilizaciju vina, može biti prisutan u destilatu. Količina salicilne kiseline mora biti određena i oduzeta od isparljivih kiselina. Metoda za određivanje salicilne kiseline data je u pododeljku đ) ove glave.

b) Aparatura

1) Aparatura za destilaciju vodenom parom je sastavljena od:

- generatora vodene pare (para mora biti bez ugljen dioksida);

- tikvice sa cevima za paru;

- kolone za destilaciju;

- hladnjaka.

Oprema mora zadovoljiti sledeća tri testa:

(1) U tikvicu uliti 20 ml ključale vode. Sakupiti 250 ml destilata, dodati 0,1 ml 0,1 M rastvora natrijum hidroksida i dve kapi rastvora fenolftaleina. Ružičasta boja mora biti postojana najmanje 10 sekundi. To znači da para ne sadrži ugljen dioksid.

(2) U tikvicu uliti 20 ml 0,1 M rastvora sirćetne kiseline. Sakupiti 250 ml destilata i titrirati sa 0,1 M rastvorom natrijum hidroksida. Zapremina utrošenog NaOH mora biti najmanje 19,9 ml. To znači da je predestilovano najmanje 99,5% sirćetne kiseline.

(3) U tikvicu uliti 20 ml 1 M rastvora mlečne kiseline. Sakupiti 250 ml destilata i titrirati kiselinu sa 0,1 M rastvorom natrijum hidroksida. Zapremina utrošenog rastvora natrijum hidroksida mora biti manja ili jednaka 1,0 ml, što znači da se predestilovalo ne više od 0,5% mlečne kiseline.

Svaka aparatura ili postupak, koji zadovoljava ove testove ispunjava zahteve službenih međunarodnih aparatura ili postupaka.

2) Vodena pumpa.

3) Vakuum tikvica.

v) Reagensi

- Kristalizovana vinska kiselina (C4H6O6);

- 0,1 M rastvor natrijum hidroksida (NaOH);

- 1% rastvor fenolftaleina u 96% neutralnom alkoholu;

- hlorovodonična kiselina, HCl (ρ20 = 1,18 do 1,19 g/l) razređena 1:4 (v/v);

- 0,005 M rastvor joda (I2);

- kristalizovani kalijum jodid (KI);

- rastvor skroba, 5 g/l (5g skroba pomešati sa oko 500 ml vode; uz stalno mešanje, zagrejati do vrenja i ostaviti da vri 10 minuta; dodati 200 g natrijum hlorida; kada se ohladi razrediti do jednog litra);

- zasićeni rastvor natrijum borata (Na2B4O7 x 10 H2O), koncentracije približno 55 g/l pri 20°C.

g) Postupak

1) Pripremanje uzorka: odstranjivanje ugljen dioksida; u vakuum tikvicu uliti približno 50 ml vina; pomoću vodene pumpe uspostaviti vakuum u tikvici na par minuta, tresući vino neprestano.

2) Destilacija vodenom parom:

U tikvicu uliti 20 ml vina oslobođenog od ugljen dioksida kao što je to opisano u tački 1) ovog pododeljka. Dodati približno 0,5 g vinske kiseline (pododeljak v) alineja prva ove glave). Sakupiti najmanje 250 ml destilata.

3) Titracija:

Titrirati sa 0,1 M rastvora natrijum hidroksida (pododeljak v) alineja druga ove glave) uz dodatak dve kapi fenolftaleina (pododeljak v) alineja treća ove glave) kao indikatora. Označiti zapreminu upotrebljenog natrijum hidroksida n (ml). Dodati četiri kapi razređene hlorovodonične kiseline (pododeljak v) alineja četvrta ove glave), 2 ml rastvora skroba (pododeljak v) alineja sedma ove glave) i nekoliko kristala kalijum jodida (pododeljak v) alineja šesta ove glave). Titrirati slobodan sumpor dioksid sa 0,005 M rastvora joda (pododeljak v) alineja peta ove glave). Označiti upotrebljenu zapreminu sa n'. Dodati zasićeni rastvor natrijum borata (pododeljak v) alineja osma ove glave) dok se opet ne pojavi ružičasta boja. Titrirati ukupni sumpor dioksid sa 0,005 M rastvorom joda (pododeljak v) alineja peta ove glave). Označiti upotrebljenu zapreminu 0,005 M rastvora joda sa n''.

d) Iskazivanje rezultata

1) Izračunavanje:

Isparljive kiseline, izražene u miliekvivalentima po litru, na jedno decimalno mesto, date su formulom:

A = 5 × (n × f - 0,1 × f' × n' - 0,05 × f ‚ × n'')

gde je:

n - utrošak 0,1 M natrijum hidroksida;

n' - utrošak 0,005 M rastvora joda;

n'' - utrošak 0,005 M rastvora joda;

f - korekcioni faktor 0,1 M natrijum hidroksida;

f' - korekcioni faktor 0,005 M rastvora joda.

Isparljive kiseline, izražene u gramima sirćetne kiseline po litru, izražene na dva decimalna mesta, date su formulom:

A = 0,300 x (n × f - 0,1 × f ‚ × n' - 0,05 × f ‚ × n'')

gde je:

n - utrošak 0,1 M natrijum hidroksida;

n' - utrošak 0,005 M rastvora joda;

n'' - utrošak 0,005 M rastvora joda;

f - korekcioni faktor 0,1 M natrijum hidroksida;

f' - korekcioni faktor 0,005 M rastvora joda.

2) Ponovljivost (r):

r = 0,7 mekv/l;

r = 0,04 g sirćetne kiseline/l.

3) Reproduktivnost (R):

R = 1,3 mekv/l;

R = 0,08 g sirćetne kiseline/l.

4) Vino sa prisutnom sorbinskom kiselinom:

Kako se 96% sorbinska kiselina destiluje vodenom parom u destilat zapremine 250 ml, njena kiselost mora biti oduzeta od isparljivih kiselina. 100 mg sorbinske kiseline odgovara kiselosti od 0,89 miliekvivalenata ili 0,053 g sirćetne kiseline. Koncentraciju sorbinske kiseline u mg/l određujemo drugim metodama.

đ) Određivanje salicilne kiseline u destilatu za ispitivanje sadržaja isparljivih kiselina

1) Princip

Nakon što se odrede isparljive kiseline sa korekcijom za sumpor dioksid, prisutnost salicilne kiseline dokazuje se pojavom ljubičaste boje, nakon zakišeljavanja i dodatka soli gvožđa (III).

Određivanje salicilne kiseline sadržane u destilatu sa isparljivim kiselinama izvodi se u drugom destilatu iste zapremine kao i destilat u kome su određene isparljive kiseline. U ovom destilatu salicilna kiselina se određuje kolorimetrijskom metodom. Dobijena količina se oduzima od isparljivih kiselina destilata.

2) Reagensi:

- Hlorovodonična kiselina, HCl (ρ20 = 1,18 do 1,19 g/l);

- 0,1 M rastvor natrijum tiosulfata, (Na2S2O3 x 5H2O);

- 10% rastvor gvožđe (III) amonijum sulfata [(Fe2(SO4)3 x (NH4)2SO4 x 24H2O)];

- 0,01 M rastvor natrijum salicilata: rastvor sadrži 1,60 g/l natrijum salicilata (NaC7H5O3).

3) Postupak:

- Određivanje salicilne kiseline u destilatu isparljivih kiselina:

Neposredno posle određivanja isparljivih kiselina i korekcije na slobodni i ukupni sumpor dioksid, uliti u konusnu tikvicu 0,5 ml hlorovodonične kiseline (tačka 2) alineja prva ovog pododeljka), 3 ml 0,1 M rastvora natrijum tiosulfata (tačka 2) alineja druga ovog pododeljka) i 1 ml rastvora gvožđe (III) amonijum sulfata (tačka 2) alineja treća ovog pododeljka). U prisustvu salicilne kiseline pojaviće se ljubičasto obojenje.

- Određivanje salicilne kiseline:

Na konusnoj tikvici označiti nivo destilata. Isprazniti i isprati tikvicu. U istu tikvicu dodati novih 20 ml vina, destilovati vodenom parom i skupiti destilat u konusnu tikvicu do označenog nivoa. Dodati 0,3 ml hlorovodične kiseline (tačka 2) alineja prva ovog pododeljka) i 1 ml rastvora gvožđe (III) amonijum sulfata (tačka 2) alineja treća ovog pododeljka). Sadržaj konusne tikvice oboji se ljubičasto.

U konusnu tikvicu, identičnu tikvici iz prvog stava ove tačke, dodati destilovanu vodu do označenog nivoa. Dodati 0,3 ml hlorovodonične kiseline (tačka 2) alineja prva ovog pododeljka), i 1 ml rastvor gvožđe (III) amonijum sulfata (tačka 2) alineja treća ovog pododeljka). Iz birete dodati 0,01 M rastvor natrijum salicilata (tačka 2) alineja četvrta ovog pododeljka) sve dok rastvor ne poprimi istu ljubičastu boju kao ona u konusnoj tikvici s vinskim destilatom.

Zapreminu rastvora, koja je dodata iz birete označimo sa n'' (ml).

- Korekcija isparljivih kiselina:

Od zapremine n 0,1 M rastvora natrijum hidroksida, upotrebljenog za titraciju isparljivih kiselina oduzeti 0,1 x n'' (ml).

IX. ODREĐIVANJE NEISPARLJIVIH KISELINA

Neisparljive kiseline predstavljaju razliku između ukupnih i isparljivih kiselina. Neisparljive kiseline izražavati u:

- miliekvivalentima po litru (mekv/l);

- gramima vinske kiseline po litru (g vinske kiseline/l).

X. ODREĐIVANJE UKUPNOG I SLOBODNOG SUMPOR DIOKSIDA

Slobodni sumpor dioksid definisan je kao sumpor dioksid koji je prisutan u širi ili vinu u sledećim oblicima:

H2SO3 i HSO3-

Ravnoteža između ovih oblika je funkcija pH i temperature:

H2SO3 ↔ H+ + HSO3-

Ukupni sumpor dioksid definisan je kao suma svih različitih oblika sumpor dioksida prisutnih u vinu, bilo da je u slobodnom stanju ili kombinovan sa sastojcima vina.

Princip metode

10.1. Referentna metoda:

- Za vina i šire:

Sumpor dioksid izdvajati iz vina u struji vazduha ili inertnog gasa azota; vezati i oksidisati ga tako da se mehurićima provodi kroz razređeni i neutralni rastvor vodonik peroksida. Nastalu sumpornu kiselinu odrediti titracijom sa standardnim rastvorom natrijum hidroksida.

Slobodni sumpor dioksid izdvajati iz vina na niskoj temperaturi (10°C).

Ukupni sumpor dioksid izdvajati iz vina zagrevanjem na visokoj temperaturi (približno 100°C).

- Za rektifikovanu koncentrovanu širu:

Ukupni sumpor dioksid izdvajati iz prethodno razređene rektifikovane koncentrovane šire zagrevanjem na visokoj temperaturi (približno 100°C).

10.2. Brza metoda:

Za vina i šire:

Slobodni sumpor dioksid odrediti direktno jodometrijskom titracijom.

Vezani sumpor dioksid naknadno odrediti jodometrijskom titracijom nakon alkalne hidrolize. Ovaj rezultat pridodati rezultatu slobodnog sumpor dioksida i zbir predstavlja ukupni sumpor dioksid.

10.1. Referentna metoda

a) Aparatura

- Aparatura, koja se koristi mora se slagati sa slikom 2. Posebnu pažnju potrebno je posvetiti hladnjaku.

Slika 2: Dimenzije su u milimetrima. Unutrašnji prečnici
četiri koncentrične cevi što čine hladnjak su: 45, 34, 27 i 10 mm.

Cev koja izvodi gas iz uzorka se u tikvici B završava jednom malom kuglom prečnika 1 cm koja ima 20 rupica prečnika 0,2 mm oko svog najvećeg obima. Izuzetno, ova cev se može završavati staklenom poroznom pločicom koja stvara veliki broj vrlo malenih mehurića i osigurava dobar kontakt između tečne i gasovite faze.

Protok gasa kroz aparaturu trebalo bi da iznosi približno 40 litara na sat. Boca na desnoj strani slike 2. namenjena je sprečavanju pada pritiska koji nastaje zbog vodene vakuum pumpe, na 20 do 30 cm vode. Za regulaciju pravilnog vakuuma, između tikvice i boce trebalo bi postaviti merač protoka sa polukapilarnom cevčicom.

- Mikro-bireta.

b) Reagensi

- Fosforna (ortofosforna) kiselina, 85% (H3PO4, p20 = 1,71 g/ml);

- rastvor vodonik peroksida, 9,1 g H2O2 / litru (tri volumena);

- indikator: metil crveno: 100 mg; metilensko plavo: 50 mg; alkohol, 50%: 100 ml;

- 0,01 M rastvor natrijum hidroksida, NaOH.

v) Postupak

1) Određivanje slobodnog sumpor dioksida:

Vino se mora držati u punoj i začepljenoj boci na 20°C dva dana pre određivanja. U tikvicu B staviti 2 do 3 ml rastvora vodonik peroksida (odeljak 10.1. pododeljak b) alineja druga ove glave) i dve kapi indikatora (odeljak 10.1. pododeljak b) alineja treća ove glave). Rastvor vodonik peroksida neutralisati sa rastvorom 0,01 M natrijum hidroksida (odeljak 10.1. pododeljak b) alineja četvrta ove glave) i spojiti tikvicu B sa aparaturom. U tikvicu A uliti 50 ml uzorka i 15 ml fosforne kiseline (odeljak 10.1. pododeljak b) alineja prva ove glave) i spojiti sa aparaturom. Provoditi mehuriće vazduha (ili azota) 15 minuta. Oslobođeni sumpor dioksid se u tikvici B oksidiše u sumpornu kiselinu. Tikvicu V skinuti sa aparature i titrirati nastalu kiselinu sa 0,01 M rastvorom natrijum hidroksida (odeljak 10.1. pododeljak b) alineja četvrta ove glave). Utrošenu zapreminu za titraciju označiti sa n (ml).

