Prethodni

A.5. POVRŠINSKI NAPON

1. METODA ISPITIVANJA

Opisane metode zasnivaju se na Uputstvu za ispitivanje OECD1. Osnovni principi dati su u literaturi2.

1.1. UVOD

Opisane metode primenjuju se kod merenja površinskog napona vodenih rastvora.

Pre ispitivanja supstance korisno je imati podatke o njenoj: rastvorljivosti u vodi, strukturi, sposobnosti da hidrolizuje i vrednosti kritične koncentracije za formiranje micela.

Opisane metode mogu se primeniti za većinu supstanci, bez ograničenja u pogledu stepena njihove čistoće.

Merenje površinskog napona metodom prstenastog tenziometra ograničeno je na vodene rastvore dinamičkog viskoziteta manjeg od 200 mPa s.

1.2. DEFINICIJE I MERNE JEDINICE

Površinski napon jeste entalpija slobodne površine po jedinici površine.

Površinski napon se izražava kao:

N/m u Međunarodnom sistemu jedinica (SI) ili

mN/m Međunarodnom sistemu jedinica (SI podjedinica);

pri čemu je:

1 N/m = 103 din/cm ili

1 mN/m = 1 din/cm u zastarelom CGS sistemu.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Referentne supstance ne moraju da se koriste svaki put kada se ispituje nova supstanca. One prvenstveno služe za povremenu proveru metode i da omoguće poređenje sa rezultatima dobijenim drugim metodama.

Referentne supstance koje pokrivaju širok opseg površinskih napona date su u literaturi1, 3.

1.4. PRINCIP METODE

Metode se zasnivaju na merenju maksimalne sile koju je neophodno vertikalno usmeriti na stremen (uzengiju) ili prsten u kontaktu sa površinom tečnosti koja se ispituje i koja se nalazi u mernoj posudi, da bi se odvojili od te površine ili je usmeriti na ploču čija je ivica u kontaktu sa površinom radi izvlačenja formiranog tankog filma.

Supstance koje su rastvorne u vodi pri najmanjoj koncentraciji od 1 mg/L ispituju se u vodenom rastvoru pri samo jednoj koncentraciji.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Ove metode daju veću preciznost od preciznosti koja se može očekivati sa aspekta zahteva koji se odnose na životnu sredinu.

1.6. OPIS METODA

Pripremi se rastvor supstance u destilovanoj vodi. Koncentracija rastvora treba da bude 90% zasićenog rastvora supstance u vodi. Kada koncentracija prelazi 1 g/L, za ispitivanje se koristi koncentracija od 1 g/L. Supstance čija je rastvorljivost u vodi manja od 1 mg/L ne treba ispitivati.

1.6.1. Metoda pločice

Videti standard SRPS H.E 8.047.

1.6.2. Metoda uzengije

Videti standard SRPS H.E 8.047.

1.6.3. Metoda prstena

Videti standard SRPS H.E 8.047.

1.6.4. Metoda prstena harmonizovana sa OECD

1.6.4.1. Aparat

Za ovo merenje odgovarajući su komercijalno dostupni tenziometri. Oni se sastoje od sledećih elemenata:

- pokretnog stola za uzorak;

- sistema za merenje sile;

- mernog tela (prsten);

- posude za merenje.

1.6.4.1.1. Pokretni sto za uzorak

Pokretni sto za uzorak koji se koristi kao nosač temperaturno kontrolisane posude za merenje u kojoj se nalazi tečnost koja se ispituje, postavlja se na postolje zajedno sa sistemom za merenje sile.

1.6.4.1.2. Sistem za merenje sile

Sistem za merenje sile (videti Sliku) nalazi se iznad stola za uzorak. Greška u merenju sile ne sme prelaziti ±10-6 N, što odgovara grešci od ±0,1 mg kod merenja mase. U većini slučajeva, merna skala komercijalno dostupnih tenziometara kalibrisana je u mN/m tako da se površinski napon može direktno očitavati u mN/m sa tačnošću od 0,1 mN/m.

1.6.4.1.3. Merno telo (prsten)

Prsten je obično napravljen od žice od platine i iridijuma debljine oko 0,4 mm i srednjeg obima od 60 mm. Žičani prsten visi horizontalno sa metalne igle i podupirača (konzole) za postavljanje žice i stvara vezu sa sistemom za merenje sile (videti Sliku).

Slika

Pribor za merenje - sve dimenzije su u milimetrima

Merno telo (sve dimenzije date su u milimetrima):

1.6.4.1.4. Posuda za merenje

Posuda za merenje u kojoj se nalazi rastvor koji se ispituje mora biti od stakla sa mogućnošću kontrole temperature. Posuda mora da bude tako napravljena da za vreme merenja temperatura tečnosti rastvora koji se ispituje i gasne faze iznad površine ostaje konstantna tako da uzorak ne može ispariti.

Prihvataju se cilindrični stakleni sudovi čiji unutrašnji prečnik nije manji od 45 mm.

1.6.4.2. Priprema aparata

1.6.4.2.1. Čišćenje

Stakleni sudovi se moraju pažljivo čistiti. Ukoliko je neophodno, treba ih prati vrelom hrom-sumpornom kiselinom, a nakon toga fosfornom kiselinom (83% do 98% masenih H3PO4). Zatim se stakleni sudovi detaljno ispiraju vodom sa česme i na kraju se ispiraju bi-destilovanom vodom do neutralne reakcije, nakon čega se suše ili ispiraju delom uzorka tečnosti za merenje.

Prsten se prvo obilno ispira vodom da se uklone sve supstance koje su rastvorne u vodi. Prsten se zatim kratko potopi u hrom-sumpornu kiselinu, ispere se bidestilovanom vodom do neutralne reakcije i na kraju se kratko zagreje iznad plamena metanola.

Napomena: Kontaminacija supstancama koje nisu rastvorene ili uništene hrom-sumpornom ili fosfornom kiselinom, kao što su silikoni, mora se ukloniti pomoću odgovarajućeg organskog rastvarača.

1.6.4.2.2. Kalibracija aparata

Validacija aparata sastoji se od verifikacije i podešavanja nulte tačke tako da pokazivač instrumenta omogućava pouzdano određivanje u mN/m.

Postavljanje: Aparat se mora nivelisati postavljanjem npr. libele na bazu tenziometra, uz podešavanje zavrtnjeva kojima se reguliše nivo postolja.

Podešavanje nulte tačke: Nakon postavljanja prstena na aparat pre potapanja u tečnost, pokazivač tenziometra treba podesiti na nulu, a prsten podesiti paralelno sa površinom tečnosti. U tu svrhu, površina tečnosti može da posluži kao ogledalo.

Kalibracija: Kalibracija se može izvršiti pomoću dva postupka:

a) Korišćenjem mase: procedura koja koristi jahače poznatih masa između 0,1 g i 1,0 g na prstenu.

Faktor kalibracije (Fa), sa kojim se sva očitavanja moraju množiti, određuje se pomoću jednačine1:

pri čemu je:

pri čemu:

m jeste masa jahača (dopune), izražena u g;

g jeste gravitaciono ubrzanje (981 cm s-2 na nivou mora);

b jeste srednji obim prstena, izražen u cm;

σa jeste očitavanje tenziometra nakon postavljanja jahača na prsten, izraženo u mN/m.

b) Korišćenjem vode: postupak koji koristi čistu vodu čiji je površinski napon na npr. temperaturi od 23°C jednak 72,3 mN/m. Ovaj postupak se obavlja brže od kalibracije masom, ali uvek postoji opasnost da je površinski napon vode lažan usled ostataka kontaminacije surfaktantima.

Kalibracioni faktor (Φb) sa kojim se množe sva očitavanja sa instrumenta, određuje se pomoću jednačine2:

pri čemu:

σo jeste vrednost iz literature za površinski napon vode (mN/m);

σg jeste izmerena vrednost površinskog napona vode (mN/m), obe pri istoj temperaturi.

1.6.4.3. Priprema uzoraka

Od supstanci koje se ispituju pripremaju se vodeni rastvori u zahtevanim koncentracijama. Ne smeju sadržati nikakve nerastvorne supstance.

Rastvor se mora održavati na konstantnoj temperaturi (±0,5°C). Pošto sepovršinski napon rastvora u mernom sudu menja vremenom, vrši se nekoliko merenja u različitim vremenskim intervalima, pri čemu iscrtana kriva pokazuje površinski napon kao funkciju vremena. Kada promene prestanu da se dešavaju, postiže se stanje ravnoteže.

Kontaminacija prašinom i gasovima sa drugih supstanci utiče na merenje. Zbog navedenog merenje se mora odvijati ispod zaštitnog poklopca.