(1) Iskazivanje rezultata

Oslobođeni sumpor dioksid izražava se u mg/l, na najbliži ceo broj.

(2) Izračunavanje:

- Slobodni sumpor dioksid u mg/l dobija se iz proizvoda 6,4 × f × n

gde je:

f - korekcioni faktor 0,01 M natrijum hidroksida;

n - utrošak 0,01 M natrijum hidroksida.

2) Određivanje ukupnog sumpor dioksida:

- Rektifikovana koncentrovana šira:

U slučaju rektifikovane koncentrovane šire koristiti rastvor, dobijen razređivanjem uzorka do 40% (m/v) kako je opisano u glavi VII. pododeljak g) tačka 1) alineja druga ovog priloga. U tikvicu A od 250 ml sipati 50 ml razređenog uzorka i 5 ml fosforne kiseline (odeljak 10.1. pododeljak b) alineja prva ove glave). Tikvicu A spojiti na aparaturu.

- Šire i vina:

Ako očekivana koncentracija ukupnog SO2 u uzorku nije veća od 50 mg/l, staviti 50 ml uzorka i 15 ml ortofosforne kiseline (odeljak 10.1. pododeljak b) alineja prva ove glave) u tikvicu A od 250 ml i spojiti na aparaturu.

Ako je očekivana koncentracija ukupnog SO2 u uzorku veća od 50 mg/l, staviti 20 ml uzorka i 5 ml ortofosforne kiseline (odeljak 10.1. pododeljak b) alineja prva ove glave) u tikvicu A od 250 ml i spojiti aparaturu.

U tikvicu B staviti 2 do 3 ml rastvora vodonik peroksida (odeljak 10.1. pododeljak b) alineja druga ove glave), neutralisati po postupku u skladu sa odeljkom 10.1. pododeljak v) tačka 1) ove glave. Vino u tikvici A zagrejati do ključanja pomoću plamena visine od 4 do 5 cm, koji direktno dotiče dno tikvice. Tikvica se ne sme staviti na metalnu ploču, već na disk prečnika otprilike 30 cm sa rupom u sredini.

Tako se izbegava pregrevanje supstanci ekstrahovanih iz vina koje se talože na zidove tikvice.

Održavati ključanje dok kroz aparaturu struji vazduh (ili azot). Za 15 minuta sav sumpor dioksid se oslobodi i oksidiše. Nastalu sumpornu kiselinu titrirati sa 0,01 M rastvorom natrijum hidroksida (odeljak 10.1. pododeljak b) alineja četvrta ove glave). Utrošenu zapreminu za titraciju označiti sa n (ml).

(1) Iskazivanje rezultata

- Šire i vina: ukupni sumpor dioksid se iskazuje u mg/l.

- Rektifikovana koncentrovana šira: ukupni sumpor dioksid se iskazuje u mg/kg ukupnih šećera.

(2) Izračunavanje:

- Vino:

Ukupni sumpor dioksid u miligramima po litru, gde koncentracija SO2 u uzorku nije veća od 50 mg/l, (50 ml uzorka):

6,4 × f × n

gde je:

f - korekcioni faktor 0,01 M natrijum hidroksida;

n - utrošak 0,01 M natrijum hidroksida.

Ukupni sumpor dioksid u miligramima po litru, gde je koncentracija SO2 u uzorku veća od 50 mg/l, (20 ml uzorka):

16 × f × n

gde je:

f - korekcioni faktor 0,01 M natrijum hidroksida;

n - utrošak 0,01 M natrijum hidroksida.

- Rektifikovana koncentrovana šira:

Ukupni sumpor dioksid u mg/kg ukupnih šećera (50 ml pripremljenog uzorka):

(1600 × n)/P

gde je

P masena koncentracija (m/m) ukupnih šećera.

(3) Ponovljivost (r):

za 50 ml uzorka (koncentracija SO2 u uzorku nije veća od 50 mg/l); r = 1 mg/l, za 20 ml uzorka (koncentracija SO2 u uzorku je veća od 50 mg/l); r = 6 mg/l.

(4) Reproduktivnost (R):

za 50 ml uzorka (koncentracija SO2 u uzorku nije veća od 50 mg/l); R = 9 mg/l, za 20 ml uzorka (koncentracija SO2 u uzorku je veća od 50 mg/l); R= 15 mg/l.

10.2. Brza metoda

a) Aparatura

- tikvica od 500 ml;

- bireta;

- pipete od 1, 2, 5 i 50 ml.

b) Reagensi

- EDTA komplekson III: di-natrijumova so etilen diamin tetra-sirćetna kiselina (C10H14N2O8Na2 × 2H2O);

- 4M rastvor natrijum hidroksida, NaOH, (160 g/l);

- sumporna kiselina H2SO4 (p20= 1,84 g/ml), razređena 1:10 (v/v);

- rastvor skroba 5 g/l: 5g skroba pomešati sa oko 500 ml vode; grejati do ključanja uz stalno mešanje i ostaviti da ključa 10 minuta; dodati 200 g natrijum hlorida (NaCl). Nakon što se ohladi, dopuniti do jednog litra;

- 0,025 M rastvora joda, I2.

v) Postupak

1) Slobodni sumpor dioksid

U tikvicu od 500 ml dodati:

- 50 ml vina,

- 5 ml rastvora skroba (odeljak 10.2. pododeljak b) alineja četvrta ove glave),

- 30 mg EDTA komplekson III (odeljak 10.2. pododeljak b) alineja prva ove glave),

- 3 ml rastvora sumporne kiseline 1:10 (v/v) (odeljak 10.2. pododeljak b) alineja treća ove glave).

Titrirati sa 0,025 M rastvorom joda uz indikator skroba do plave boje koja se zadrži od 10 do 15 sekundi. Zapreminu utrošenog joda označiti sa n.

2) Ukupni sumpor dioksid

Dodati 8 ml 4 M rastvora natrijum hidroksida (odeljak 10.2. pododeljak b) alineja druga ove glave), promućkati rastvor jednom i ostaviti da stoji 5 minuta. Mešajući energično dodavati istovremeno 10 ml sumporne kiseline 1:10 (v/v) kako je opisano u odeljku 10.2. pododeljak b) alineja treća ove glave. Odmah titrirati sa 0,025 M joda (odeljak 10.2. pododeljak b) alineja peta ove glave). Zapreminu upotrebljenog rastvora joda označiti sa n' (ml).

Dodati 20 ml 4 M rastvora natrijum hidroksida (odeljak 10.2. pododeljak b) alineja druga ove glave), promućkati i pustiti da odstoji 5 minuta. Razrediti sa 200 ml ledene vode.

Energično mešajući dodati odjednom sadržaj epruvete u kojoj se nalazi 30 ml sumporne kiseline 1:10 (v/v). Titrirati slobodni sumpor dioksid sa 0,025 M rastvorom joda.

Upotrebljenu zapreminu rastvora joda označiti sa n''.

g) Iskazivanje rezultata

1) Izračunavanje:

(1) Slobodni sumpor dioksid u miligramima po litru:

32 × f × n

gde je:

f - korekcioni faktor 0,025 M rastvora joda;

n - utrošak 0,025 M rastvora joda.

(2) Ukupni sumpor dioksid u miligramima po litru:

32 × f × (n + n' + n'').

gde je:

f - korekcioni faktor 0,025 M rastvora joda;

n - utrošak 0,025 M rastvora joda;

n' - utrošak 0,025 M rastvora joda;

n'' - utrošak 0,025 M rastvora joda.

Napomene:

- Za crvena vina sa niskim koncentracijama SO2, primereno je koristiti razređeni rastvor joda više od 0,025 M (npr. 0,01 M). U tom slučaju zameniti koeficijent 32 sa 1,28 u gornjoj formuli.

- Za crvena vina preporučuje se osvetljavanje vina odozdo zrakom žutog svetla iz obične sijalice čiji zrak svetli kroz rastvor kalijum-hromata ili iz lampe sa natrijumovom parom. Određivanje izvoditi u tamnoj sobi i posmatrati transparentnost vina: u tački ekvivalencije ono postaje opalescentno.

- Ako je količina sumpor dioksida blizu ili ako prelazi zakonski dozvoljenu količinu, ukupni sumpor dioksid bi trebalo odrediti referentnom metodom.

- Ako se određivanje slobodnog sumpor dioksida posebno zahteva, mora se izvesti analiza na uzorku koji je čuvan pri anaerobnim uslovima na temperaturi od 20°C dva dana pre analize. Određivanje obavljati na 20°C.

- Budući da se neke supstance oksidišu sa jodom u kiseloj sredini, za tačniju analizu mora se ta količina joda tačno proceniti. Da bi se to postiglo, slobodni sumpor dioksid treba vezati na dodati etanal ili propanal pre titracije sa jodom. U konusnu tikvicu od 300 ml sipati 50 ml vina, dodati 5 ml rastvora etanala, koncentracije 7 g/l, ili 5 ml propanala koncentracije 10 g/l. Zatvoriti tikvicu i ostaviti da odstoji najmanje 30 minuta. Dodati 3 ml sumporne kiseline 1:10 (v/v) i dovoljno 0,025 M rastvora joda da se promeni boja skroba. Upotrebljenu zapreminu joda označiti sa n'' (ml). Ova vrednost mora biti oduzeta od n (slobodni sumpor dioksid) i od n + n' + n'' (ukupni sumpor dioksid). Vrednost n''' je uopšteno mala od 0,2 do 0,3 ml 0,025 M rastvora joda. Ako je vinu bila dodata askorbinska kiselina, vrednost n''' će biti mnogo viša pa je moguće, aproksimativno, meriti količinu ove supstance iz vrednosti n''', budući da 1 ml 0,025 M rastvora joda oksidiše 4,4 mg askorbinske kiseline. Određivanjem n''' moguće je sasvim lako utvrditi prisutnost preostale askorbinske kiseline u količinama većim od 20 mg/l u vinima kojima je ona bila dodata.

XI. ODREĐIVANJE LIMUNSKE KISELINE

a) Princip metode

Limunska kiselina prevodi se u oksalacetat i acetat u reakciji katalizovanoj citrat-liazom (CL):

CL   citrat ↔ oksalacetat + acetat

U prisustvu malat-dehidrogenaze (MDH) i laktat-dehidrogenaze (LDH), oksalacetat i njegov produkt dekarboksilacije, piruvat, redukuju se u L-malat i L-laktat pomoću redukovanog nikotinamid-adenin-dinukleotida (NADH):

	MDH   oksalacetat + NADH + H+ ↔ L-malat + NAD+
	LDH   piruvat + NADH + H+ ↔ L-laktat + NAD+

 

Količina NADH oksidovanog u NAD+ u ovim reakcijama proporcionalna je količini početnog citrata. Oksidacija NADH meri se rezultirajućim padom apsorbancije na talasnoj dužini od 340 nm.

b) Aparatura

- Spektrofotometar, koji omogućava merenje na 340 nm, talasnoj dužini na kojoj NADH ima najveću apsorbanciju. Umesto toga može se primeniti spektrofotometar sa diskontinuiranim izvorom koji omogućava merenje na 334 nm ili 365 nm. Budući da se sprovode merenja apsolutnih apsorbancija (tj. ne primenjuju se kalibracione krive, već se standardizacija sprovodi uzimajući u obzir koeficijent ekstinkcije NADH), moraju se proveriti skale talasnih dužina i spektralne apsorbancije na aparatu.

- Staklene kivete od 1 cm.

- Mikropipete za dodavanje zapremine od 0,02 do 2 ml.

v) Reagensi

- Rastvor pufera pH 7,8 (0,51 M rastvor glicil glicina; pH 7,8; Zn2+ (0,6 × 10-3 M) : 7,13 g glicil glicina rastvoriti u približno 70 ml redestilovane vode. Podesiti pH na 7,8 sa približno 13 ml 5 M rastvora natrijum hidroksida, dodati 10 ml rastvora cink hlorida (80 mg ZnCl2 u 100 ml H2O) i dopuniti do 100 ml redestilovanom vodom.

- Rastvor redukovanog nikotinamid-adenin-dinukleotida (NADH) (približno 6 × 10-3 M): rastvoriti 30 mg NADH i 60 mg NaHCO3 u 6 ml redestilovane vode.

- Rastvor malat-dehidrogenaze/laktat-dehidrogenaze (MDH/LDH, 0,5 mg MDH/ml, 2,5 mg LDH/ml): pomešati zajedno 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml rastvora amonijum sulfata (3,2 M) i 0,5 ml LDH (5 mg/ml). Ova suspenzija ostaje stabilna najmanje jednu godinu pri 4°C.

- Citrat-liaza (CL, 5 mg protein/ml): rastvoriti 168 mg liofilizata u 1 ml ledene vode. Ovaj rastvor ostaje stabilan najmanje jedanu nedelju pri 4°C ili najmanje četiri nedelje ako je smrznut. Preporučuje se pre određivanja proveriti aktivnost enzima.

- Polivinilpolipirolidon (u daljem tekstu: PVPP).

Napomena: svi navedeni reagensi su komercijalno dostupni.

g) Priprema uzorka

Određivanje citrata se obično sprovodi direktno u vinu bez prethodnog uklanjanja boje i bez razređenja ukoliko je količina limunske kiseline manja od 400 mg/l. Prema potrebi napraviti razređenje tako da je koncentracija citrata između 20 i 400 mg/l (tj. između 5 i 80 µg citrata u ispitivanom uzorku).

Kod crvenih vina bogatih fenolnim materijama preporučuje se prethodna priprema sa PVPP:

Napraviti vodenu suspenziju od oko 0,2 g PVPP i ostaviti da stoji 15 minuta. Profiltrirati kroz nabrani filter-papir.