1.6.5. Uslovi ispitivanja

Merenje se mora vršiti na temperaturi od približno 20°C i kontroliše se u okviru ± 0,5°C.

1.6.6. Ispitivanje

Rastvori koji se mere moraju se preneti u pažljivo opranu posudu za merenje, vodeći računa da se izbegne stvaranje pene, nakon čega se posuda za merenje postavlja na sto aparata za ispitivanje. Vrh table sa mernim sudom se zatim izdiže sve dok prsten ne zaroni ispod površine rastvora koji se meri. Nakon toga, vrh table se postepeno i ravnomerno spušta (brzinom od oko 0,5 cm/min) da bi se prsten odvojio od površine do postizanja maksimalne sile. Tečni sloj koji je zalepljen na prsten ne sme se odvajati od prstena. Nakon završenog merenja, prsten se ponovo mora zaroniti ispod površine, a merenje se ponavlja dok se ne postigne konstantna vrednost površinskog napona. Za svako određivanje beleži se vreme od prenošenja rastvora u merni sud. Očitavanje se vrši pri maksimalnoj sili potrebnoj da se prsten odvoji od površine tečnosti.

2. PODACI

Radi izračunavanja površinskog napona, očitana vrednost u mN/m na aparatu se prvo mora pomnožiti sa faktorom kalibracije Φa ili Φb (u zavisnosti od toga koji postupak kalibracije je korišćen). Navedeni postupak daje vrednost koja se primenjuje samo približno, te stoga zahteva korekciju.

Harkins i Džordan4 su empirijski utvrdili faktore korekcije za vrednosti površinskog napona izmerene metodom prstena, koji zavise od: dimenzija prstena, gustine tečnosti i njenog površinskog napona.

Iz tabela Harkinsa i Džordana je teško utvrditi faktor korekcije za svako individualno merenje, te se za proračun površinskog napona za vodene rastvore može koristiti i pojednostavljena procedura očitavanja korektivnih vrednosti površinskog napona direktno iz tabele.

Za očitavanja koja se nalaze između tabelarnih vrednosti mora se koristiti interpolacija.

Tabela: Korekcija izmerenog površinskog napona

Samo za vodene rastvore, ρ = 1 g/cm3

Tabela je izrađena na osnovu Harkins-Džordanove korekcijeXXIII.

Alternativno, bez prethodne kalibracije, površinski napon može da se izračuna prema formuli:

pri čemu:

F jeste sila izmerena dinamometrom u tački prekida prevlake (filma);

R jeste poluprečnik prstena;

f jeste korektivni faktor1.

_______________
XXIII Slična je tabeli koja je data u DIN standardu (DIN 53914) za vodu i vodene rastvore (gustine ρ = 1 g/cm3) i za komercijalno dostupan prsten dimenzija R = 9,55 mm (srednji poluprečnik prstena) i r = 0,185 mm (poluprečnik žice prstena). Tabela sadrži korigovane vrednosti za merenja površinskog napona nakon kalibracije jahačem ili vodom.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži podatke o:

- korišćenoj metodi;

- vrsti vode ili rastvora koji je korišćen;

- tačnom opisu supstance (identitet i nečistoće);

- rezultatima merenja: površinskog napona (očitavanje) sa navedenim pojedinačnim očitavanjima i njihovom aritmetičkom srednjom vrednošću, kao i sa korigovanom srednjom vrednošću (uzimajući u obzir faktor opreme i tabelu korekcije);

- koncentraciji rastvora;

- temperaturi ispitivanja;

- starosti korišćenog rastvora; naročito vreme između pripreme i merenja rastvora;

- opisu vremenske zavisnosti površinskog napona nakon prenosa rastvora u merni sud.

U izveštaju se navode svi podaci i primedbe važne za tumačenje rezultata, naročito podaci o nečistoćama i fizičkom stanju supstance.

3.2. TUMAČENJE REZULTATA

Imajući u vidu da destilovana voda ima površinski napon 72,75 mN/m na temperaturi od 20°C, supstance koje imaju površinski napon niži od 60 mN/m u uslovima ove metode smatraju se površinski aktivnim.

4. LITERATURA

1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.

2. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed.,Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter XIV.

3. Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, p. 511.

4. Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, p. 1751.

A.6. RASTVORLJIVOST U VODI

Deo prvi

1. METODA ISPITIVANJA

Opisane metode zasnivaju se na Uputstvu za ispitivanje OECD1.

1.1. UVOD

Korisno je imati podatke o: strukturnoj formuli, naponu pare, konstanti disocijacije i hidrolizi (u funkciji pH vrednosti) supstance koja se ispituje.

Pojedinačne metode ne mogu obuhvatiti ceo opseg rastvorljivosti u vodi.

Dve metode ispitivanja pokrivaju ceo opseg rastvorljivosti u vodi, ali se ne mogu primeniti na isparljive supstance:

- jedna metoda se primenjuje na čiste supstance koje imaju malu rastvorljivost (<10-2 g/L) i koje su stabilne u vodi, a naziva se: "Metoda eluiranja sa kolone";

- druga metoda se odnosi na čiste supstance sa većom rastvorljivošću (>10-2 g/L) i koje su stabilne u vodi, a naziva se: "Metoda staklenog suda".

Prisustvo nečistoća može značajno uticati na rastvorljivost ispitivane supstance u vodi.

1.2. DEFINICIJE I MERNE JEDINICE

Rastvorljivost supstance u vodi određena je masenom koncentracijom supstance u zasićenom vodenom rastvoru na određenoj temperaturi.

Rastvorljivost u vodi izražava se jedinicama mase po zapremini rastvora. Merna jedinica u Međunarodnom sistemu jedinica (SI) sistema je kg/m3 (mogu se koristiti i g/L).

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Referentne supstance ne moraju da se koriste svaki put kada se ispituje nova supstanca. One prvenstveno služe za povremenu proveru metode i da omoguće poređenje sa rezultatima dobijenim drugim metodama.

1.4. PRINCIP METODE

Preliminarnim ispitivanjima treba utvrditi približnu količinu uzorka i vreme neophodno da se postigne koncentracija zasićenog rastvora.

1.4.1. Metoda eluiranja sa kolone

Ova metoda zasniva se na eluiranju ispitivane supstance vodom iz mikrokolone koja je napunjena inertnim materijalom, kao što su granule stakla ili pesak, koji je prekriven supstancom koja se ispituje. Rastvorljivost u vodi određuje se kada masena koncentracija eluata postane konstantna. Rezultati se navode kao plato koncentracije u funkciji vremena.

1.4.2. Metoda staklenog suda

Kod ovog postupka, supstanca (čvrste supstance moraju biti sprašene) se rastvara u vodi na temperaturi nešto višoj od temperature ispitivanja. Kada dođe do zasićenja, smeša se hladi i ostavlja da stoji na temperaturi na kojoj se vrši ispitivanje, uz mešanje dok se ne postigne ravnoteža. Merenje se može izvršiti i direktno na temperaturi na kojoj se ispituje, ukoliko se odgovarajućim uzorkovanjem može potvrditi da je postignuto ravnotežno zasićenje. Nakon toga, primenom odgovarajuće analitičke metode, utvrđuje se masena koncentracija supstance u vodenom rastvoru koji ne sme sadržavati nerastvorne čestice.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

1.5.1. Ponovljivost

Kod metode eluiranja sa kolone može se dobiti rezultat < 30 %, a kod metode staklenog suda očekivani rezultat je < 15 %.

1.5.2. Osetljivost

Osetljivost zavisi od metode analize, ali moguće je odrediti masene koncentracije do 10-6 g/L.

1.6. OPIS METODA

1.6.1. Uslovi ispitivanja

Ispitivanje se najčešće sprovodi na temperaturi od 20°C ± 0,5°C. Ukoliko se posumnja da rastvorljivost zavisi od temperature (>3% po °C), rastvorljivost se ispituje na još dve temperature koje moraju biti najmanje za 10°C niže ili više od početne temperature. U tom slučaju kontrola temperature treba da bude u opsegu ± 0,1°C. Izabrana temperatura treba da bude konstantna u svim važnim delovima opreme.

1.6.2. Preliminarna ispitivanja

Približno 0,1 g uzorka (čvrste supstance moraju biti sprašene) prenese se u graduisanu menzuru sa staklenim zapušačem (zapremine 10 mL) i dodaju se postepeno povećane zapremine destilovane vode na sobnoj temperaturi u koracima datim u tabeli:

Nakon svakog dodavanja navedene količine vode, smeša se snažno mućka 10 minuta i treba vizuelno proveriti da li ima nerastvornih delova uzorka. Ukoliko nakon dodavanja 10 mL vode uzorak ili neki njegovi delovi ostaju nerastvoreni, eksperiment treba ponoviti u menzuri zapremine 100 mL sa većim zapreminama vode. Kod supstanci koje su slabo rastvorne u vodi vreme koje je neophodno da bi se rastvorila supstanca može biti znatno duže (najmanje 24 sata). Približna vrednost rastvorljivosti iz Tabele odnosi se na zapreminu vode koja je nešto malo ispod one vrednosti pri kojoj dolazi do potpunog rastvaranja supstance. Ukoliko je očigledno da se supstanca nije do kraja rastvorila, treba je ostaviti da se rastvara duže od 24 sata (maksimum 96 sati) ili treba vršiti dalja razblaživanja kako bi se potvrdilo da li je za korišćenje pogodnija metoda eluiranja sa kolone ili metoda staklenog suda.

1.6.3. Metoda eluiranja sa kolone

1.6.3.1. Nosač, rastvarač i eluent

Nosač koji se koristi kod metode eluiranja sa kolone treba da bude inertan. Materijali koji se mogu koristiti su staklene kuglice i pesak. Za nanošenje uzorka na nosač koriste se isparljivi rastvarači analitičke čistoće. Za eluiranje se koristi bidestilovana voda koja je destilovana u staklenoj ili kvarcnoj aparaturi.

Napomena: Demineralizovana voda koja dolazi sa organskog jonoizmenjivača ne sme se koristiti.

1.6.3.2. Nanošenje supstance na nosač

Oko 600 mg nosača izmeri se i unese u balon sa okruglim dnom zapremine 50 mL. Odgovarajuća, precizno izmerena količina supstance koja se ispituje rastvori se u izabranom rastvaraču. Odgovarajuća količina ovog rastvora dodaje se na nosač. Rastvarač se mora u potpunosti upariti npr. upotrebom rotacionog vakuum uparivača. U suprotnom, ne može se postići optimalna vlažnost podloge zbog efekta raspodele na površini nosača.

Punjenje nosača može proizvesti probleme (netačne rezultate) ukoliko se supstanca koja se ispituje deponuje u obliku ulja ili u različitoj kristalnoj fazi. Ovaj problem treba ispitati kroz eksperimente i sačiniti detaljan izveštaj o tome.

Nosač se ostavi da se natapa oko dva sata u 5 mL vode, a potom se suspenzija prenosi u mikrokolonu. Alternativno, u mikrokolonu, koja je napunjena vodom, može se sipati osušeni nosač koji se ostavi u koloni oko dva sata da se uravnoteži.

Postupak ispitivanja:

Eluiranje supstance sa nosača može se izvesti:

- pomoću recirkulacione pumpe (videti Sliku 1) ili

- pomoću suda za nivelisanje (videti Sliku 4).

1.6.3.3. Metoda eluiranja sa kolone pomoću recirkulacione pumpe

Aparatura

Šematski prikaz opreme dat je na Slici 1. Odgovarajuća mikrokolona prikazana je na Slici 2, iako je prihvatljiva bilo koja veličina koja ispunjava kriterijume koji se odnose ne reproduktivnost i osetljivost. Kolona treba da ima dovoljno mesta za najmanje pet zapremina vode i da može da izdrži pet uzoraka. Veličina kolone se može smanjiti ukoliko se koristi pripremljeni rastvor koji zamenjuje pet zapremina koje se koriste za uklanjanje nečistoća.

Kolona treba da bude povezana sa recirkulacionom pumpom sa kontrolisanim protokom oko 25 mL/h. Pumpa se povezuje pomoću politetrafluoretilenskih (u daljem tekstu: PTFE) i/ili staklenih konektora. Kolona i pumpa, kada se sastave, moraju da imaju mogućnost uzorkovanja efluenta i izjednačavanja pritiska. Materijal u koloni zadržava mali čep (5 mm) od staklene vune koji služi i kao filter za čestice nečistoća. Pumpa može biti peristaltička pumpa ili membranska puma (mora se voditi računa da ne dođe da zagađenja i/ili apsorpcije materijala iz cevi).

Merenje

Početi protok kroz kolonu. Preporučuje se da se koristi protok od oko 25 mL/h (to odgovara 10 zapremina/h za kolonu koja je opisana). Prvih pet zapremina (minimum) odbaciti kako bi se sa njima izdvojile nečistoće rastvorne u vodi. Nakon toga pumpa se ostavlja da radi sve dok se ne postigne ravnoteža. Smatra se da je uspostavljena ravnoteža kada se u pet nasumično uzetih uzastopnih uzoraka koncentracije ne razlikuju za više od ± 30 %. Ovi uzorci treba da budu razdvojeni jedni od drugih po vremenskim intervalima koji odgovaraju prolasku najmanje 10 zapremina eluenta.

1.6.3.4. Metoda eluiranja sa kolone pomoću suda za nivelisanje

Aparatura (videti Slike 4 i 3)

Sud za nivelisanje: Spajanje sa sudom za nivelisanje vrši se upotrebom šlifovanog spoja koji je povezan pomoću cevi od PTFE. Preporučuje se da se koristi protok od oko 25 mLl/h. Prikupljene frakcije analiziraju se izabranom metodom.

Merenje

Frakcije koje pripadaju srednjem opsegu elucije, kada su koncentracije konstantne (± 30%) u najmanje pet uzastopnih frakcija, koriste se da bi se odredila rastvorljivost u vodi.

U oba slučaja (kada se koristi pumpa ili posuda za nivelisanje) treba ispitati rastvorljivost sa upola manjim protokom u odnosu na prvo ispitivanje. Ukoliko se rezultati dva ispitivanja slažu, rezultat je zadovoljavajući. Ukoliko je rastvorljivost očigledno veća pri manjem protoku, mora se nastaviti prepolovljavanje brzine protoka sve dok dva sukcesivna ispitivanja ne daju približne rezultate.

U oba slučaja (kada se koristi pumpa ili posuda za nivelisanje) frakcije treba proveriti na sadržaj koloidnih čestica Tindalovim efektom (raspršavanjem snopa svetlosti). Prisustvo koloidnih čestica menja rezultate i ispitivanje treba ponoviti uz poboljšano filtriranje kroz kolonu.

Potrebno je izmeriti pH vrednost svakog uzorka. Ispitivanje pri manjem protoku treba izvoditi pri istoj temperaturi.

1.6.4. Metoda staklenog suda

1.6.4.1. Oprema

Za primenu metode staklenog suda potrebno je:

- uobičajeno laboratorijsko posuđe od stakla i instrumenti;

- uređaj pogodan za mešanje rastvora pri kontrolisanim konstantnim temperaturama;

- centrifuga (poželjno termostatirana), ukoliko se radi sa emulzijama;

- oprema za analitičko određivanje.

1.6.4.2. Merenje

Količina potrebnog materijala da bi se postiglo zasićenje željene zapremine vode utvrđuje se na osnovu preliminarnog ispitivanja. Zapremina vode koja je neophodna zavisi od primenjene analitičke metode i opsega rastvorljivosti. Količina materijala (oko pet puta veća od one koja je utvrđena preliminarnim ispitivanjem) odmeri se i stavi u svaku od tri staklene posude koje imaju staklene zapušače (npr. epruvete ili kivete za centrifugiranje, baloni). Određena količina vode dodaje se u svaku posudu i one se čvrsto zatvore. Zatvorene posude potom se mešaju na temperaturi od 30°C. (Treba koristiti uređaj koji može da meša pri konstantnoj temperaturi, npr magnetno mešanje u termostatiranom vodenom kupatilu). Nakon jednog dana, jedna od posuda se uklanja i ostavi se, uz povremeno mešanje, na temperaturi na kojoj se izvodi ispitivanje tokom 24 sata da bi se uspostavila ravnoteža. Sadržaj posude se zatim centrifugira na temperaturi na kojoj se vrši ispitivanje i određuje se koncentracija supstance u vodenoj fazi upotrebom odgovarajuće analitičke metode. Preostale dve posude prolaze kroz isti postupak nakon početnog ujednačavanja pri temperaturi od 30°C u roku od dva odnosno tri dana. Ukoliko se koncentracije iz najmanje dve posude slažu sa željenom ponovljivošću, smatra se da je ispitivanje zadovoljilo kriterijume. Ispitivanje treba ponoviti, uz duže vreme uspostavljanja ravnoteže, ukoliko rezultati iz posuda 1, 2 i 3 pokazuju tendenciju povećanja vrednosti.

Merenje se može vršiti bez perioda inkubacije na temperaturi od 30°C. Da bi se odredila brzina uspostavljanje ravnoteže zasićenja, uzorci se uzimaju do trenutka kada vreme mešanja više ne utiče na koncentraciju ispitivanog rastvora.

Potrebno je zabeležiti pH vrednost svakog uzorka.