10 ml vina sipati u tikvicu od 50 ml, dodati vlažni PVPP koji je sa filtera uklonjen špatulom. Mućkati nekoliko munuta i filtrirati.

d) Postupak

Na spektrofotometru podesiti apsorbanciju na 340 nm, primenom kiveta širine 1 cm, uz vazduh kao slepu probu (bez kivete na optičkom putu). Zatim u kivetu stavljati kako sledi:

	Referentna kiveta (ml)	Kiveta za uzorak A1 (ml)
Rastvor 1 (pododeljak v) alineja prva ove glave	1,00	1,00
Rastvor 2 (pododeljak v) alineja druga ove glave)	0,10	0,10
Uzorak	-	0,20
Redestilovana voda	2,00	1,80
Rastvor 3 (pododeljak v) alineja treća ove glave)	0,02	0,02
Promućkamo, i nakon pet minuta očitamo apsorbanciju rastvora u referentnoj kiveti i kiveti za uzorak (A1). Dodamo:
Rastvor 4 (pododeljak v) alineja četvrta ove glave)	0,02 ml	0,02 ml

Promućkati i sačekati da se reakcija završi (oko pet minuta) i očitati apsorbancije rastvora u referentnoj kiveti i kiveti za uzorak (A2).

Izračunati razliku apsorbancija (A2 - A1) za referentnu kivetu i kivetu za uzorak, ΔAR i ΔAS.

Na kraju, izračunati razliku između ovih razlika:

ΔA = ΔAS - ΔAR

Napomena: Vreme koje je potrebno da se završi enzimska reakcija može varirati u zavisnosti od šarže. Gornja vrednost je data samo kao orijentacija i nju treba odrediti za svaku šaržu.

đ) Iskazivanje rezultata

Koncentracija limunske kiseline izražava se u miligramima po litru na najbliži ceo broj.

1) Izračunavanje

Opšta formula za izračunavanje koncentracije u mg/l je:

C = [(V × M)/(e × d × υ)] × ΔA

gde je:

V = zapremina rastvora koji se analizira u ml (3,14 ml);

υ = zapremina uzorka u ml (0,2 ml);

M = molekulska masa jedinjenja koje određujemo (za bezvodnu limunsku kiselinu M =192,1);

d = optički put u kiveti u cm (1 cm);

e = koeficijent apsorbancije NADH (kod 340 nm, e = 6,3 mmol-1 × 1 × cm-1), tako da je:

C = 479 × ΔA.

Ako je uzorak prethodno razređen rezultat pomnožiti s faktorom razređenja.

Napomena:

Kod 334 nm: C = 488 x ΔA (ε = 6,2 mmol-1 × 1 × cm-1); kod 365 nm: C = 887 x ΔA (ε = 3,4 mmol-1 × 1 × cm -1)

2) Ponovljivost (r)

Za koncentracije limunske kiseline manje od 400 mg/l: r = 14 mg/l.

Za koncentracije limunske kiseline veće od 400 mg/l: r = 28 mg/l.

3) Reproduktivnost (R)

Za koncentracije limunske kiseline manje od 400 mg/l; R = 39 mg/l.

Za koncentracije limunske kiseline veće od 400 mg/l; R = 65 mg/l.

XII. ODREĐIVANJE UGLJEN DIOKSIDA

Princip metode

12.1. Referentna metoda:

a) Mirna vina (pritisak CO2 < 0,5 × 105 Pa; 105 paskala (Pa) = 1 bar):

Zapreminu vina uzetu od uzorka ohladiti na oko 0°C i pomešati sa dovoljnom količinom natrijum hidroksida da se dobije pH vrednost od 10 do 11. Titracija se sprovodi rastvorom kiseline u prisustvu ugljene-anhidraze. Sadržaj ugljen dioksida izračunava se iz utroška kiseline potrebne da se pH promeni od 8,6 (hidrogenkarbonatni oblik) do 4,0 (ugljena kiselina). Slepa proba se obavlja u istim uslovima na degaziranom vinu da bi se uzela u obzir zapremina rastvora natrijum hidroksida koji veže kiseline u vinu.

b) Penušava i gazirana vina:

Uzorak vina koji se analizira ohladi se blizu tačke smrzavanja. Nakon uzimanja količine koja će se upotrebiti za slepu probu nakon degaziranja, ostatak u boci se prevede u alkalno stanje tako da se sav ugljen dioksid veže u obliku Na2CO3. Zatim se sprovodi titracija rastvorom kiseline u prisustvu ugljene-anhidraze. Sadržaj ugljen dioksida izračunava se iz utroška kiseline potrebnog da se pH promeni od 8,6 (hidrogenkarbonatni oblik) do 4,0 (ugljena kiselina). Slepa proba se vrši u istim uslovima na degaziranom vinu da bi se uzela u obzir zapremina rastvora natrijum hidroksida koji veže kiseline u vinu.

12.2. Uobičajena metoda:

a) Penušava i gazirana vina

Manometarska metoda: nadpritisak ugljen dioksida meri se direktno u boci pomoću afrometra.

12.1. Referentna metoda

a) Mirna vina (pritisak CO2 ≤ 0,5 × 105 Pa)

1) Aparatura

- Magnetna mešalica;

- pH metar.

2) Reagensi

- Rastvor natrijum hidroksida (NaOH) 0,1 M;

- rastvor sumporne kiseline (H2SO4) 0,05 M;

- rastvor enzima ugljene-anhidraze, 1 g/l.

3) Postupak:

Uzorak vina ohladiti na približno 0°C zajedno s pipetom od 10 ml za odmeravanje. Staviti 25 ml 0,1 M rastvora natrijum hidroksida (odeljak 12.1. pododeljak a) tačka 2) alineja prva ove glave) u čašu od 100 ml; dodati dve kapi vodenog rastvora ugljene-anhidraze (odeljak 12.1. pododeljak a) tačka 2) alineja treća ove glave). Dodati 10 ml vina pomoću pipete ohlađene na 0°C.

Staviti čašu na magnetnu mešalicu, namestiti pH elektrodu i povremeno mešati. Kad tečnost postigne sobnu temperaturu, polako titrirati 0,05 M rastvorom sumporne kiseline (odeljak 12.1. pododeljak a) tačka 2) alineja druga ove glave) do pH 8,6. Zabeležiti utrošak na bireti.

Nastaviti titraciju sumpornom kiselinom do pH 4,0. Označiti sa n ml utrošene sumporne kiseline za titraciju između pH 8,6 i 4,0.

Ukloniti CO2 iz oko 50 ml uzorka vina mućkanjem u vakuumu oko tri minuta, uz grejanje tikvice u vodenom kupatilu na oko 25°C.

Gornji postupak ponoviti i na 10 ml degaziranom vinu. n' (ml) je utrošak 0,05 M sumporne kiseline.

4) Iskazivanje rezultata

1 ml 0,05 M rastvora sumporne kiseline odgovara 4,4 mg CO2. Količina CO2 u gramima po litru (g/l) data je formulom:

0,44 × f × (n - n')

gde je:

f - korekcioni faktor 0,05 M rastvora sumporne kiseline;

n - utrošak 0,05 M rastvora sumporne kiseline u rashlađenom vinu sa dodatkom 25 ml 0,1 M natrijum hidroksida;

n' - utrošak 0,05 M rastvora sumporne kiseline u degaziranom vinu.

Izražava se na dva decimalna mesta.

Napomena: Ako vino sadrži malo CO2 (CO2 < 1 g/l) nije potrebno dodati ugljenu-anhidrazu za katalizu reakcije hidratacije CO2.

b) Penušava i gazirana vina

1) Aparatura:

- Magnetna mešalica;

- pH metar.

2) Reagensi:

- Rastvor natrijum hidroksida (NaOH), 50% (m/m);

- rastvor sumporne kiseline (H2SO4), 0,05 M;

- rastvor enzima ugljene-anhidraze, 1 g/l.

3) Postupak:

Označiti nivo vina u boci pa ga hladiti dok ne počne smrzavanje. Pustiti da se boca blago ugreje, promućkati je dok kristali leda ne nestanu. Brzo ukloniti čep i staviti 45 do 50 ml vina u odmerni cilindar za slepu probu. Tačnu zapreminu uzetog vina, v (ml), očitati na cilindru kad vino postigne sobnu temperaturu.

Odmah nakon što je uklonjen uzorak za slepu probu, dodati 20 ml rastvora natrijum hidroksida (odeljak 12.1. pododeljak b) tačka 2) alineja prva ove glave) u bocu zapremine 750 ml.

Pričekati da vino postigne sobnu temperaturu.

U čašu od 100 ml staviti 30 ml prokuvane destilovane vode i dve kapi rastvora ugljene-anhidraze (odeljak 12.1. pododeljak b) tačka 2) alineja treća ove glave). Dodati 10 ml vina koje je prethodno prevedeno u alkalnu sredinu. Staviti čašu na magnetnu mešalicu, namestiti elektrodu i magnetni štapić uz umereno mešanje.

Titrirati rastvorom sumporne kiseline (odeljak 12.1. pododeljak b) tačka 2) alineja druga ove glave) do pH 8,6. Zabeleži se utrošak na bireti. Nastaviti polako titraciju sumpornom kiselinom do pH 4,0. Neka je n (ml) utrošak kiseline za titriranje između pH 8,6 i 4,0. Ukloniti CO2 iz v (ml) uzorka vina (koje je uzeto za slepu probu) mućkanjem u vakuumu oko tri minuta, uz grejanje tikvice u vodenom kupatilu na oko 25°C. Uzeti 10 ml degaziranog vina i dodati 30 ml prokuvane destilovane vode, dodati dve do tri kapi rastvora natrijum hidroksida da se pH podesi na između 10 i 11. Zatim slediti gornji postupak. Neka je n' (ml) dodata zapremina 0,05 M rastvora sumporne kiseline.

4) Iskazivanje rezultata

1 ml 0,05 M rastvora sumporne kiseline odgovara 4,4 mg CO2. Isprazniti bocu vina koje je bilo prevedeno u alkalnu sredinu i odrediti unutar 1 ml početnu zapreminu vina tako da se boca ispuni vodom do oznake, i to je V (ml).

Količina CO2 u gramima po litru (g/l) data je formulom:

0,44 × f × (n - n') × [ (V - n + 20)/ (V - n)]

gde je:

f - korekcioni faktor 0,05 M rastvora sumporne kiseline;

n - utrošak 0,05 M rastvora sumporne kiseline u rashlađenom vinu sa dodatkom 25 ml 0,1 M natrijum hidroksida;

n' - utrošak 0,05 M rastvora sumporne kiseline u degaziranom vinu.

Rezultat se izražava na dva decimalna mesta.

Nadpritisak na 20°C (Paph20) izražen u Paskalima i dat je formulom:

Paph20 =	Q	- Patm
	1,951 x 10-5(0,86-0,01A)x(1-0,00144C)

gde je:

Q = količina CO2 u g/l vina;

A = alkoholna jačina vina na 20°C;

S = količina šećera u vinu u g/l;

Patm = atmosferski pritisak u Paskalima.

12.2. Uobičajena metoda

a) Penušava i gazirana vina

1) Aparatura:

Afrometar:

Afrometar je uređaj za merenje pritiska u bocama penušavih i gaziranih vina. Ima raznih modela u zavisnosti od načina zatvaranja boce. Skala afrometra je u Paskalima (Pa), iako je praktičnije koristiti 105 Pa ili kilopaskal (kPa).

Afrometri mogu imati različite klase manometara. Klasa manometra je preciznost očitavanja u odnosu na celu skalu izražena u procentima (npr. manometar od 1000 kPa klase 1 znači da se maksimalni pritisak od 1000 kPa može očitati unutar ± 10 kPa). Uređaj klase 1 preporučuje se za precizna merenja. Afrometri moraju biti redovno proveravani (barem jednom godišnje).

2) Postupak

Merenja se moraju vršiti na bocama čija se temperatura stabilizovala najmanje 24 sata. Nakon što je čep probušen, boca se mora jako promućkati sve dok pritisak na postane konstantan, tada se očita.

3) Iskazivanje rezultata

Pritisak na 20°C (Paph20) izražava se u Paskalima (Pa) ili kilopaskalima (kPa).

Rezultat bi trebalo da se izrazi u obliku koji je u skladu sa preciznošću manometra (npr. 6,3 x 105 Pa ili 630 kPa, a ne 6,33 x 105 Pa ili 633 kPa za manometar klase 1 sa punom skalom do 1000 kPa).

Ako je temperatura na kojoj je izvedeno merenje različita od 20°C mora se uraditi korekcija množenjem izmerene vrednosti pritiska sa koeficijentom:

Paph20 / Paph t

datim u tabeli 14. ovog priloga. Na taj način dobija se rezultat na 20°C.

12.3. Odnos između pritiska i količine ugljen dioksida u gaziranom vinu

Iz pritiska na 20°C (Paph20) izračuna se apsolutni pritisak na 20°C (Pabs20) pomoću formule:

Pabs20 = Patm + Paph20

gde je Patm atmosferski pritisak izražen u barima.

Količina ugljen dioksida u vinu data je sledećim odnosima:

- u litrama CO2 po litru vina:

0,987 × 10-5 × Pabs20 × (0,86 - 0,01 A) × (1 - 0,00144 S);

- u gramima CO2 po litru vina:

1,951 × 10-5 x Pabs20 × (0,86 - 0,01 A) × (1 - 0,00144 S)

gde je:

A - alkoholna jačina vina na 20°C;

S - količina šećera u g/l.

Tabela 14. Odnos pritiska Paph20 u penušavim vinima na 20°C i nadpritiska Paph20 na temperaturama od 0°C do 25°C

0	1,85	13	1,24
1	1,80	14	1,20
2	1,74	15	1,16
3	1,68	16	1,13
4	1,64	17	1,09
5	1,59	18	1,06
6	1,54	19	1,03
7	1,50	20	1,00
8	1,45	21	0,97
9	1,40	22	0,95
10	1,36	23	0,93
11	1,32	24	0,91
12	1,28	25	0,88

 

XIII. ODREĐIVANJE ŠEĆERA REFRAKTOMETROM

a) Princip metode

Indeks refrakcije na 20°C, izražen kao apsolutna vrednost ili kao maseni procenat saharoze, prikazan je u tabelama 16. i 17. ovog priloga, pomoću koga se dobija koncentracija šećera u gramima po litru i gramima po kilogramu šire, koncentrovane šire i rektifikovane koncentrovane šire.

b) Aparatura

Abbe-ov refraktometar koji mora imati skale u:

- masenim procentima saharoze sa podelom od 0,1%;

- ili u indeksima refrakcije na četiri decimalna mesta.

Refraktometar mora imati termometar sa skalom najmanje od +15°C do +25°C sa omogućenom cirkulacijom vode koja osigurava merenje pri temperaturi 20°C ± 5°C. Uputstvo za upotrebu aparata mora sadržati tačne instrukcije, posebno u vezi kalibracije i izvora svetlosti.

v) Priprema uzorka

- Šira i koncentrovana šira:

Po potrebi, šira se propusti kroz četvorostruko presavijenu suvu gazu i nakon odbacivanja prvih kapi filtrata, nastavlja se određivanje filtriranog proizvoda.

- Rektifikovana koncentrovana šira

U zavisnosti od koncentracije, koristi se ili rektifikovana koncentrovana šira ili rastvor dobijen tako što se 200 g rektifikovane koncentrovane šire razblaži sa vodom do 500 g, pri čemu sva merenja moraju biti tačno sprovedena.

g) Postupak:

Uzorak temperirati na blizu 20°C. Staviti malu količinu uzorka na donju prizmu refraktometra, pri čemu treba paziti (jer su prizme čvrsto pričvršćene jedna na drugu) da uzorak jednako pokriva staklenu površinu prizme. Merenje izvršiti u skladu sa uputstvima za upotrebu aparata.

Očitati maseni procenat saharoze unutar 0,1% ili indeks refrakcije na četiri decimalna mesta. Na istom uzorku napraviti najmanje dva određivanja. Zabeležiti temperaturu t°C.

d) Iskazivanje rezultata

1) Korekcija temperature

- Instrumenti sa skalom u masenim procentima saharoze: korekciju temperature izvršiti uz pomoć tabele 15. ovog priloga.

- Instrumenti sa skalom u indeksima refrakcije: indeks refrakcije izmeren na t°C pronaći u tabeli 16. ovog priloga, da se dobije (kolona I) odgovarajuća vrednost u masenim procentima saharoze na t°C. Ova vrednost je korigovana za temperaturu i izražena kao koncentracija na 20°C koristeći tabelu 15. ovog priloga.

2) Koncentracija šećera u širi i koncentrovanoj širi:

Odrediti maseni procenat saharoze na 20°C u tabeli 16. ovog priloga i iz istog reda očitati koncentraciju šećera u gramima po litru i gramima po kilogramu. Koncentracija šećera izražena je kao invertni šećer na jedno decimalno mesto.

3) Koncentracija šećera u rektifikovanoj koncentrovanoj širi

Odrediti maseni procenat saharoze na 20°C u tabeli 17. ovog priloga i iz istog reda očitati koncentraciju šećera u gramima po litru i gramima po kilogramu. Koncentracija šećera izražena je kao invertni šećer na jedno decimalno mesto.

Ako se merenje vrši na razređenoj rektifikovanoj koncentrovanoj širi, rezultat se množi sa faktorom razređenja.

4) Indeks refrakcije šire, koncentrovane šire i rektifikovane koncentrovane šire

Odrediti maseni procenat saharoze na 20°C u tabeli 16. ili 17. ovog priloga i iz istog reda pročitati indeks refrakcije na 20°C na četiri decimalna mesta.

Tabela 15. Korekcija masenog procenta saharoze određenoj pri temperaturi različitoj od 20°C

Tabela 16. Koncentracija šećera u širi i koncentrovanoj širi u gramima po
litru i gramima po kilogramu, određene refraktometrom, koji ima skalu u
masenim procentima saharoze na 20°C ili indeks refrakcije na 20°C.
Prikazana je i gustina na 20°C

Tabela 17. Koncentracija šećera u prečišćenoj širi u gramima po litru i gramima po kilogramu, određena refraktometrom, koji ima skalu u masenim procentima saharoze na 20°C ili indeks refrakcije na 20°C.
Prikazana je i gustina na 20°C

 

XIV. METODA SENZORNOG OCENJIVANJA VINA

Senzorne osobine vina ocenjuju se senzornim metodama.

Za ocenjivanje senzornih osobina vina koristi se metoda pozitivnih bodova (sistem od 0 do 100) tako da:

1) "stono" vino (vino bez geografskog porekla) i uvozno vino - moraju da imaju najmanje 39,00 bodova;

2) regionalno vino - najmanje 59,00 bodova;

3) kvalitetno vino sa kontrolisanim geografskim poreklom - najmanje 79,00 bodova;

4) vrhunsko vino sa kontrolisanim i garantovanim geografskim poreklom i kvalitetom - najmanje 89,00 bodova.

Senzorne osobine vina koje se vrednuju bodovima od 0 do 10 (0 - neprihvatljivo, 4 - loš kvalitet, 5 - prihvatljivo, 6 - prosečno, 7 - uobičajeno, 8 - dobro, 9 - vrlo dobro, 10 - odlično) jesu:

1) vizuelni opažaji:

(1) boja,

(2) bistrina;

2) olfaktivni opažaji:

(1) čistoća,

(2) finoća,

(3) intezitet;

3) gustativni opažaji:

(1) čistoća,

(2) struktura, telo, alkohol,

(3) harmonija, ravnoteža, intezitet;

4) gustativno-olfaktivni opažaji:

(1) održivost,

(2) karakteristike za odgovarajuću oznaku za vina sa geografskim poreklom i podudarnost sa vrstom, tipom vina ili karakteristikama sorte.

 

Prilog 2

DRUGE METODE ANALIZE

 

1. ODREĐIVANJE HLORIDA

(Tabela 1 - Metode analize za ispitivanje parametara kvaliteta šire, vina i drugih proizvoda (u daljem tekstu: Tabela 1), redni broj 5, referenca broj 2)

a) Upotrebljiva metoda

Reagensi:

1) Zasićeni rastvor KMnO4 (~ 6,5%);

2) 2 N azotna kiselina (HNO3);

3) 0,1 N srebro nitrat (AgNO3);

4) 0,1 N kalijum tiocijanat (KSCN);

5) feriamonijum sulfat (15 g u 100 ml) ili gvožđe nitrat (Fe(NO3)3) (10 g u 100 ml);

6) rastvor barijum hidroksida Ba(OH)2 (50 g u 1000 ml - skoro zasićen);

7) vodonik peroksid (H2O2);

8) dietil - etar.

Postupak:

U normalni sud od 200 ml doda se 100 ml prethodno neutralisanog vina sa rastvorom Ba(OH)2, u prisustvu fenolftaleina i dopuni destilovanom vodom do crte. Posle mešanja uzorak se filtrira kroz naborani filter papir (filter je ispran mlakom vodom). U erlenmajer od 500 ml doda se 100 ml filtrata, 20 ml 2 N HNO3 i 5 ml zasićenog rastvora KMnO4, promućka i ostavi da odstoji dok ne isčezne ljubičasta boja. Ukoliko boja ostane dodaje se nekoliko kapi rastvora vodonik peroksida (H2O2) dok ljubičasto obojenje ne isčezne. Bezbojnom filtratu dodati 10 ml 10% gvožđe nitrata, 20 ml dietil-etra i 10 ml 0,1 N rastvora AgNO3 (ove količine su dovoljne ako ispitivani uzorak sadrži manje od 1 g/l NaCl). Višak AgNO3 određuje se sa 0,1 N kalijum tiocijanatom. Završna tačka titracije se postiže kada slabo ciglasto crvena boja bude postojana 5 sekundi. Utrošeni mililitri su jednaki n.

Izračunavanje:

1) Količina hlorida u miliekvivalentima po litru vina (meq/l) dobija se sledećom formulom:

2 × f × (10 - n)

gde je:

f - korekcioni faktor 0,1 N rastvora kalijum tiocijanata;

n - utrošak u ml 0,1 N rastvora kalijum tiocijanata.

2) Količina hlorida u gramima NaCl po litru vina (g/l) dobija se sledećom formulom:

0,1169 × f × (10 - n)

gde je:

f - korekcioni faktor 0,1 N rastvora kalijum tiocijanata;

n - utrošak u ml 0,1 N rastvora kalijum tiocijanata.

2. ODREĐIVANJE SULFATA

(Tabela 1, redni broj 6, referenca br. 2. i 3)

Priznata metoda

a) Referentna metoda

Taloži se kao barijum sulfat i gravimetrijski se određuje. Vino se prethodno oslobađa sumporaste kiseline zagrevanjem bez prisustva vazduha.

b) Upotrebljiva metoda

Taloži se kao olovo sulfat i kompleksometrijski određuje.

a) Referentna metoda:

Reagensi:

- 2 N rastvor HCl;

- rastvor BaCl2: rastvoriti 100 g BaCl2 × 2H2O u 1000 ml destilovane vode.

Postupak:

Nakon destilacije ukupne sumporaste kiseline koja ostaje u tikvici, ostatak od 100 ml vina se zakiseli sa 5 ml 2 N HCl. Tečnost se kvantitativno prenosi u čašu od 500 ml i tikvica se ispira sa istom količinom vode, tako da ukupna zapremina iznosi 200 ml. Zatim se doda 5 ml 2 N HCl, i tečnost zagreva do ključanja i doda u kapima 10 ml rastvora BaCl2. Nastavi se sa zagrevanjem na temperaturi od 60°C ili 2 sata na ključalom vodenom kupatilu do potpunog taloženja BaSO4. Kod manjih količina BaSO4 talog se ostavlja da se istaloži na hladnom preko noći, a zatim se filtrira kroz filter papir koji ne ostavlja pepeo, talog se ispira, a zatim se suši sa filterom i spali u pećnici za žarenje, ohladi u eksikatoru do konstantne mase, i odmah zatim meri.

Izračunavanje:

1) Količina sulfata u miliekvivalentima po litru vina (meq/l) dobija se sledećom formulom:

85,68 × m

gde je:

m - izmerena količina BaSO4 u mg.

2) Količina sulfata u gramima K2SO4 po litru vina (g/l) dobija se sledećom formulom:

7,465 × m

gde je:

m - izmerena količina BaSO4 u mg.

b) Upotrebljiva metoda:

Reagensi:

1) HNO3, koncentrovana 65% (d = 1,40);

2) reagens za taloženje: rastvoriti 25 g PbNO3 u 100 ml destilovane vode i dodati 1,5 ml koncentrovanu HNO3;

3) tečnost za pranje: isti delovi razblažene HNO3 (5 ml koncentrovane HNO3 u 100 ml destilovane vode) i 96% vol etanol se pomešaju neposredno pre upotrebe;

4) rastvor kompleksona III: 0,1 M dinatrijum etilen di-amin tetra sirćetne kiseline (rastvoriti 37,22 g di-natrijumove soli dihidrata etilen diamin tetra sirćetne kiseline u 1000 ml destilovane vode);

5) rastvor pufera: 54 g amonijum hlorida i 350 ml koncentrovanog amonijaka (25%) dopuni se destilovanom vodom do 1000 ml;

6) indikator: isitniti do praha u avanu eriohrom crno T i NaCl u odnosu 1:500;

7) 0,1 M rastvor ZnCl2: rastvori se 13,7 g bezvodnog ZnCl2, uz dodatak od nekoliko kapi HCl, sa destilovanom vodom do 1000 ml.

Postupak:

25 ml vina se sipa u kivetu za centrifugu i podesi se sa nekoliko mililitara etanola (96% vol) na alkoholnu jačinu od približno 20% vol i zatim doda 0,6 ml koncentrovane HNO3 i 1 ml reagensa za taloženje (1 ml PbNO3 odgovara količini od 5 g K2SO4 u 1 litru vina). Nakon dodavanja reagensa za taloženje, kivetu dobro promućkati i ostaviti najmanje 30 minuta kako bi se izdvojio talog PbSO4. Nakon 30 minuta, uzorak se centrifugira, supernant se odlije, a talog se ispere sa tečnošću za pranje i ponovo centrifugira (ovaj korak ponoviti dva puta). Nakon ispiranja i centrifugiranja talog se kvantitativno, uz korišćenje staklenog štapića sa gumom na vrhu i 50 ml destilovane vode, prenosi u erlenmajer u kome se nalazi 5 ml rastvora kompleksona III. Posle dodatka 2 ml rastvora pufera i dodatka nekoliko kristala indikatora vrši se titracija sa 0,1 M rastvorom ZnCl2 do promene boje iz plave u vinsko crvenu.

Izračunavanje:

1) Količina sulfata u miliekvivalentima po litru vina (meq/l) dobija se sledećom formulom:

2 × f × (10 - n)

gde je:

f - korekcioni faktor 0,1 M rastvora ZnCl2;

n - utrošak u ml 0,1 M rastvora ZnCl2.

2) Količina sulfata u gramima K2SO4 po litru vina (g/l) dobija se sledećom formulom:

0,697 × f × (5,00 - n)

gde je:

f - korekcioni faktor 0,1 M rastvora ZnCl2;

n - utrošak u ml 0,1 M rastvora ZnCl2.

3. ODREĐIVANJE LIMUNSKE KISELINE

(Tabela 1, redni broj 12, referenca broj 2)

a) Upotrebljiva metoda

Princip metode:

Metoda se zasniva na transformaciji limunske kiseline do penta-brom-acetona, njegovim ekstrahovanjem sa hloroformom, pa tretiranjem sa rastvorom cijanida i reagensom piridin-barbiturnom kiselinom.

Reagensi:

1) Sumporna kiselina (1:10);

2) meta fosforna kiselina 40% rastvor;

3) kalijum bromid KBr 12% rastvor;

4) kalijum permanganat KMnO4 5% rastvor;

5) vodonik peroksid H2O2 3% rastvor;

6) hloroform CHCl3 p.a;

7) kalijum cijanid KCN 1% rastvor;

8) mešani reagens piridin-barbiturna kiselina.

Pribor:

1) Pipete od 1, 2, 5 i 10 ml;

2) epruvete;

3) epruvete sa šlifovanim čepom;

4) levak za odvajanje od 100 ml;

5) UV - VIS spektrofotometar;

6) hronometar.

Normativ po jednoj analizi iznosi: 1 ml sumporne kiseline (1:10), 0,24 ml 40% meta fosforne kiseline, 0,25 ml 12% kalijum bromida, 2 ml 5% kalijum permanganata, nekoliko kapi 3% vodonik peroksida, 5 ml hloroforma p.a, 3 ml 1% kalijum cijanida, 1 ml mešanog reagensa i oko 100 ml demineralizovane vode.