1.6.5. Analiza

Pri ovim određivanjima za svaku određenu supstancu potrebno je primeniti analitičku metodu koja je za nju odgovarajuća, s obzirom da male količine rastvorenih nečistoća mogu dovesti do velikih grešaka u određivanju rastvorljivosti. Metode koje se primenjuju mogu biti: gasna ili tečna hromatografija, metode titracije, fotometrijske metode, voltametrijske metode.

2. PODACI

2.1. METODA ELUIRANJA SA KOLONE

Potrebno je izračunati srednju vrednost za najmanje pet uzastopnih uzoraka uzetih iz posude u kojoj se nalaze zasićeni rastvori, kao i vrednost standardne devijacije. Rezultati treba da budu prikazani u jedinicama mase po zapremini rastvora.

Srednje vrednosti izračunate za dva ispitivanja u kojima se koriste različite brzine protoka se upoređuju i treba da imaju ponovljivost manju od 30%.

2.2. METODA STAKLENOG SUDA

Treba prikazati pojedinačne rezultate za svaku od posuda i ukoliko su ovi rezultati konstantni (ponovljivost manja od 15%), treba izračunati njihovu srednju vrednost i izraziti je u jedinicama masa po zapremini rastvora. Ovo može zahtevati pretvaranje masenih jedinica u zapreminske jedinice, korišćenjem gustine kada je rastvorljivost veoma velika (>100 g/L).

3. IZVEŠTAJ

3.1. METODA ELUIRANJA SA KOLONE

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži podatke o:

- rezultatima preliminarnih ispitivanja;

- preciznom opisu supstance (identitet i nečistoće);

- pojedinačnim koncentracijama, brzini protoka i pH vrednosti za svaki uzorak;

- srednjoj vrednosti i standardnoj devijaciji najmanje pet uzoraka iz područja zasićenja za svako ispitivanje;

- prosečnoj vrednosti dva uzastopna, prihvatljiva ispitivanja;

- temperaturi vode pri pravljenju zasićenog rastvora;

- korišćenoj metodi analize;

- materijalu nosača;

- načinu nanošenja uzorka na nosač;

- korišćenom rastvaraču;

- evidenciji, ako je došlo do hemijske nestabilnosti supstance za vreme ispitivanja i korišćenoj metodi.

U izveštaju se navode svi podaci i primedbe važne za tumačenje rezultata, naročito podaci o nečistoćama i fizičkom stanju supstance.

3.2. METODA STAKLENOG SUDA

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži podatke o:

- rezultatima preliminarnog ispitivanja;

- preciznom opisu supstance (identitet i nečistoće);

- pojedinačnim analitičkim određivanjima i srednjoj vrednosti kada je određeno više od jedne vrednosti za svaku posudu;

- pH vrednosti svakog uzorka;

- temperaturi na kojoj je vršeno ispitivanje;

- prosečnoj vrednosti rezultata od različitih posuda, a koji su u saglasnosti;

- korišćenoj analitičkoj metodi;

- evidenciji, ako je došlo do hemijske nestabilnosti supstance za vreme ispitivanja i korišćenoj metodi.

U izveštaju se navode svi podaci i primedbe važne za tumačenje rezultata, naročito podaci o nečistoćama i fizičkom stanju supstance.

4. LITERATURA

1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final.

2. NF T 20-045 (AFNOR) (September 85) Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility - Column elution method.

3. NF T 20-046 (AFNOR) (September 85) Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility - Flask method.

Deo drugi

Slika 1: Metoda eluiranja sa kolone pomoću recirkulacione pumpe

Slika 2: Tipična mikrokolona (sve dimenzije date su u milimetrima)

Slika 3: Tipična mikrokolona (sve dimenzije date su u milimetrima)

Slika 4: Metoda eluiranja sa kolone pomoću suda za nivelisanje

Pri čemu je:

1. Posuda za nivelaciju (npr. boca zapremine 2,5 L);

2. Kolona (videti Sliku 3);

3. Kolektor frakcija;

4. Termostat;

5. Teflonska cev;

6. Šlifovani spoj;

7. Cev za vodu (između termostata i kolone, unutrašnjeg prečnika: približno 8 mm).

A.8. KOEFICIJENT RASPODELE

Deo prvi

1. METODA ISPITIVANJA

Metoda mućkanja u staklenom balonu zasniva se na Uputstvu za ispitivanje OECD1.

1.1. UVOD

Korisno je imati preliminarne podatke o: strukturnoj formuli, konstanti disocijacije, rastvorljivosti u vodi, hidrolizi, rastvorljivosti u n-oktanolu i površinskom naponu supstance koja se ispituje.

Kod supstanci koje jonizuju ispitivanja treba sprovesti na njihovim nejonizovanim oblicima (slobodne kiseline ili slobodne baze) što se postiže upotrebom odgovarajućeg pufera čija je pH vrednost najmanje za jednu jedinicu ispod (slobodne kiseline) ili iznad (slobodne baze) pK.

Ova metoda ispitivanja obuhvata dve različite metode: metodu mućkanja u staklenom balonu i visoko efikasnu tečnu hromatografiju (High performance liquid chromatography, u daljem tekstu: HPLC). Metoda mućkanja u staklenom balonu koristi se kada se vrednost log Pow (videti objašnjenje dato u ovoj metodi) nalazi u opsegu od -2 do 4. Metoda tečne hromatografije koristi se kada se vrednost log Pow nalazi u opsegu od 0 do 6. Pre nego što se pristupi sprovođenju bilo koje od ove dve metode potrebno je odrediti preliminarne procene koeficijenta raspodele.

Metoda mućkanja u staklenom balonu primenjuje se samo za čiste supstance rastvorne u vodi i n-oktanolu. Metoda se ne primenjuje za površinski aktivne supstance (za njih se daje izračunati ili procenjeni koeficijent raspodele koji se zasniva na rastvorljivosti u vodi i u n-oktanolu).

Metoda tečne hromatografije (u daljem tekstu: HPLC metoda) ne primenjuje se na jake kiseline i baze, komplekse metala, površinski aktivne supstance i supstance koje reaguju sa eluentom. Za ove supstance mora se izračunati ili proceniti koeficijent raspodele koji se zasniva na rastvorljivosti u vodi i u n-oktanolu.

Metoda tečne hromatografije manje je osetljiva na prisutne nečistoće u ispitivanom jedinjenju u odnosu na postupak mućkanja u staklenom balonu. Ponekad prisustvo nečistoća utiče na tumačenje rezultata jer položaj pikova postaje nesiguran. Kod smeša kod kojih se ne razdvajaju trake u hromatogramu, treba navesti gornji i donji limit log P.

1.2. DEFINICIJE I MERNE JEDINICE

Koeficijent raspodele (P) jeste odnos ravnotežnih koncentracija (ci) rastvorene supstance u dvofaznom sistemu koji se sastoji od dva rastvarača koji se ne mešaju. U slučaju n-oktanola i vode:

http://s1.paragraflex.rs/documents/Old/t/t2011_06/

Koeficijent raspodele (P) jeste količnik dve koncentracije, koji se uobičajeno izražava u vidu logaritamske vrednosti sa osnovom 10 (log P).

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

1.3.1. Metoda mućkanja u staklenom balonu

Referentne supstance ne moraju da se koriste svaki put kada se ispituje nova supstanca. One prvenstveno služe za povremenu proveru metode i da omoguće poređenje sa rezultatima dobijenim drugim metodama.

1.3.2. Metoda tečne hromatografije

Da bi se uspostavila korelacija između izmerenih HPLC vrednosti supstance i njihovih P vrednosti, mora se konstruisati kalibraciona kriva zavisnosti log P od hromatografskih podataka sa najmanje 6 referentnih tačaka. Korisnik treba da izabere odgovarajuću referentnu supstancu. Ako je moguće, najmanje jedna referentna supstanca treba da ima Pow veći od Pow supstance koja se ispituje i jedna referentna supstanca da ima Pow manji od supstance koja se ispituje. Za vrednosti log P manje od 4 kalibracija se zasniva na podacima dobijenim primenom metode mućkanja u staklenom balonu. Za vrednosti log P veće od 4 kalibracija treba da bude zasnovana na validiranim vrednostima datim u literaturi ukoliko se one podudaraju sa izračunatim vrednostima. Za postizanje bolje preciznosti, najbolje je kao referentne supstance uzeti one supstance koje su slične strukture kao supstanca koja se ispituje.

Vrednosti log Pow dostupne su za mnoga hemijska jedinjenja2,3. Ukoliko ne postoje podaci o koeficijentu raspodele za strukturno slične supstance, pravi se opštija kalibraciona kriva na osnovu podataka o drugim referentnim supstancama.

Spisak preporučenih referentnih supstanci i njihovih log Pow vrednosti dat je u Delu drugom ove metode.

1.4. PRINCIP METODE

1.4.1. Metoda mućkanja u staklenom balonu

Da bi se odredio koeficijent raspodele, mora se postići ravnoteža između svih komponenti sistema i moraju se odrediti koncentracije rastvorene supstance u obe faze. Literatura upućuje da se u te svrhe može koristiti nekoliko različitih tehnika, npr. mešanje dve faze koje se potom razdvajaju kako bi se utvrdile ravnotežne koncentracije ispitivane supstance.

1.4.2. Metoda tečne hromatografije

HPLC se izvodi na analitičkim kolonama pakovanim sa komercijalno dostupnom čvrstom fazom koja sadrži duge lance ugljovodonika (npr. C8, C18) koji su hemijski vezani na silicijum dioksid. Hemikalije nanete na takve kolone kreću se kroz njih različitim brzinama zbog različite raspodele između mobilne faze i ugljovodonične stacionarne faze. Smeše hemikalija razdvajaju se prema njihovoj hidrofobnosti, pri čemu se hemijska jedinjenja koja su rastvorna u vodi izdvajaju prva, a poslednja se izdvajaju ona koja se rastvaraju u uljima, proporcionalno njihovom koeficijentu raspodele ugljovodonik-voda. Ovo omogućava da se ustanovi veza između retencionog vremena na takvoj koloni (reversno-faznoj) i koeficijenta raspodele za sistem n-oktanol/voda. Koeficijent raspodele se izvodi iz faktora kapaciteta k, koji je dat u jednačini:

pri čemu:

tr jeste retenciono vreme supstance koja se ispituje;

to jeste prosečno vreme koje je potrebno molekulu rastvarača da prođe kroz kolonu (mrtvo vreme).

Nije potrebna primena kvantitativnih analitičkih metoda. Mora se odrediti vreme elucije.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

1.5.1. Ponovljivost

Metoda mućkanja u staklenom balonu

U cilju obezbeđivanja tačnosti particionog koeficijenta, neophodno je vršiti po dva određivanja na tri različita uslova ispitivanja pri čemu količina supstance kao i odnos između zapremina rastvarača može da varira. Utvrđene vrednosti particionih koeficijenata izražene u logaritmima treba da budu u okviru ±0,3 jedinice.

HPLC metoda

U cilju obezbeđivanja poverenja u rezultate merenja vrše se dva ispitivanja. Vrednosti log P izvedene iz pojedinačnih merenja treba da se nalaze u opsegu od ±0,1 jedinice log P.

1.5.2. Osetljivost

Metoda mućkanja u staklenom balonu

Opseg merenja ove metode određuje detekcioni limit analitičkog postupka. Detekcioni limit treba da omogući određivanje vrednosti log Pow u opsegu od -2 do 4 (kada postoje uslovi, opseg se može proširiti na vrednosti log Pow do 5) kada koncentracija rastvorene supstance u bilo kom od rastvarača nije veća od 0.01 mol/L.

HPLC metoda

HPLC metoda omogućava određivanje koeficijenta raspodele u opsegu log Pow od 0 do 6.

Koeficijent raspodele jedinjenja u normalnim okolnostima može se utvrditi uz varijaciju od ± 1 log Pow jedinice vrednosti dobijene mućkanjem u staklenom balonu. Načini za uspostavljanje korelacije između ovih vrednosti mogu se naći u literaturi4,5,6,7,8. Veća tačnost postiže se kada se korelacija vrši preko strukturno sličnih referentnih jedinjenja9.

1.5.3. Specifičnosti

Metoda mućkanja u staklenom balonu

Nernstov zakon raspodele primenjuje se samo pri konstantnoj temperaturi, pritisku i pH vrednosti za razblažene rastvore. Primenjuje se samo na čiste supstance raspodeljene između dva čista rastvarača. Prisustvo više različitih rastvorenih supstanci u jednom ili oba rastvarača u isto vreme utiče na rezultate.

Disocijacija ili asocijacija rastvorenih molekula dovodi do odstupanja od Nernstovog zakona raspodele. Na ova odstupanja ukazuje pojava zavisnosti koeficijenta raspodele od koncentracije rastvora.

Zbog postojanja većeg broj ravnoteža, ovu metodu ne treba primenjivati bez prethodne korekcije na supstance koje jonizuju. Kod ovakvih jedinjenja treba razmotriti upotrebu pufera umesto vode. pH vrednost pufera treba da se razlikuje najmanje za jednu pH jedinicu od pKa supstance i treba voditi računa o uticaju te pH vrednosti na životnu sredinu.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Preliminarna procena koeficijenta raspodele

Koeficijent raspodele se najbolje procenjuje primenom računske metode (videti Deo drugi ove metode) ili, kada je moguće, iz odnosa rastvorljivosti ispitivane supstance u čistim rastvaračima10.

1.6.2. Metoda mućkanja u staklenom balonu

1.6.2.1. Priprema

n-oktanol: Za određivanje koeficijenta raspodele koriste se rastvarači visoke čistoće (analitičke čistoće)

Voda: Koristi se destilovana ili bidestilovana voda koja je destilovana u staklenoj ili kvarcnoj aparaturi. Za jedinjenja koje jonizuju koriste se puferski rastvori umesto vode ukoliko je opravdano.

Napomena: Ne koristi se voda koja je prečišćena na jonoizmenjivaču.

1.6.2.1.1. Predzasićenje rastvarača

Pre nego što se pristupi određivanju particionog koeficijenta, rastvarači se zasićuju uzajamno, mućkanjem na temperaturi na kojoj se izvodi eksperiment. Ovo je najbolje uraditi tako što se u dve velike boce u kojima se čuvaju analitički n-oktanol visoke čistoće ili voda doda dovoljna količina onog drugog rastvarača i mućka u mehaničkom šejkeru 24 sata, nakon čega moraju da odstoje sve dok se dva rastvarača ne razdvoje i ne dostigne zasićenje.

1.6.2.1.2. Priprema za ispitivanje

Ukupna količina dva rastvarača treba da skoro napuni sud. Ovako se sprečava gubitak ispitivanog jedinjenja usled isparavanja. Odnos zapremine i količine supstance koja se ispituje određen je:

- preliminarnom procenom koeficijenta raspodele (videti već dato objašnjenje);

- minimalnom količinom supstance koja se ispituje neophodnom za analitički postupak i

- ograničenjima koja se odnose na maksimalnu koncentraciju u oba rastvarača od 0,01 mola po litru.

Sprovode se tri ispitivanja. U prvom ispitivanju koristi se izračunat odnos zapremine n-oktanola prema vodi. U drugom ispitivanju ovaj odnos se deli sa dva. U trećem ispitivanju ovaj odnos množi se sa dva (npr. 1:1, 1:2, 2:1).

1.6.2.1.3. Ispitivana supstanca

Osnovni rastvor se priprema u n-oktanolu zasićenom vodom. Koncentracija osnovnog rastvora treba da bude precizno utvrđena pre nego što se pristupi određivanju koeficijenta raspodele. Rastvor treba čuvati u uslovima koji omogućavaju da bude stabilan.

1.6.2.2. Uslovi ispitivanja

Temperatura ispitivanja treba da bude konstantna (± 1°C) u rasponu od 20°C do 25°C.

1.6.2.3. Merenje

1.6.2.3.1. Uspostavljanje ravnoteže raspodele

Po dve posude koje sadrže željene, precizno izmerene količine dva rastvarača zajedno sa neophodnom količinom osnovnog rastvora treba da budu spremljene za svaki uslov ispitivanja.

Faza n-oktanola meri se zapreminski. Posude za ispitivanje smeštaju se u prikladnu mućkalicu (šejker) ili ih treba ručno izmućkati. Kada se koriste kivete za centrifugiranje preporučeni način rukovanja jeste da se cev rotira brzo za 180° oko transverzalne ose tako da vazduh koji je ušao prođe kroz obe faze. Iskustvo je pokazalo da je 50 takvih rotacija dovoljno da se uspostavi ravnoteža raspodele. Preporučuje se 100 rotacija u roku od 5 minuta.

1.6.3.2. Odvajanje faza

Ako je neophodno, da bi se razdvojile faze, smešu treba centrifugirati. Dvofazni sistem se centrifugira na laboratorijskoj centrifugi, na sobnoj temperaturi ili, ako se koristi centrifuga bez regulacije temperature, kivete treba držati na temperaturi koja odgovara onoj u kojoj se sprovodi čitavo ispitivanje najmanje 1 sat pre ispitivanja.