Priprema reagensa:

Svi gore navedeni reagensi se pripremaju u vidu odgovarajućih vodenih rastvora.

Priprema mešanog reagensa: odmeriti 3 g barbiturne kiseline i rastvoriti je u čaši od 100 ml sa 15 ml zagrejane demineralizovane vode. Zatim dodati 15 ml piridina, promešati i dodati još 3 ml koncentrovane hlorovodonične kiseline (HCl). Sve kvantitativno preneti u normalni sud od 50 ml i dopuniti do crte demineralizovanom vodom. Rastvaranje i mešanje ovih hemikalija obavezno raditi u digestoru. Potrebno je reagens češće praviti, jer se stajanjem menja i postaje zagasito žut.

Priprema uzorka:

Kod penušavih vina odstraniti ugljen dioksid.

Postupak:

U normalni sud od 100 ml odmeriti 10 ml vina i dopuniti destilovanom vodom do crte. Odatle uzeti alikvot od 5 ml, sipati u levak za odvajanje pa dodati još 1 ml (1:10) sumporne kiseline, 0,24 ml 40% meta fosforne kiseline, 0,25 ml 12% kalijum bromida, 2 ml 5% kalijum permanganata i potom promućkati 15 minuta. Nakon završetka oksidacije, ukloniti višak kalijum permanganata dodavanjem 3% rastvora vodonik peroksida sve dok rastvor ne postane bezbojan. Posle obezbojavanja u levak se dodaje 5 ml hloroforma i energično promućka. U epruvetu se potom ispusti donji hloroformni sloj 4,5 ml i odatle odpipetira 1 ml u epruvetu sa šlifom, kojoj se doda još 3 ml 1% kalijum cijanida. Epruveta se zatvori i energično promućka, te nakon toga rastvoru doda 1 ml mešanog reagensa piridin-barbiturne kiseline i sve ponovo promeša i ostavi da odstoji 15 minuta. Nakon stajanja, rastvoru dodati 6 ml destilovane vode, zatvoriti i promešati. Za očitavanje na spektrofotometru uzeti gornji bistri sloj. Očitavanje se obavlja na talasnoj dužini od 584 nm.

Očitavanje uzorka bi trebalo obaviti u vremenskom periodu između 20 i 30 minuta po dodavanju reagensa (piridin-barbiturna kiselina). Uz analizu vina obavezno je da se na isti način tretira i kontrolna proba (5,0 ml destilovane vode uz dodavanje svih reagenasa) i da se očitavanje analiziranog uzorka vrši u odnosu na kontrolnu probu. Kontrolna proba je bezbojna ili svetlo žućkasto obojena, što ne utiče na očitavanje purpurne boje uzorka.

Ako uzorak vina sadrži veću količinu limunske kiseline, uzima se manja količina hloroformnog ekstrakta (npr. 0,5 + 0,5 ml čistog hloroforma), a dobijeni rezultati se množe sa 2.

Priprema kalibracione krive:

Matični rastvor:

Odmeriti 0,1094 g limunske kiseline (C6H8O7 × H2O), rastvoriti i kvantitativno preneti u normalni sud od 100 ml. Dopuniti do crte destilovanom vodom, zatvoriti i dobro promešati. 1 ml matičnog rastvora sadrži 1 mg limunske kiseline (bezvodne).

Pripremiti 5 normalnih sudova od 100 ml i obeležiti ih sa brojevima od 1 do 5 i od matičnog rastvora odmeriti pipetom sledeće količine: 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 i 7,5 ml i dopuniti ih destilovanom vodom do 100 ml.

Na ovaj način pripremljeni radni standardi odgovaraju sledećim koncentracijama limunske kiseline: 50, 100, 250, 500 i 750 mg/l.

Od pripremljenih radnih standarda odpipetirati po 5,0 ml svakog standarda u pojedinačno odgovarajuće levkove za izdvajanje i zatim dodati reagense u istim količinama i istim redom, kako je to prethodno opisano kod analize ispitivanog uzorka vina. Pri ustanovljavanju kalibracione krive obavezno uključiti i kontrolnu probu kao što je to učinjeno i kod uzorka vina. Najveća koncentracija limunske kiseline ne bi trebalo da pređe 750 mg/l, jer se do te granice obojeni rastvor vlada po zakonu Lamber-Bera.

Izračunavanje:

Ukupna količina limunske kiseline izražava se u mg/l prema sledećoj formuli:

C = A × F

gde je:

A - očitana apsorbancija;

F - 394,56 faktor dobijen iz kalibracione krive iz odnosa S/A (videti časopis Jugoslovensko vinogradarstvo i vinarstvo 2 - 3 1986).

Izražavanje rezultata:

Rezultat se izražava na dve decimale (0,00) u mg/l.

4. ODREĐIVANJE KALIJUMA

(Tabela 1, redni broj 16, referenca br. 4. i 5)

U 100 ml destilovane vode doda se 2 ml 10% H2SO4 i u svaki uzorak se dodaje i sipa u normalne sudove od 25 ml.

Reagensi:

1) Kalignost: 3 g kalignosta se rastvori i dopuni do 100 ml i doda nekoliko stotih delova grama aluminijum oksida (neutralnog);

2) zasićeni vodeni rastvor brom krezol-zelenog;

3) 10% sumporne kiseline (H2SO4);

4) 1 N natrijum hodroksid (NaOH).

Postupak:

25 ml vina se ižari u pećnici za žarenje na temperaturi od 525 (± 25 °C). Pepeo mora biti potpuno beo. Dobijeni pepeo se rastvara sa 20 ml destilovane vode u koju je dodato 0,5 ml 10% H2SO4, rastvaranje se ponovi 2 do 3 puta uz ispiranje i zatim kvantitativno prenese u normalni sud od 25 ml i dopuni destilovanom vodom do crte. Rastvor se dobro promućka i filtrira (crvena ili plava traka). 10 ml filtrata se prenese u erlenmajer od 100 ml i doda 1 kap indikatora brom-krezol-zelenog i toliko 1 N NaOH dok se ne postigne pH vrednost u opsegu od 4 do 5 (pojava svetlo zelene boje). Potom se sadržaj zagreje na 50ºC na vodenom kupatilu uz mućkanje i konstantno dodavanje u kapima 5 ml 3% rastvora kalignosta. Posle hlađenja beli talog se filtrira preko B-4 filtera, a zatim se talog ispira vodom kojoj je dodat kalignost (2 ml 3% kalignosta dodaje sa na 100 ml vode). Beli talog se ponovo filtrira preko B-4 filtera, a zatim suši u sušnici na 110°C u vremenu od 1 sata do konstantne mase i meri. Nakon merenja talog se ispira 3 puta sa acetonom (talog na guču). Guč se opet suši i meri na analitičkoj vagi. Razlika između dva merenja daje masu tetra fenil kalijuma (p je masa taloga).

Izračunavanje:

Količina kalijuma izražava se u gramima po litru i dobija se sledećom formulom:

10,91 × p

gde je:

p - masa taloga.

5. ODREĐIVANJE GVOŽĐA

(Tabela 1, redni broj 19, referenca broj 4)

a) Određivanje gvožđa kolorimetrijski - upotrebljiva metoda

Princip:

Gvožđe redukovano sa hidroksilamin-hidrohloridom reaguje sa orto-fenantrolinom koji je dodat vinu. Intenzitet nastale boje meri se na talasnoj dužini od 508 nm. Količina gvožđa se očitava iz prethodno napravljene kalibracione krive.

U slučaju intenzivno obojenih crvenih vina koristi se metoda određivanja gvožđa iz pepela.

Reagensi:

Rastvor 1:

- HCl koncentrovana (d = 1,19) 170 ml;

- hidroksilamin-hidrohlorid 10 g;

- destilovana voda do 1000 ml.

Rastvor 2:

- O-fenantrolin 1 g;

- destilovana voda do 100 ml.

Jedan gram (1 g) O-fenantrolina u 80 ml destilovane vode zagrejati na 80°C i dodati koncentrovanu HCl samo toliko da se o-fenantrolin rastvori.

Rastvor 3:

- Amonijum acetat 180 g;

- destilovana voda do 1000 ml.

Napomena: Tragovi gvožđa u vodi ili u reagensima ne utiču na tačnost rezultata analize. Nasuprot rastvoru hidrohinona, rastvor hidroksilamin-hidrohlorida je održiv u toku više meseci.

Postupak:

U dva normalna suda od 50 ml doda se 10 ml vina i 10 ml rastvora 1. U jedan od ovih normalnih sudova doda se još i 1 ml rastvora 2. Posle 10 minuta doda se u oba normalna suda 10 ml rastvora 3. Dok se slepa proba ne menja ili slabo poprima sivu boju, rastvor u mernom sudu kome je dodat rastvor 2 poprima odmah crevenu-oranž boju. Sudovi se dopune destilovanom vodom do crte i vrši se određivanje intenziteta boje tečnosti u odnosu na slepu probu na talasnoj dužini od 508 nm. Količina gvožđa u mg po 1 litru vina očitava se iz kalibracione krive koja se priprema na sledeći način.

Priprema kalibracione krive:

Jedan gram (1 g) gvozdenih opiljaka rastvori se na toplom u 250 ml 20% H2SO4 (sprečiti gubitak prskanjem). Posle hlađenja rastvor se dopunjava do 1 litar i predstavlja matični rastvor.

Matični rastvor se takođe može pripremiti korišćenjem Morove soli poznatog sastava. Za Morovu so (čistoće 100%) važi sledeći odnos: 1 g = 7,018 g gvožđa Morove soli (mereno na vazduhu).

Uzeti 20 ml matičnog rastvora i dopuniti destilovanom vodom do 1 litra. 1 ml razblaženja sadrži 0,02 mg gvožđa. Kalibraciona kriva se konstruiše tako da se sadržaj gvožđa kreće od 2 do 20 mg/l. U tom smislu dodaje se u normalnim sudovima od 50 ml od 1 do 10 ml razblaženja, 10 ml rastvora 1 i 1 ml rastvora 2. Posle 10 minuta u normalne sudove doda se po 10 ml rastvora 3 i normalni sudovi se dopune destilovanom vodom do crte. Merenje se obavlja u odnosu na slepu probu, koja se priprema mešanjem 10 ml rastvora 1 i 10 ml rastvora 3, a zatim dopuni destilovanom vodom do 50 ml (slepa proba ne sadrži rastvor 2). Na osnovu dobijenih vrednosti konstruiše se kalibraciona kriva koja predstavlja pravu liniju. Sadržaj gvožđa se izražava u mg/l.

Korekcija kalibracione krive:

Može se desiti, da uprkos korektnom načinu rada dobijene vrednosti ne leže na pravoj. Razlog za to može biti nedovoljna osetljivost fotometra. U takvim slučajevima ne treba vršiti dalja merenja, već se primenjuju dobijene vrednosti za obračun metodom najmanjeg kvadrata verovatnih vrednosti konstante A i k prema jednačini:

Y = log y = A - kx

gde y predstavlja transmisiju u %, a x sadržaj gvožđa u mg/l. Potom se obračunavaju vrednosti Y1 i Y2 koje odgovaraju proizvoljno biranim vrednostima x1 i x2.

Osnovni prikaz: k1 = 0 i k2 = 10.

Kalibraciona kriva se pravi tako što se na milimetarskom papiru kroz koordinatne tačke (x1, Y1) i (x2, Y2) povlači prava. Prava prolazi kroz nultu tačku samo ukoliko primenjeni reagensi ne sadrže gvožđe.

Specijalni slučajevi:

Vina sa visokim sadržajem gvožđa

Preporučljiva je, ali ne bezuslovno potrebna, primena kiveta različitih debljina, pri kojima je određena kalibraciona kriva konstruisana. Mora se uzeti u obzir činjenica da Lamber-Berov zakon važi samo za vrednosti u opsegu od 20 do 200 μg (u 50 ml). Ukoliko je obojenje jako, ponoviti određivanje sa većim razblaženjem (najpovoljnije vrednosti za transmisiju jednog određivanja nalaze se između 30% i 70%, što odgovara ekstinkcijama između 0,15 i 0,5). Sadržaji oba normalna suda mogu takođe biti razblaženi rastvorom npr. 1 : 2 ili 1 : 5 koji se dobija mešanjem sledećih rastvora:

Rastvor 1	1 deo
Rastvor 3	1 deo
Destilovana voda	3 dela.

Jako obojena crvena vina

Kod jako obojenih crvenih vina metoda postaje neosetljiva, mada teoretski, tačnost ostaje nepromenjena. Intenzitet svetlosti koja se od strane gvožđe-II-fenantrolina apsorbuje predstavlja samo jedan mali deo ukupne apsorpcije tako da rezultati bivaju nepouzdani. U tom slučaju se preporučuje ispitivanje sa malom količinom vina ili analizu obaviti na pepelu. Po dole opisanim uslovima sprovedena analiza ne bi trebalo da uslovljava gubitke za više od 5%.

b) Određivanje gvožđa iz pepela

U platinskoj šolji promera 8 cm otpipetira se 10 ml vina i na vodenom kupatilu upari do suvog i osuši u sušnici na 110°C do 120°C. Da bi se sprečilo topljenje pepela žarenje se vrši preko malog plamena ili u peći za žarenje. U slučaju potrebe vlažiti pepeo vodom, sušiti i ponovo žariti. Posle hlađenja rastvoriti pepeo laganim vlaženjem u 10 ml rastvora 1 i ostaviti šolju nekoliko minuta na vodenom kupatilu. Posle 3 do 5 minuta preneti rastvor u normalni sud od 50 ml, isprati šolju 3 puta sa 2 do 5 ml vode i dodati vodu rastvoru. Posle hlađenja doda se 1 ml rastvora 2. Posle 15 minuta doda se 10 ml rastvora 3, dopuni destilovanom vodom do crte i vrši određivanje na gore opisan način. Pripremi se takođe i slepa proba. Merenje se obavlja u odnosu na slepu probu koja se priprema mešanjem 10 ml rastvora 1 i 10 ml rastvora 3, a zatim dopuni destilovanom vodom do 50 ml (slepa proba ne sadrži rastvor 2).

6. ODREĐIVANJE UKUPNOG FOSFORA KAO P2O5

(Tabela 1, redni broj 32, referenca broj 2)

Reagensi:

1) Perhlorna kiselina 60% p.a;

2) HNO3 65 % p.a;

3) koncentrovana H2SO4 p.a;

4) rastvor molibdat-vanadata: 20 g amonijum-molibdata p.a. rastvoriti u 400 ml destilovane vode temperature od 50°C i ohladiti. 1 g amonijum-vanadata p.a. rastvoriti u 300 ml ključale destilovane vode i nakon hlađenja uz mešanje dodati 140 ml HNO3 65% p.a. Rastvor molibdata uz mešanje i u malim porcijama dodati rastvoru vanadata i mešavinu dopuniti destilovanom vodom do 1000 ml;

5) kalijum hidrogen fosfat (KH2PO4 p.a.) sušiti u sušnici dva sata na 105°C, pa ohladiti u eksikatoru.

Postupak:

Sagorevanje (a):

2 ml ispitivane tečnosti otpipetirati u epruvetu i dodati nekoliko perli (uzorke koji sadrže alkohol prethodno upariti na polovinu - na 1 ml). Zatim dodati 1 ml perhlorne kiseline i 1,5 ml HNO3 (65% p.a.) i oprezno zagrevati na plameniku (peščanom kupatilu). Kada počne da ugljeniše dodati ponovo 0,5 ml HNO3 (65% p.a.) i zagrevanje nastaviti dok se ne dobije potpuno bistar i bezvodan rastvor. Upariti na 0,5 ml. Nakon hlađenja rastvor se sa 30 ml destilovane vode kvantitativno prenese u normalni sud od 50 ml. Pripremiti slepu probu na isti način sa 1 ml perhlorne kiseline i 1,5 ml HNO3 (65% p.a.).

Merenje (b):

Rastvoru u normalnom sudu od 50 ml dodati 10 ml rastvora molibdat-vanadata, dopuniti destilovanom vodom do crte i dobro promućkati. Ostaviti da stoji 10 minuta. Slepu probu (b) pripremiti dopunjavanjem 10 ml rastvora molibdat-vanadata i dopuniti destilovanom vodom do 50 ml. Ekstinkcija uzorka (a) na 400 nm meri se u odnosu na slepu probu (b).

Kalibraciona kriva (v):

Osnovni rastvor sadrži 1000 mg fosfora po 1 litru, rastvaranjem 4,3937 g osušenog kalijum hidrogen fosfata u destilovanoj vodi dodavanjem koncentrovane H2SO4 i dopunjavanjem destilovanom vodom do 1000 ml. Uzeti 10 ml od ovog rastvora i razblažiti do 500 ml, a zatim od ovoga rastvora uzimati 5, 10, 15, 20, 25 ml i preneti u normalne sudove od 50 ml, dodati po 10 ml rastvora molibdat-vanadata i dopuniti destilovanom vodom do crte. Pripremljene rastvore ostaviti da odstoje 10 minuta. Pripremljeni rastvori imaju koncentracije fosfora: 2, 4, 6, 8 i 10 μg / ml. Izmeriti ekstinkcije ovih rastvora u odnosu na slepu probu (b) i formirati kalibracionu krivu. Sadržaj fosfora se očitava iz kalibracione krive. Dobijena vrednost u μg fosfora u 2 ml osnovnog uzorka i deljenjem sa 2 dobija se sadržaj fosfora u mg/l. Množenjem dobijene vrednosti sadržaja fosfora sa 3,0665 dobija se sadržaj fosfata PO42-.

7. ODREĐIVANJE SADRŽAJA METANOLA

(Tabela 1, redni broj 37, referenca broj 3)

Princip metode:

Ispitivana tečnost (vino), se najpre zagrevanjem sa alkalnim rastvorom srebro nitrata oslobodi aldehida i terpena. Potom metanol sa kalijum permanganatom biva oksidisan u kiseloj sredini u formaldehid, koji sa hromotropnom kiselinom i koncentrovanom sumpornom kiselinom daje obojenje čiji se intenzitet meri.

Reagensi:

1) Kalijum permanganat-fosforna kiselina:

- rastvor A: 52,6667 g kalijum permanganata p.a. rastvori se u toploj destilovanoj vodi i nakon hlađenja dopuni destilovanom vodom do 1000 ml,

- rastvor B: oko 200 g koncentrovane ortofosforne kiseline p.a. dopuni se destilovanom vodom do 1000 ml. 10 ml od ovog rastvora titrira se sa 1N rastvorom NaOH uz indikator fenolftalein. Dodavanjem destilovane vode ili fosforne kiseline rastvor se podešava tako da se za 10 ml rastvora troši 30 ml 1N rastvora NaOH,

- prema potrebi se 60 ml rastvora A pomeša tj. dopuni do crte (100 ml) sa rastvorom B;

2) rastvor oksal-sumporne kiseline: 15,75 g oksalne kiseline p.a. i 25 ml koncentrovane sumporne kiseline rastvoriti destilovanom vodom i dopuniti do 250 ml;

3) rastvor hromotropne kiseline: 300 mg hromotropne kiseline p.a. rastvoriti u 20 ml destilovane vode. Rastvor se priprema neposredno pre upotrebe;

4) koncentrovana sumporna kiselina p.a. (najmanje 81% m/m);

5) etanol (25% vol). Priprema se iz etanola p.a;

6) 1N srebro nitrat (AgNO3);

7) 30% kalijum hidroksid (KOH).

Postupak:

Ukoliko se količina alkohola u vinu označi sa "a" u % vol, tada se 250/a ml iz dobijenog destilata odmeri u pogodnu tikvicu sa šlifom i destilovanom vodom dopuni do 48 ml. Doda se 1,0 ml 1N AgNO3 i 0,5 ml rastvora KOH (30%), nekoliko staklenih perli i stavi na ključanje 30 minuta na povratnom hladnjaku. Nakon hlađenja hladnjak se odozgo ispira nekoliko puta sa ukupno 10 ml destilovane vode, da bi se sprali ostaci alkohola u tikvici. Sada se ova tikvica sa šlifom postavi na aparat za destilaciju i sadržaj se lagano destiluje u normalni sud od 50 ml. Destilat se na 20ºC dopuni sa destilovanom vodom do 50 ml. Tako dobijeni destilat sadrži tačno 5% vol alkohola.

2,0 ml ovog destilata se u cilindru za mešanje sa šlifom (oznakom na 10 ml) izmeša sa 5,0 ml rastvora kalijum permanganata u fosfornoj kiselini, uz povremeno otvaranje cilindra (epruvete) radi provetravanja. Nakon stajanja od 15 minuta doda se 2,0 ml oksal-sumporne kiseline i brzo promućka. Usled jakog oslobađanja ugljen dioksida, odmah nakon mešanja zapušač se skida i ovlaš postavi. Nakon 15 minuta rastvor je potpuno bezbojan i bistar. Ukoliko je još mala količina mangan dioksida ostala nerastvorena, tada se cilindar dobro zatvori i 2 do 3 puta sadržaj pažljivo izmeša i zapušač ponovo skida radi provetravanja. Obezbojenom rastvoru se sada dodaje 1,0 ml destilovane vode, zapušač čvrsto postavi i sadržaj više puta pažljivo promućka. Zapušač se odmah skida radi provetravanja od ugljen dioksida. Uklanjanje ugljen dioksida je potrebno kako bi se količina rastvora kasnije tačno odmerila. Sada se priprema rastvor hromotropne kiseline. 1,0 ml dobijenog reakcionog rastvora se izmeša u epruveti sa šlifom sa 1,0 ml hromotropne kiseline. Kružno se promućka i lagano doda 10 ml koncentrovane sumporne kiseline. Postavi se zapušač i sadržaj pažljivo promućka napred-nazad, pazeći da se ne pokvasi zapušač. Tada se postavlja epruveta 20 minuta u termostat na 60°C i potom brzo ohladi na 20°C. Merenje ekstinkcije dobijenog obojenog rastvora vrši se u kivetama debljine 10 mm prema vazduhu na talasnoj dužini od 570 nm. Iz ekstinkcije i kalibracione krive očitava se količina metanola u μg koja se nalazi u primenjenih 0,2 ml za analizu.

Konstruisanje kalibracione krive:

U tikvicu za određivanje jodnog broja sipa se malo destilovane vode i izmeri tačno na 4 decimale. Potom se doda 1,0 ml metanola i ponovo izmeri tačno, s tim što se prethodno (nakon sipanja metanola) vrši kružno mešanje metanola i vode i postavljanje zapušača. Razlika u težini nam daje tačnu količinu metanola. Rastvor se tada kvantitativno prenosi u normalni sud od 1 litra i destilovanom vodom dopuni do crte. Potom se pipetira 5, 10, 15, 20 i 25 ml od ovog osnovnog rastvora i nakon dodatka 10 ml 25% vol etanola na 20°C u normalnom sudu od 50 ml dopuni destilovanom vodom do crte. Po 2 ml rastvora ovih standardnih rastvora uzima se za razvijanje boje i dobijanje kalibracione krive po već opisanom postupku. Ova kriva se ne završava u nultoj tački kordinatnog sistema. Na kalibracionoj krivi nanete količine metanola u mikrogramima sadrže razblaženje, ukoliko se u mg izražena odvaga metanola podeli sa 100 i pomnoži sa 2, 4, 6, 8 i 10. Jednom slepom probom (10 ml 25% etanola dopuniti destilovanom vodom do crte u normalnom sudu od 50 ml) moguće je uveriti se da primenjeni etanol meren prema vazduhu ne daje višu ekstinkciju od 0,08-0,09.

Izračunavanje:

U jednom litru ispitivane tečnosti sadržana količina metanola u miligramima dobija se množenjem iz kalibracione krive očitane vrednosti miligrama metanola sa volumnim procentima alkohola vina. Metanol se izražava u g/l na dve decimale.

Prilog 3

SPECIJALNE I POSEBNE METODE ANALIZE REKTIFIKOVANE KONCENTROVANE ŠIRE

 

1. SPECIJALNE METODE ANALIZE REKTIFIKOVANE KONCENTROVANE ŠIRE

a) Alil izotiocijanati

1) Princip metode

Ako je alil izotiocijanat prisutan u vinu, sakupiti ga destilacijom i identifikovati gasnom hromatografijom.

2) Reagensi

(2.1) Apsolutni etanol.

(2.2) Standardni rastvor: rastvor alil izotiocijanata u apsolutnom alkoholu, koji sadrži 15 mg alil izotiocijanata po litru.

(2.3) Mešavina za smrzavanje koju čine etanol i suvi led (temperatura -60°C).

3) Aparatura

(3.1) Aparatura za destilaciju, kako je prikazana na slici 1 - Aparatura za destilaciju sa protokom azota. Aparaturom neprekidno struji azot.

(3.2) Grejni plašt sa termostatom.

(3.3) Merač protoka.

(3.4) Gasni hromatograf sa detektorom plamenog spektrofotometra, opremljen selektivnim filterom za jedinjenja sumpora (talasna dužina = 394 nm), ili bilo kojim drugim prikladnim detektorom.

(3.5) Hromatografska kolona od nerđajućeg čelika unutrašnjeg prečnika 3 mm i dužine 3 m, ispunjena Carbowax-om 20M pri 10% na Chromosorb-u WHP, 80-100 mesh.

(3.6) Mikrošpric, 10 μl.

4) Postupak

Staviti dva litra vina u balon za destilaciju, dodati nekoliko mililitara etanola (tačka 2) podtačka (2.1) ovog pododeljka) u dve epruvete za prikupljanje kako bi porozni delovi štapića za raspršivanje gasa bili potpuno uronjeni. Ohladiti spolja 2 epruvete pomoću mešavine za smrzavanje. Spojiti balon za destilaciju sa epruvetama za prikupljanje i započeti sa ispiranjem aparature azotom uz protok od 3 litra na sat. Zagrejati vino na 80°C pomoću grejnog plašta, destilisati i prikupiti 45-50 ml destilata.

Stabilizovati hromatograf. Preporučuje se uspostavljanje sledećih uslova:

- temperatura injektora: 200°C;

- temperatura kolone: 130°C;

- brzina protoka gasa nosioca helijuma: 20 ml/min.

Pomoću mikrošprica injektovati količinu standardnog rastvora kako bi se na gasnom hromatografy mogao lako identifikovati pik koji odgovara alil izotiocijanatu. Na sličan način injektovati alikvot destilata u hromatograf. Proveriti da li retenciono vreme dobijenog pika odgovara piku alil izotiocijanata.

U gore opisanim uslovima, jedinjenja koja su prirodno prisutna u vinu ne stvaraju interferirajuće pikove na xromatogramu rastvora uzorka.

Slika 1 - Aparatura za destilaciju sa protokom azota

2. POSEBNE METODE ANALIZE ZA REKTIFIKOVANU KONCENTROVANU ŠIRU

a) Ukupni katjoni

1) Princip

Tretirati ispitivani uzorak jako kiselim katjonskim izmenjivačem. Katjoni se smenjuju sa H+. Ukupni katjoni izražavaju se kao razlika između ukupnih kiselina eluata i ispitivanog uzorka.

2) Aparatura

(2.1) Staklena kolona unutrašnjeg prečnika 10-11 mm i dužine oko 300 mm sa pipcima.

(2.2) pH metar sa skalom kalibrisanom u jedinicama pH sa tačnošću od barem 0,1 pH jedinice.

(2.3) Elektrode:

- Staklena elektroda, koja se drži u destilovanoj vodi;

- referentna kalomel elektroda (zasićeni kalijum hlorid), koja se drži u zasićenom rastvoru kalijum hlorida; ili

- kombinovana elektroda, koja se drži u destilovanoj vodi.

3) Reagensi

(3.1) Jako kisela katjonska izmenjivačka smola u obliku H+, koja je tokom noći ostavljena u vodi kako bi nabubrila.

(3.2) Rastvor natrijum hidroksida, 0,1 M.