1.6.2.4. Analiza

Da bi se odredio particioni koeficijent neophodno je odrediti koncentracije ispitivane supstance u obe faze. Ovo se može uraditi uzimanjem alikvota iz svake od dve faze iz svakog ispitivanja i analiziranjem ovih uzoraka. Ukupna količina supstance prisutna u obe faze treba da bude izračunata i upoređena sa količinom supstance koja je uneta na početku testa.

Vodena faza treba da bude uzorkovana postupkom koji smanjuje rizik od uzorkovanja i tragova n-oktanola. Treba koristiti stakleni špric sa iglom za jednokratnu upotrebu za uzorkovanje vodene faze. Špric prethodno treba delimično napuniti vazduhom. Vazduh treba polako istiskivati dok igla prolazi kroz sloj n-oktanola. Zatim se određena količina vodene faze usisa u špric. Špric se brzim pokretom izvuče iz rastvora, a igla odstrani. Sadržaj napunjenog šprica može se tada koristiti kao uzorak vodene faze. Koncentracija u dve različite faze treba da se utvrdi korišćenjem metoda koje su odgovarajuće za svaku od supstanci. Neke od odgovarajućih metoda su:

- fotometrijske metode;

- gasna hromatografija;

- HPLC metoda.

1.6.3. HPLC metoda

1.6.3.1. Priprema

Oprema

Tečni hromatograf sa pumpom bez pulsa i odgovarajući detektor čine neophodnu opremu. Preporučuje se korišćenje injektora sa petljom. Prisustvo polarnih grupa u stacionarnoj fazi može ozbiljno da naruši preciznost kolone za tečnu hromatografiju. U stacionarnoj fazi treba da bude prisutan minimalni procenat polarnih grupa11. Koriste se komercijalna mikročestična reversno-fazna pakovanja ili prethodno pripremljene kolone. Između injektora i kolone može se postaviti predkolona.

Mobilna faza

Za pripremu eluenta koriste se metanol HPLC čistoće i voda HPLC čistoće koji se degaziraju pre upotrebe. Treba koristiti izokratsku eluciju. Preporučuje se odnos metanol/voda sa minimalnim sadržajem vode u iznosu od 25%. Tipična smeša metanola i vode u odnosu 3:1 (v/v) koristi se za eluiranje jedinjenja sa logP 6 u roku od jednog sata, sa protokom od 1 ml/min. Za jedinjenja sa visokim logP nekada je potrebno skratiti vreme eluiranja (kao i za referentne supstance) smanjivanjem polarnosti mobilne faze ili dužine kolone.

Supstance koje su slabo rastvorne u n-oktanolu imaju tendenciju da daju niske log Pow vrednosti pri određivanju HPLC metodom, pikovima takvih smeša je ponekad pridružen front rastvarača. Ovo se može objasniti činjenicom da je proces raspodele previše spor da bi se dostigla ravnoteža u vremenu koje je obično neophodno za HPLC razdvajanje. Smanjenje brzine protoka i/ili snižavanje odnosa metanol/voda mogu pomoći da se u tim slučajevima dobiju pouzdanije vrednosti.

Supstanca koja se ispituje i referentna supstanca treba da budu rastvorne u mobilnoj fazi u dovoljnoj koncentraciji da mogu da se detektuju. Izuzetno se mogu koristiti aditivi kod smeše metanol-voda, pošto aditivi menjaju svojstva kolone. Kod hromatograma koji sadrže aditive obavezno je koristiti zasebne kolone istog tipa. Ukoliko smeša metanol-voda nije odgovarajuća, može se koristiti neka druga smeša organskog rastvarača i vode, npr. etanol i voda ili acetonitril i voda.

Vrednost pH eluenta je kritična kod jedinjenja koja jonizuju. Ova vrednost treba da se kreće u okviru radne pH vrednosti kolone, koja obično iznosi između 2 i 8. Preporučuje se primena pufera. Mora se voditi računa da ne dođe do precipitacije soli na koloni i njenog uništavanja, što se događa kod pojedinih smeša organska faza/pufer. HPLC merenja sa stacionarnom fazom koja je na bazi silicijum-dioksida na pH vrednostima iznad 8 ne preporučuju se pošto alkalne mobilne faze oštećuju kolonu i umanjuju performanse kolone.

Rastvorene supstance

Referentne supstance treba da budu što je moguće čistije. Jedinjenja koje se koriste u ispitivanju ili za kalibraciju treba da budu rastvorna u mobilnoj fazi, ako je moguće.

Uslovi ispitivanja

Temperatura tokom ispitivanja ne treba da varira za više od ±2K.

1.6.3.2. Merenje

Izračunavanje mrtvog vremena to

Mrtvo vreme može se odrediti korišćenjem serije homologa (npr n-alkil metil ketoni) ili organskih jedinjenja koja se ne zadržavaju na koloni (npr. tiokarbamid ili formamid). Da bi se izračunalo mrtvo vreme uz pomoć homologih serija, set od najmanje sedam članova homologe serije se injektuje i mere se retenciona vremena. Retenciona vremena t r (nc + 1) ucrtavaju se na grafiku kao funkcija od t r (n c) i određuju se odsečak a i nagib b u jednačini:

t r (n c + 1) = a + b t r (n c)

pri čemu:

n c jeste broj atoma ugljenika.

Mrtvo vreme se izračunava jednačinom:

to = a/(1 - b)

Kalibraciona kriva

Sledeći korak je da se napravi korelacija između log k vrednosti prema log P vrednostima za odgovarajuće referentne supstance. U praksi, set od između 5 i 10 standardnih referentnih supstanci čija log P vrednost je u očekivanom opsegu injektuje se simultano i određuju se njihova retenciona vremena, po mogućnosti preko integratora koji je povezan sa sistemom za detekciju. Odgovarajuće logaritamske vrednosti faktora kapaciteta (log k) računaju se i ucrtavaju kao funkcije log P koji je utvrđen primenom postupka mućkanja u staklenom balonu. Kalibracija se obavlja u pravilnim intervalima, najmanje jednom dnevno, tako se kompenzuju izmene u performansama kolona.

Utvrđivanje faktora kapaciteta ispitivane supstance

Supstanca koja se ispituje injektuje se u najmanjoj mogućoj količini mobilne faze. Određuje se retenciono vreme (po dva određivanja), što omogućava izračunavanje faktora kapaciteta (k). Sa kalibracione krive referentnih supstanci može se interpolirati koeficijent raspodele ispitivane supstance. Kod veoma niskih i veoma visokih vrednosti koeficijenata raspodele, neophodna je ekstrapolacija. Treba voditi računa o granicama pouzdanosti regresione krive.

2. PODACI

METODA MUĆKANJA U STAKLENOM BALONU

Pouzdanost utvrđenih vrednosti za P može se ispitati poređenjem srednjih vrednosti iz oba ispitivanja sa ukupnom srednjom vrednošću.

3. IZVEŠTAJ

Izveštaj o ispitivanju sadrži podatke o:

- preciznom opisu supstance (identitet i nečistoće);

- kada se metode ne mogu primeniti (npr. površinski aktivne supstance), treba obezbediti računskim putem izvedenu ili procenjenu vrednost na osnovu rastvorljivosti u n-oktanolu i vodi;

- sve podatke i primedbe važne za tumačenje rezultata, naročito podaci o nečistoćama i fizičkom stanju supstance.

Izveštaj o ispitivanju kod postupka mućkanja u staklenom balonu sadrži:

- rezultate preliminarnih ispitivanja, ako postoje;

- temperaturu na kojoj je vršeno određivanje;

- podatke o analitičkim postupcima kojima su određivane koncentracije;

- vreme i brzinu centrifugiranja, ako je vršeno;

- izmerene koncentracije u obe faze kod svakog određivanja (ukupno 12 koncentracija);

- masu ispitivane supstance, zapreminu svake faze u svakoj posudi i ukupne izračunate količine ispitivane supstance prisutne u svakoj fazi nakon uspostavljanja ravnoteže;

- izračunate vrednosti particionog koeficijenta (P) i srednje vrednosti za svaki set uslova ispitivanja kao i srednju vrednost za sva određivanja. Ukoliko se smatra da postoji zavisnost koeficijenta raspodele od koncentracije to treba navesti u izveštaju;

- standardne devijacije individualnih P vrednosti od srednje vrednosti;

- srednju vrednost P od svih određivanja treba da bude izražena u vidu logaritma (osnove 10);

- izračunatu teorijsku vrednost Pow ako je utvrđena ili kada je izmerena vrednost >104;

- pH vrednost korišćene vode i vodene faze tokom eksperimenta;

- ukoliko se koriste puferi, navode se razlozi za njihovu primenu umesto vode, njihov sastav, koncentracija i pH vrednost, pH vodene faze pre i posle eksperimenta.

Izveštaj o ispitivanju za HPLC metodu sadrži:

- rezultate prethodnih ispitivanja, ako postoje;

- ispitivanu supstancu i referentne supstance, i stepen njihove čistoće;

- temperaturni opseg pri ispitivanju;

- pH vrednosti na kojoj je određivan koeficijent raspodele;

- detalje o analitičkoj koloni, predkoloni, mobilnoj fazi i načinima detekcije;

- podatke o retencionim vremenima i literaturnim vrednostima log P referentnih supstanci korišćenih za kalibraciju;

- detalje o regresionoj krivoj (log k prema log P);

- prosečna retenciona vremena i interpolirane vrednosti log P za ispitivano jedinjenje;

- opis opreme i uslova ispitivanja;

- elucioni profil;

- količine ispitivanih i referentnih supstanci koje su unete u kolonu;

- mrtvo vreme i način na koji je izmereno.

4. LITERATURA

1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.

2. C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979.

3. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) - Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.

4. L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683.

5. H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12,219 (1981).

6. B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.

7. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247,1.

8. J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7,675

9. S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15,787

10. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339.

11. R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14,479

12. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71,525.

13. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977.

14. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use - Determination of Partition Coefficients - Flask shakin g method.

15. C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12,1459

16. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525

17. C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.

18. W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8,1113.

19. D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10,382

20. J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979.

21. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam 1984,

22. Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel 1978.

23. N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19,615.

Deo drugi

METODE IZRAČUNAVANJA/PROCENE

UVOD

Opšti uvod za metode izračunavanja, podaci i primeri mogu se naći u literaturia.

Izračunate vrednosti Pow mogu se koristiti u sledeće svrhe:

- da se izabere odgovarajuća eksperimentalna metoda (opseg za metodu mućkanja u staklenom balonu: log Pow: -2 do 4, opseg za HPLC metodu: log Pow od 0 do 6);

- za izbor odgovarajućih uslova ispitivanja (npr. referentne supstance za HPLC postupak, odnos zapremina n-oktanol/voda kod postupka mućkanja u staklenom balonu);

- kao interna laboratorijska provera mogućih eksperimentalnih grešaka;

- da se obezbede procenjene vrednosti za Pow u slučajevima kada se ne mogu primeniti eksperimentalne metode iz tehničkih razloga.

METODA PROCENE

Preliminarna procena particionog koeficijenta

Vrednost particionog koeficijenta može se proceniti na osnovu rastvorljivosti ispitivane supstance u čistim rastvaračima:

METODE IZRAČUNAVANJA

Princip metoda izračunavanja

Sve metode izračunavanja zasnivaju se na fragmentaciji molekula na odgovarajuće manje strukture za koje je poznat doprinos vrednosti Pow. Vrednost log Pow koja se odnosi na čitav molekul izračunava se potom kao zbir odgovarajućih vrednosti fragmenata plus zbir korekcija zbog intramolekulskih interakcija.

Postoje spiskovi konstanti fragmenata i korekcionih članovab, c, d, e. Neke od ovih vrednosti redovno se ažurirajub.

Kriterijumi kvaliteta

Pouzdanost metode izračunavanja opada sa povećanjem složenosti jedinjenja. Kod jednostavnih molekula sa malim molekulskim masama i jednom ili dve funkcionalne grupe, može se očekivati odstupanje od 0,1 do 0,3 jedinica vrednosti log Pow između rezultata različitih metoda fragmentacije i izmerene vrednosti. U slučaju složenijih molekula granica greške može biti i veća. Granica greške zavisi od pouzdanosti i dostupnosti vrednosti konstanti koje se odnose na određene fragmente, kao i od sposobnosti da se prepoznaju intramolekulske interakcije (npr. vodonične veze) i od pravilne upotrebe korekcija (problem je manji ako se koristi kompjuterski softver CLOGP-3)b. Kod jedinjenja koja jonizuju važno je ispravno tumačenje naelektrisanja i stepena jonizacije.

Postupak izračunavanja

Hanšova π- metoda

Originalna konstanta π hidrofobnog supstituenta koju je uveo Fujira sa grupom autoraf definiše se na sledeći način:

πx = log Pow (PhX) - log Pow (PhH)

pri čemu:

Pow (PhX) jeste particioni koeficijent supstituisanog aromatičnog derivata;

Pow (PhH) jeste koeficijent nesupstituisanog jedinjenja.

Na primer: πCl = log Pow (C6H5Cl) - log Pow (C6H6) = 2,84 - 2,13 = 0,71.

U skladu sa definicijom ova metoda se pre svega primenjuje kod aromatičnih supstituenata. π vrednosti za veliki broj ovakvih supstituenata date su u tabelib, c, d. Ove vrednosti se koriste za izračunavanje log Pow za aromatične molekule ili fragmenata.

Rekerova metoda

Prema Rekerug log Pow izračunava se na sledeći način:

pri čemu:

fi jesu konstante različitih fragmenata molekula;

ai jeste učestalost različitih fragmenata molekula u molekulu koji se ispituje.

Korekcioni članovi mogu se izraziti kao proizvod integrala sa jednom konstantom Cm (tzv. magična konstanta). Vrednosti konstanti za fi i cm utvrđene su na osnovu podataka iz spiska u kome se nalazi 1054 eksperimentalno određenih vrednosti Pow (825 jedinjenja), primenom regresione analizec, h. Određivanje interakcijskih termina sprovodi se na osnovu pravila datih u literaturi e, h, i.

Hanš-Leov metod

Prema Hanšu i Leuc vrednost log Pow izračunava se iz jednačine:

pri čemu:

fi jesu konstantne različitih fragmenata molekula;

Fj jeste korektivna vrednost;

a ai i bj jeste odgovarajuća učestalost nalaženja u molekulu.

Izvedene na osnovu vrednosti Pow utvrđenih eksperimentalnim putem, vrednosti konstanti atoma i grupa u molekulu i korektivne vrednosti Fj (tzv. faktori) iz spiska određene su metodom pokušaja i grešaka. Korektivne vrednosti podeljene su u nekoliko različitih klasaa, c. Relativno je komplikovano i oduzima dosta vremena da se vodi računa o svim pravilima i svim korektivnim vrednostima. U tu svrhu razvijeni su odgovarajući softverib.

Kombinovana metoda

Izračunavanje log P vrednosti kod složenih molekulskih struktura može biti znatno poboljšano, ukoliko se molekul razdvoji u veće podstrukture za koje postoje pouzdane log P vrednosti, koje su dostupne u tabelamab, c ili na osnovu sopstvenih merenja. Takvi fragmenti (npr. heterociklična jedinjenja, antrahinon, azobenzen) potom se mogu kombinovati sa Hanšovim π vrednostima ili Rekerovim ili Leovim konstantama.

Napomene:

1) Metoda izračunavanja se može primeniti na delimično ili potpuno jonizovana jedinjenja kada je moguće uzeti u obzir neophodne korektivne faktore.

2) Ukoliko se pretpostavlja postojanje vodoničnih veza, moraju se dodati odgovarajući korektivni faktori (oko +0,6 do +1,0 log Pow jedinica). Prisustvo takvih veza u molekulu može se pretpostaviti na osnovu stereo modela ili na osnovu analize spektroskopskih podataka molekula.

3) Ukoliko je moguće više tautomernih oblika, treba koristiti najverovatniji oblik kao osnovu za proračune.

4) Pažljivo treba pratiti revizije spiska sa konstantama fragmenata molekula.

Izveštaj

Kada se koristi metoda proračuna/procene izveštaj o izvršenom ispitivanju sadrži:

- opis supstance (smeša, nečistoće, itd.);

- indikacije o mogućim vodoničnim vezama, disocijaciji, naelektrisanju i svim drugim efektima (npr. tautomeriji);

- opis metoda izračunavanja;

- identifikacija baze podataka;

- osobenosti pri izboru fragmenata;

- opsežna dokumentacija o proračunima.

Literatura

a. W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

b. Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP -3).

c. C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

d. A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71,525.

e. R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. - Chill. Ther. 1979, vol. 14,479.

f. T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86,5175.

g. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, NewYork, 1977, vol. 1.

h. C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12,1459.

i. R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.

Deo treći

REFERENTNE SUPSTANCE ZA HPLC

A.9. TAČKA PALJENJA

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Pre izvođenja ispitivanja korisno je imati podatke o zapaljivosti supstance. Postupak ispitivanja primenjuje se na tečne supstance čije se pare mogu zapaliti izvorom paljenja. Date metode pouzdane su samo za opsege tačke paljenja koji su dati u pojedinačnim metodama.

Prilikom izbora metode koja će se primenjivati u postupku ispitivanja, uzima se u obzir mogućnost pojave hemijskih reakcija između supstance i posude za uzorak.