(3.3) Papirni indikator pH.

4) Postupak

(4.1) Priprema uzorka

Koristiti rastvor koji se dobija razređivanjem rektifikovane koncentrovane šire na 40% (m/v): u normalni sud od 500 ml staviti tačno 200 g izmerene rektifikovane koncentrovane šire, dopuniti destilovanom vodom do crte i homogenizovati.

(4.2) Priprema jonoizmenjivačke kolone

Uliti u kolonu oko 10 ml nabubrelog jono-izmenjivača u obliku H+. Isprati kolonu destilovanom vodom dok se kiselina u potpunosti ne ukloni i koristiti papirni indikator kao pomoć pri proveri.

(4.3) Izmena jona

Propustiti kroz kolonu 100 ml rastvora rektifikovane koncentrovane šire, pripremljene u skladu sa podtačkom (4.1) ove tačke, i to brzinom od 1 kapljice u sekundi. Sakupiti eluat u čašu. Isprati kolonu sa 50 ml destilovane vode. Titrirati kiselinu u eluatu (uključno sa vodom za ispiranje) pomoću 0,1 M rastvora natrijum hidroksida dok pH ne bude 7, na temperaturi od 20°C. Alkalni rastvor se dodaje polako, pa je rastvor potrebno neprekidno mućkati. Zapreminu 0,1 M upotrebljenog rastvora natrijum hidroksida označiti sa n ml.

5) Izražavanje rezultata

Ukupni katjoni se izražavaju u miliekvivalentima po kilogramu (meq/l) ukupnog šećera do jednog decimalnog broja.

(5.1) Proračun

- Kiselost eluata izraženog u miliekvivalentima po kilogramu (meq/kg) rektifikovane koncentrovane šire:

gde je E = slobodni sumpor dioksid u miligramima po litru iznosi 2,5 n.

- Ukupne kiseline rektifikovane koncentrovane šire u miliekvivalentima po kilogramu: a.

- Ukupni katjoni u miliekvivalentima po kilogramu ukupnog šećera:

((2,5 n-a) / (P)) × 100

P = masena koncentracija ukupnog šećera (% m/m).

b) Provodljivost

1) Princip

Električna provodljivost kolone tečnosti, što se određuje dvema uporednim elektrodama od platine na krajevima, meri se tako da se spoji sa 01:00 granom Wheatstone mosta.

Provodljivost varira u zavisnosti od temperature, pa se zato izražava na temperaturi od 20°C.

2) Aparatura

(2.1) Merač provodljivosti koji omogućava merenje u rasponu 1-1000 mikrosimensa na cm (μS cmˉ¹).

(2.2) Vodeno kupatilo sa kojim se temperatura uzoraka za analizu dovodi na oko 20°C (20 ± 2°C).

3) Reagensi

(3.1) Demineralizovana voda određene provodljivosti manje od 2 μS cmˉ¹ pri temperaturi od 20°C.

(3.2) Referentni rastvor kalijum hlorida.

Rastvoriti 0,581 g kalijum hlorida (KCl), koji je prethodno bio osušen do konstantne mase na temperaturi od 105°C, u demineralizovanoj vodi (podtačka (3.1) ove tačke). Dopuniti demineralizovanom vodom (podtačka (3.1) ove tačke) do jednog litra. Provodljivost ovog rastvora iznosi 1000 μS cmˉ¹ pri temperaturi od 20°C. Rastvor se može koristiti najduže do tri meseca.

4) Postupak

(4.1) Priprema uzorka za analizu

Koristiti rastvor s ukupnom koncentracijom šećera od 25% (m/m) (25°Brix): izmeriti količinu jednaku 2500 / P i dopuniti demineralizovanom vodom do 100 g (tačka 3) podtačka (3.1) ovog pododeljka); gde je P = procenat (m/m) koncentracije ukupnog šećera u rektifikovanoj koncentrovanoj širi.

(4.2) Određivanje provodljivosti

Uzorak za analizu temperirati na vodenom kupatilu na temperaturi od 20°C. Održavati tu temperaturu uz odstupanje od ± 0,1°C. Isprati mernu ćeliju dva puta rastvorom koji se ispituje. Izmeriti provodljivost i iskazati rezultat u μS cmˉ¹.

5) Iskazivanje rezultata

Rezultat se iskazuje u mikrosimensima na cm (μS cmˉ¹) pri temperaturi od 20°C, zaokruženo na najbliži ceo broj, za 25% (m/m) (25°Brix) rastvor rektifikovane koncentrovane šire.

(5.1) Izračunavanje

Ako aparatura nema termostat, korigovati izmerenu provodljivost pomoću Tabele 1. Korektivne vrednosti ako temperatura nije 20°C (μS cmˉ¹). Ako je temperatura niža od 20°C, dodati korektivnu vrednost; ako je temperatura viša od 20°C, oduzeti korektivnu vrednost.

Tabela 1. Korektivne vrednosti ako temperatura nije 20°C (µS cm-1)

v) Hidroksimetil furfural (HMF)

Princip metoda

1) Kolorimetrijska metoda

Aldehidi dobijeni od furana, od kojih je najvažniji hidroksimetil furfural, reaguju sa barbiturnom kiselinom i p-toluidinom, pri čemu nastaje crveno jedinjenje koje se određuje kolorimetrijom pri 550 nm.

2) Tečna hromatografija visoke delotvornosti (HPLC)

Odvajanje kroz kolonu pomoću hromatografije na reverznoj fazi i određivanje pri 280 nm.

1) Kolorimetrijska metoda

(1.1) Aparatura

- Spektrofotometar za merenja između 300 i 700 nm;

- staklene kivete sa optičkim putem od 1 cm.

(1.2) Reagensi

- Barbiturna kiselina, 0,5% (m/v):

Rastvoriti 500 mg barbiturne kiseline (C4O3N2H4) u destilovanoj vodi i lagano zagrevati u vodenom kupatilu na temperaturu od 100°C. Dopuniti destilovanom vodom do 100 ml. Rastvor ostaje stabilan oko nedelju dana.

- Rastvor p - toluidina, 10% (m/v):

Staviti 10g p - toluidina (C6 H4 (CH3) NH2) u normalni sud od 100 ml; dodati 50 ml izopropanola CH3 CH (OH)CH3) i 10 ml ledene sirćetne kiseline (CH3COOH) (ρ20 = 1,05 g / ml). Dopuniti izopropanolom do 100 ml. Ovaj rastvor je potrebno ponovo pripremati iz dana u dan.

- Etanal (acetaldehid) (CH3CHO), 1% (m/v) vodeni rastvor:

Pripremiti neposredno pre upotrebe.

- Hidroksimetil furfural (C6O3H6), 1g / l vodenog rastvora:

Pripremiti uzastopno rastvore koji sadrže 5, 10, 20, 30 i 40 mg /l. Rastvor 1 g/ l i razblaženi rastvori moraju biti sveže pripremljeni.

(1.3) Postupak

- Priprema uzorka

Koristiti rastvor koji se dobija razređivanjem rektifikovane koncentrovane šire na 40% (m/v): u normalni sud od 500 ml staviti tačno 200 g izmerene rektifikovane koncentrovane šire, doliti destilovanu vodu do crte i homogenizovati. Izvršiti određivanje na 2 ml rastvora.

- Kolorimetrijsko određivanje

U svaki od dva normalna suda a i b od 25 ml sa čepom od brušenog stakla uliti 2 ml uzorka pripremljenog u skladu sa podtačkom (1.3) alineja prva ove tačke. U svaki sud uliti 5 ml rastvora p - toluidina (podtačka (1.2) alineja druga ove tačke) i promešati. U sud b (kontrolni sud) dodati 1 ml destilovane vode, a u sud a 1 ml rastvora barbiturne kiseline (podtačka (1.2) alineja prva ove tačke). Promućkati kako bi se tečnost homogenizovala. Preliti sadržaje sudova u kivete spektrofotometra sa optičkim putem od 1 cm. Postaviti lestvicu apsorbancije na nulu koristeći sadržaj tikvice b pri talasnoj dužini od 550 nm. Pratiti promene apsorbancije sadržaja suda a; zabeležiti najveću vrednost A, koja se postiže nakon 2-5 minuta.

Uzorke sa koncentracijama hidroksimetil furfurala iznad 30 mg/l potrebno je razrediti pre analize.

- Priprema kalibracione krive

Uliti 2 ml svakog rastvora hidroksimetil furfurala sa po 5, 10, 20, 30 i 40 mg/l (podtačka (1.2) alineja četvrta ove tačke) u dva kompleta suda od 25 ml a i b, te izvršiti na njima postupak iz podtačke (1.3) alineja treća ove tačke.

Grafički prikaz, koji prikazuje promenu apsorbancije sa koncentracijama hidroksimetil furfurala u mg/l, čini ravna linija koja prolazi kroz centar koordinatnog sistema.

(1.4) Iskazivanje rezultata

Koncentracija hidroksimetil furfurala u rektifikovanoj koncentrovanoj širi iskazuje se u miligramima po kilogramu ukupnog šećera.

- Metoda proračuna

Koncentracija hidroksimetil furfurala C mg/l u analiziranom uzorku je koncentracija na kalibracionoj krivi koja odgovara apsorbanciji A izmerenoj u uzorku.

Koncentracija hidroksimetil furfurala u miligramima po kilogramu ukupnog šećera računa se pomoću formule:

250 × ((C) / (P))

P = procenat (m/m) koncentracije ukupnog šećera u rektifikovanoj koncentrovanoj širi.

2) Tečna hromatografija visokih performansi

(2.1) Aparatura

- Tečni hromatograf visokih performansi je opremljen:

injektorom ("loop"), 5 ili 10 μl; spektrofotometrijskim detektorom za merenja pri 280 nm; kolonom od silicijuma vezanog sa oktadecilom (npr. Bondapak C18 - Corasil, Waters Ass.); uređajem za snimanje i prema potrebi integratorom.

Brzina protoka mobilne faze: 1,5 ml/min.

- Aparatura za membransku filtraciju sa porama prečnika 0,45 mm.

(2.2) Reagensi

- Dvostruko destilovana voda;

- metanol (CH3OH), destilovan ili HPLC čistoće;

- sirćetna kiselina (CH3 COOH), (ρ20 = 1,05 g/ml);

- mobilna faza: voda-metanol (podtačka (2.2) alineja druga ove tačke) - Sirćetna kiselina (podtačka (2.2) alineja treća ove tačke). Prethodno filtrirana kroz membranski filter (0,45 μm), (40:9:1 v/v).

Ovu mobilnu fazu je potrebno ponovo pripremiti iz dana u dan i degazirati pre upotrebe;

- referentni rastvor hidroksimetil furfurala, 25 mg/l (v/v):

Staviti 25 mg tačno izmerenog hidroksimetil furfurala (C6H3O6) u normalni sud od 100 ml i dopuniti metanolom do oznake (podtačka (2.2) alineja druga ove tačke). Razrediti ovaj rastvor 1/10 metanolom (podtačka (2.2) alineja druga ove tačke) i filtrirati pomoću membranskog filtera (0,45 μm).

Ako se ovaj rastvor čuva u frižideru u hermetički zatvorenim smeđim staklenim bocama, moguće ga je čuvati 2-3 meseca.

(2.3) Postupak

- Priprema uzorka

Koristiti rastvor koji se dobija razređivanjem rektifikovane koncentrovane šire na 40% (m/v) (u normalni sud od 500 ml staviti tačno 200 g izmerene rektifikovane koncentrovane šire). Dopuniti destilovanom vodom do crte i homogenizovati, zatim filtrirati pomoću membranskog filtera (0,45 μm).

- Hromatografsko određivanje

Ubrizgati 5 ili 10 μl uzorka pripremljenog u skladu sa podtačkom (2.3) alineja prva ove tačke i 5 ili 10 μl referentnog rastvora hidroksimetil furfurala (podtačka (2.2) alineja peta ove tačke) u hromatograf. Zabeležiti hromatogram.

Vreme zadržavanja hidroksimetil furfurala iznosi približno 6-7 minuta.

(2.4) Iskazivanje rezultata

Koncentracija hidroksimetil furfurala u rektifikovanoj koncentrovanoj širi izražava se u miligramima po kilogramu ukupnog šećera.

- Metoda proračuna

Koncentraciju hidroksimetil furfurala u 40% (m/v) rastvoru rektifikovane koncentrovane šire označiti sa C mg / l.

Koncentracija hidroksimetil furfurala u miligramima po kilogramu ukupnog šećera računa se pomoću formule:

250 × ((C) / (P)),

gde je P = procenat (m/m) koncentracije ukupnog šećera u rektifikovanoj koncentrovanoj širi.

g) Teški metali

Princip

1) Brza metoda za analizu teških metala

Teški metali se u primereno razređenoj rektifikovanoj koncentrovanoj širi otkrivaju zahvaljujući boji koju uzrokuje stvaranje sulfida. Oni se ocenjuju poređenjem sa standardnim rastvorom olova koja odgovara najvećoj prihvatljivoj koncentraciji.

2) Određivanje sadržaja olova atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom

Helat, koji nastaje vezivanjem olova sa amonijum pirolidin ditiokarbamatom, ekstrahovati sa metil izobutil ketonom i izmeriti apsorbciju pri 283,3 nm. Sadržaj olova određuje se uz pomoć poznatih dodatnih količina olova u nizu referentnih rastvora.

1) Brza metoda za analizu teških metala

(1.1) Reagensi

- Razređena hlorovodnična kiselina, 70% (m/v):

Uzeti 70g hlorovodonične kiseline (HCl) (ρ20 = 1,16-1,19 g/ml) i dopuniti destilovanom vodom do 100 ml.

- Razređena hlorovodnična kiselina 20% (m/v):

Uzeti 20 g hlorovodonične kiseline (HCl) (ρ20= 1,16-1,19 g/ml) i dopuniti destilovanom vodom do 100 ml.

- Razređeni amonijak:

Uzeti 14 g amonijaka (NH3) (ρ20 = 0,931-0,934 g/ml) i dopuniti destilovanom vodom do 100 ml.

- Puferski rastvor pH 3,5:

Rastvoriti 25g amonijum acetata (CH3COONH4) u 25 ml vode i dodati 38 ml razblažene hlorovodonične kiseline (podtačka (1.1) alineja prva ove tačke). Prema potrebi prilagoditi pH pomoću razređene hlorovodonične kiseline (podtačka (1.1) alineja druga ove tačke) ili razređenog amonijaka (podtačka (1.1) alineja treća ove tačke), te dopuniti destilovanom vodom do 100 ml.

- Rastvor tioacetamida (C2H5NS), 4% (m/v).

- Rastvor glicerola (C3H8O3), 85% (m/v)

(n D20°C= 1,449-1,455).

- Reagens tioacetamida:

U 0,2 ml rastvora tioacetamida (podtačka (1.1) alineja peta ove tačke) dodati 1 ml mešavine koju čini 5 ml vode, 15 ml 1 M rastvora natrijum hidroksida i 20 ml glicerola (podtačka (1.1) alineja šesta ove tačke). Grejati 20 sekundi u vodenom kupatilu na temperaturi od 100°C. Pripremiti neposredno pre upotrebe.

- Rastvor koji sadrži 0,002 g/l olova:

Pripremiti rastvor 1 g/l olova rastvaranjem 0,400 g olovo nitrata (Pb(NO3) 2) u vodi i dodavanjem destilovane vode do 250 ml. Prilikom upotrebe razrediti ovaj rastvor sa dva dela vode u 1000 (v/v) kako bi se dobio rastvor od 0,002 g/l.

(1.2) Postupak

Rastvoriti ispitivani uzorak od 10 g rektifikovane koncentrovane šire u 10 ml vode. Dodati 2 ml puferskog rastvora pH 3,5 (podtačka (1.1) alineja četvrta ove tačke) i pomešati. Dodati 1,2 ml reagensa tioacetamida (podtačka (1.1) alineja sedma ove tačke) i odmah pomešati. Pripremiti kontrolni uzorak u istim uslovima pomoću 10 ml rastvora olova od 0,002 g/l (podtačka (1.1) alineja osma ove tačke).

Nakon dva minuta, smeđa boja rektifikovane koncentrovane šire ne bi trebalo da bude intenzivnija u odnosu na boju kontrolnog uzorka.

(1.3) Proračun

U uslovima gore opisanog postupka kontrolni uzorak odgovara najvećoj prihvatljivoj koncentraciji teških metala izraženoj kao 2 mg/kg olova u rektifikovanoj koncentrovanoj širi.

2) Određivanje sadržaja olova atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom

(2.1) Aparatura

- Atomski apsorpcioni spektrofotometar opremljen gorionikom vazduh-acetilen;

- šuplja olovna katodna cev.

(2.2) Reagensi

- Razređena sirćetna kiselina:

Uzeti 12 ml ledene sirćetne kiseline (ρ20 = 1,05 g/ml) i dopuniti destilovanom vodom do 100 ml.

- Rastvor amonijum pirolidin ditiokarbamata (C5H12N2S2), 1% (m/v).

- Metil izobutil keton, (CH3)2CHCH2COCH3.

- Rastvor koji sadrži 0,010 g/l olova:

Razrediti 1 g/l rastvora olova (podtačka (1.1) alineja osma ove tačke) Na 1% (v/v).

(2.3) Postupak

- Priprema rastvora za analizu

Rastvoriti 10 g rektifikovane koncentrovane šire u mešavini razređene sirćetne kiseline (podtačka (2.2) alineja prva ove tačke) i vode u jednakim zapreminama i dopuniti ovom mešavinom do 100 ml.

Dodati 2 ml rastvora amonijum pirolidin ditiokarbamata (podtačka (2.2) alineja druga ove tačke) i 10 ml metil izobutil ketona (podtačka (2.2) alineja treća ove tačke). Protresti 30 sekundi ne izlažući tečnost jarkom svetlu. Ostaviti da se dva sloja razdvoje. Upotrebiti sloj metil izobutil ketona.

- Priprema referentnih rastvora

Pripremiti 3 referentna rastvora koja uz 10 g rektifikovane koncentrovane šire sadrže 1,2 odnosno 3 ml rastvora sa 0,010 g/l olova (podtačka (2.2) alineja četvrta ove tačke). Postupiti sa tim rastvorom na jednak način kao i sa rastvorom za analizu.

- Kontrolni uzorak

Pripremiti kontrolni uzorak u istim uslovima kako je opisano u podtački (2.3) alineja prva ove tačke, ali bez dodavanja rektifikovane koncentrovane šire.

- Određivanje

Postaviti talasnu dužinu na 283,3 nm. Raspršiti metil izobutil keton iz kontrolnog uzorka u plamenu i postaviti lestvicu apsorbancije na nulu. Koristeći ekstrakte odgovarajućih rastvora odrediti apsorbciju rastvora za analizu i referentnih rastvora.

(2.4) Iskazivanje rezultata

Sadržaj olova iskazuje se u miligramima po kilogramu rektifikovane koncentrovane šire, zaokruženo na jednu decimalu.

- Proračun

Konstruisati kalibracionu krivu iz koje je vidljiva promena apsorbancije u funkciji koncentracije olova dodatog referentnim rastvorima, s time da koncentracija jednaka nuli odgovara rastvoru za analizu.

Ekstrapolirati ravnu crtu koja povezuje tačke dok ne preseče negativni deo ose koncentracije. Udaljenost tačke preseka od centra koordinatnog sistema jeste koncentracija olova u analiziranom rastvoru.

d) Određivanje etanola

Ova metoda se koristi za određivanje alkoholne jačine u tečnostima sa niskim sadržajem alkohola, kao što su šire, koncentrovane šire i rektifikovane koncentrovane šire.

1) Princip

Jednostavna destilacija tečnosti.

Oksidacija etanola u destilatu pomoću kalijum dihromata. Titracija viška dihromata rastvorom gvožđa (II).

2) Aparatura

(2.1) Aparatura za destilaciju koja se koristi za merenje jačine alkohola.

3) Reagensi

(3.1) Rastvor kalijum dihromata:

Rastvoriti 33,600 g kalijum dihromata (K2Cr2O7) u dovoljnoj količini vode kako bi se pri 20°C dobio 1 litar rastvora. Jedan mililitar ovog rastvora oksidira 7,8924 mg alkohola.

(3.2) Rastvor gvožđe (II) amonijum sulfata:

Rastvoriti 135 g gvožđe (II) amonijum sulfata (FeSO4(NH4)2SO4 × 6H2O u dovoljnoj količini vode kako bi se dobio 1 litar rastvora i dodati 20 ml koncentrovane sumporne kiseline (H2 SO4), (ρ20 = 1,84 g/ml). Ovaj rastvor više-manje odgovara polovini zapremine tek pripremljenog rastvora dihromata. Naknadno, ona polako oksidira.

(3.3) Rastvor kalijum permanganata:

Rastvoriti 1,088 g kalijum permanganata (KMnO4) u dovoljnoj količini vode kako bi se dobio 1 litar rastvora.

(3.4) Sumporna kiselina, razređena u odnosu 1:2 (v/v):

Neprekidno mešajući, postepeno dodavati 500 ml sumporne kiseline (H2SO4) (ρ20 = 1,84 g/ml) u 500 ml vode.

(3.5) Reagens gvožđe ortofenantrolin:

Rastvoriti 0,695 g sulfata gvožđa (FeSO4 × 7H2O) u 100 ml vode i dodati 1,485 ortofenantrolin monohidrata (C12H8N2 × H2O). Zagrevati kako bi se pospešilo rastvaranje. Nastala jarko crvena boja rastvora je stabilna.

4) Postupak

(4.1) Destilacija

Staviti 100 g rektifikovane koncentrovane šire i 100 ml vode u balon za destilaciju. Sakupiti destilat u normalni sud od 100 ml i dopuniti vodom do crte.

(4.2) Oksidacija

Uzeti sud od 300 ml sa čepom od brušenog stakla i proširenim grlom koji je moguće isprati bez gubitaka. Staviti u sud 20 ml titracionog rastvora kalijum dihromata (tačka 3) podtačka (3.1) ovog pododeljka) i 20 ml razblažene sumporne kiseline u razmeri 1:2 (v/v) (tačka 3) podtačka (3.4) ovog pododeljka), i promućkati. Dodati 20 ml destilata, zatvoriti sud, promućkati i pričekati barem 30 minuta povremeno mućkajući sud. (Ovo je normalni sud.)

Izvršiti titraciju gvožđe (II) amonijum sulfata (tačka 3) podtačka (3.2) ovog pododeljka) u odnosu na rastvor kalijum dihromata tako da se u jednake sudove stave iste količine reagenasa, s time da je 20 ml destilata potrebno zameniti sa 20 ml destilovane vode. (Ovo je kontrolni sud.)

(4.3) Titracija

U sadržaj normalnog suda dodati 4 kapljice reagensa ortofenantrolina (tačka 3) podtačka (3.5) ovog pododeljka). Titrirati višak dihromata dodavanjem rastvora gvožđe (II) amonijum sulfata (tačka 3) podtačka (3.2) ovog pododeljka). Prestati sa dodavanjem rastvora gvožđa kada se boja rastvora promeni iz zeleno-plave u smeđu.

Kako bi se tačnije mogao odrediti kraj, ponovo promeniti boju mešavine iz smeđe u zeleno-plavu pomoću rastvora kalijum permanganata (tačka 3) podtačka (3.3) ovog pododeljka). Oduzeti desetinu zapremine ovog rastvora od zapremine dodatog rastvora gvožđa (II). Označiti razliku sa n ml.

Izvršiti isti postupak na isti način sa kontrolnim sudom. Označiti razliku sa n' ml.

5) Iskazivanje rezultata

Etanol se izražava u gramima po kilogramu (g/kg) ukupnog šećera i zaokružuje se na jednu decimalnu cifru.

(5.1) Metoda proračuna

n' ml rastvora gvožđa redukuje 20 ml rastvora dihromata, koji oksidira 157,85 mg čistog etanola.

Jedan mililitar rastvora gvožđa (II) ima jednaku snagu kao redukcioni:

((157,85) / (n)) mg etanola.

n-n' rastvora gvožđa (II) ima jednaku snagu kao redukcioni:

157,85 × ((n' - n) / (n)) mg etanola.

Koncentracija etanola u g/kg rektifikovane koncentrovane šire dobija se pomoću sledeće formule:

7,892 × ((n' - n) / (n))

Koncentracija etanola u g/kg ukupnog šećera dobija se pomoću sledeće formule:

789,2 × ((n' - n) / (n' × P)),

gde je P = % (m/m) koncentracije ukupnog šećera u rektifikovanoj koncentrovanoj širi.

đ) Mezo-inozitol, scilo-inozitol i saharoza

1) Princip

Gasna hromatografija sililovanih derivata.

2) Reagensi

(2.1) Interni standard: ksilitol (vodeni rastvor od oko 10 g/l kome je potrebno dodati natrijum azid na vrhu špatule).

(2.2) Bis (Trimetilsilil) trifluoroacetamid - BSTFA - (C8H18F3NOSi2).

(2.3) Trimetil hlorsilan (C5 H9 ClSi).

(2.4) Piridin p.a. (C5 H5 N20).

(2.5) Mezo-inozitol (C6H12O6).

3) Aparatura

(3.1) Gasni hromatograf opremljen:

(3.2) Kapilarnom kolonom (npr. od taljenog silicijum dioksida, presvučena sa OV 1, debljine filma 0,15 μm, dužine 25 m i unutrašnjeg prečnika 0,3 mm).

Radni uslovi:

- gas nosilac - vodonik ili helijum;

- brzina protoka gasa nosioca: oko 2 ml/minuti;

- temperatura injektora i detektora: 300°C;

- programiranje temperature: 1 minut na 160°C, porast od 4°C u minuti do 260°C, konstantna temperatura od 260°C tokom 15 minuta;

- odnos: oko 1:20.

(3.3) Integrator.

(3.4) Mikrošpric, 10 μl.

(3.5) Mikropipete od 50, 100 i 200 μl.

(3.6) Sudovi od 2 ml sa teflonskim čepom.

(3.7) Peć.

4) Postupak

Tačno izmereni uzorak od oko 5 g rektifikovane koncentrovane šire staviti u normalni sud od 50 ml. Dodati 1 ml standardnog rastvora ksilitola (tačka 2) podtačka (2.1) ovog pododeljka) i dopuniti vodom do vrha. Promešati i nakon toga uzeti 100 μl rastvora i uliti u sud (tačka 3) podtačka (3.6) ovog pododeljka) i ispariti laganim strujanjem vazduha. Prema potrebi je moguće dodati 100 μl apsolutnog etil alkohola kako bi se ubrzalo isparavanje.

Pažljivo rastvoriti ostatak u 100 μl piridina (tačka 2) podtačka (2.4) ovog pododeljka) i 100 μl Bis (Trimetilsilil) trifluoroacetamida (tačka 2) podtačka (2.2) ovog pododeljka), dodati 10 μl trimetil hlorsilana (tačka 2) podtačka (2.3) ovog pododeljka). Zatvoriti sud teflonskim čepom i grejati na 60°C sat vremena.

Rastvoriti 0,5 μl bistre tečnosti i ubrizgati pomoću zagrejane šuplje igle u skladu sa navedenim splitom.

5) Izračunavanje rezultata

(5.1) Pripremiti rastvor koji sadrži:

60 g/l glukoze, 60 g/l fruktoze, 1 g/l mezo-inozitola i 1 g/l saharoze.

Izmeriti 5 g rastvora i izvršiti postupak u skladu sa tačkom 4) ovog pododeljka Rezultati za mezo-inozitol i saharozu u odnosu na ksilitol računaju se iz hromatograma.

U slučaju scilo-inozitola, koji nije dostupan na tržištu i čije je vreme zadržavanja između poslednjeg pika anomernog oblika glukoze i pika mezo-inozitola (videti grafički prikaz), uzima se isti rezultat kao za mezo-inozitol.

6) Iskazivanje rezultata

(6.1) Mezo-inozitol i scilo-inozitol iskazuju se u miligramima po kilogramu ukupnog šećera. Saharoza se izražava po kilogramu šire.

Grafički prikaz