1.2. DEFINICIJE I MERNE JEDINICE

Tačka paljenja jeste najniža temperatura, korigovana na pritisak od 101,325 kPa, pri kojoj tečnost proizvodi paru u uslovima definisanim u ovoj metodi, u dovoljnoj količini za stvaranje zapaljive smeše pare i vazduha u tom sudu.

Merne jedinice: stepen Celzijusa (°C).

t = T - 273,15

pri čemu:

t jeste temperatura u stepenima Celzijusa (°C);

T jeste temperatura u stepenima Kelvina (K).

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Prilikom ispitivanja nove supstance nije potrebno u svim slučajevima koristiti referentne supstance. One pre svega služe za povremenu proveru metode, kao i da omoguće poređenje sa rezultatima ostalih metoda.

1.4. PRINCIP METODE

Supstanca se unosi u sud za ispitivanje i zagreva se ili se hladi do temperature ispitivanja u skladu sa postupkom opisanim u pojedinačnoj metodi ispitivanja. Ispitivanje paljenja vrši se radi utvrđivanja da li se uzorak pali na temperaturi ispitivanja.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

1.5.1. Ponovljivost

Ponovljivost varira prema opsegu tačke paljenja i metode koja se koristi, maksimalno 2°C.

1.5.2. Osetljivost

Osetljivost zavisi od korišćene metode ispitivanja.

1.5.3. Specifičnost

Specifičnost nekih metoda ograničena je opsegom tačke paljenja i zavisi od osobina supstance (npr. visoka viskoznost).

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Priprema

Uzorak supstance za ispitivanje unosi se u aparaturu za ispitivanje u skladu sa odeljkom 1.6.3.1, odnosno sa odeljkom 1.6.3.2. ove metode.

Kada se ispituju energijom bogate ili toksične supstance, iz sigurnosnih razloga se preporučuje primena metode koja koristi manju količinu uzorka, oko 2 cm3.

1.6.2. Uslovi ispitivanja

Uređaj treba da bude postavljen u položaj u kom nema spoljašnjih uticaja, vodeći računa o bezbednosti.

1.6.3. Postupak ispitivanja

1.6.3.1. Metoda ravnoteže

Videti standarde: SRPS EN ISO 1516, SRPS EN ISO 3680, SRPS EN ISO 1523, SRPS EN ISO 3679.

1.6.3.2. Metoda neravnoteže

Metoda po Abelu

Videti standard: SRPS EN ISO 13736.

Metoda po Abel-Penskom aparatura

Videti standard: SRPS B.H8.047.

Metoda po TaguXXIV

Metoda po Penski-Martensu

Videti standard: SRPS EN ISO 2719.

_______________
XXIV ASTM D 56

Napomene:

Kada tačka paljenja, određena metodom neravnoteže iz odeljka 1.6.3.2. ove metode, iznosi 0°C ± 2°C, 21°C ± 2°C ili 55°C ± 2°C, tačku paljenja je potrebno potvrditi metodom ravnoteže uz upotrebu iste aparature.

Za davanje podataka koriste se isključivo metode koje daju temperaturu tačke paljenja.

Za određivanje tačke paljenja viskoznih tečnosti (boje, lepkovi i sl.) koje sadrže rastvarače, mogu se koristiti aparatura i metode koji su prikladni za određivanje tačke paljenja viskoznih tečnosti.

Videti standarde: SRPS EN ISO 3679, SRPS EN ISO 3680, SRPS EN ISO 1523.

2. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži:

- tačan opis supstance (identifikaciju i nečistoće);

- podatke o korišćenoj metodi, kao i mogućim odstupanjima;

- rezultate i dodatne napomene značajne za tumačenje rezultata.

A.10. ZAPALJIVOST (ZA ČVRSTE SUPSTANCE)

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Pre izvođenja ispitivanja korisno je imati podatke o mogućim eksplozivnim svojstvima supstance.

Ovo ispitivanje primenjuje se isključivo na praškaste supstance, supstance u obliku paste ili u granulama.

Kako bi se izbeglo da se u ovu kategoriju svrstaju sve zapaljive supstance, već samo one koje brzo gore ili supstance čije je ponašanje u toku gorenja na bilo koji način opasno, u kategoriju lako zapaljivih svrstavaju se samo supstance čija brzina sagorevanja prelazi utvrđene granične vrednosti.

Posebnu opasnost predstavlja širenje usijanja kroz metalni prah zbog poteškoća koje se mogu javiti pri gašenju požara. Metalni prah se smatra visoko zapaljivom supstancom ukoliko podržava širenje usijanja kroz masu u određenom vremenskom roku.

1.2. MERNE JEDINICE

Vreme sagorevanja izražava se u sekundama.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIPI METODE

Supstanca se oblikuje u vidu neprekidne trake ili neprekidnog praškastog traga dužine 250 mm. Preliminarno ispitivanje vrši se sa ciljem da se utvrdi da li dolazi do širenja gorenja sa razvojem plamena ili do tinjanja kada se supstanca zapali plamenikom na gas. Ukoliko se vatra proširi u dužini od 200 mm u određenom vremenskom roku, sprovodi se kompletno ispitivanje kako bi se utvrdila brzina sagorevanja.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Nisu propisani.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Preliminarno ispitivanje

Supstanca se oblikuje u vidu neprekidne trake ili neprekidnog praškastog traga dužine 250 mm, širine 20 mm i visine 10 mm na nezapaljivoj, neporoznoj podlozi koja slabo provodi toplotu. Vreo plamen iz plamenika na gas (minimalni prečnik 5 mm) prinosi se jednom kraju praškastog traga supstance sve dok se prah ne zapali ili maksimalno 2 minuta (5 minuta za metalni prah ili legure metala). Prati se da li se gorenje širi kroz trag u dužini od 200 mm u roku od 4 minuta (ili 40 minuta za metalni prah). Ukoliko se u roku od 4 minuta (ili 40 minuta za metalni prah) supstanca ne zapali i gorenje se ne proširi uz razvijanje plamena ili tinjanje u dužini od 200 mm praškastog traga ispitivane supstance, supstanca se ne smatra lako zapaljivom i nije potrebno vršiti dalje ispitivanje. Ukoliko se za manje od 4 minuta, ili za manje od 40 minuta kada je reč o metalnom prahu, ispitivana supstanca zapali i požar se proširi po uzorku u dužini od 200 mm, primenjuje se postupak iz odeljka 1.6.2. ove metode i ostalih odeljaka.

1.6.2. Određivanje brzine gorenja

1.6.2.1. Priprema

Praškasta ili supstanca u granulama naspe se u kalup dužine 250 mm sa poprečnim presekom u obliku trougla unutrašnje visine 10 mm i širine 20 mm. Sa obe strane kalupa montiraju se dve metalne ploče kao stranični graničnici koji prelaze gornju ivicu kalupa za 2 mm (videti Sliku). Kalup se zatim tri puta ispusti sa visine od 2 cm na čvrstu podlogu. Ukoliko je potrebno kalup se ponovo napuni. Poprečni graničnici se zatim skinu, a višak supstance očisti. Preko kalupa se stavlja ploča od nezapaljivog, neporoznog materijala koji slabo provodi toplotu, cela aparatura se okrene naopako, a zatim se ukloni kalup.

Supstance u obliku paste razmažu se po podlozi koja je napravljena od nezapaljivog, neporoznog materijala koji slabo provodi toplotu u obliku užeta dužine 250 mm sa poprečnim presekom oko 1 cm2.

1.6.2.2. Uslovi ispitivanja

U slučaju supstanci koje su osetljive na vlagu ispitivanje treba izvesti što je brže moguće nakon što se supstanca izvadi iz posude.

1.6.2.3. Postupak ispitivanja

Formira se uzorak i postavlja u digestor.

Brzina protoka vazduha treba da bude dovoljna da spreči širenje dima laboratorijom i da se ne menja tokom ispitivanja. Oko aparature treba da bude podignut zaklon. Vreo plamen iz plamenika na gas (minimalni prečnik 5 mm) koristi se da se zapali supstanca na jednom kraju. Kada se supstanca upali sa razdaljine od 80 mm, na narednih 100 mm meri se brzina gorenja. Ispitivanje se ponavlja šest puta, i svaki put se koristi čista hladna ploča, osim ukoliko se ranije dobiju pozitivni rezultati.

2. PODACI

Za procenu su značajni podaci o: vremenu sagorevanja dobijenom na preliminarnom ispitivanju (odeljak 1.6.1. ove metode) i najkraćem vremenu sagorevanja od najviše šest ispitivanja (odeljak 1.6.2.3. ove metode).

3. IZVEŠTAVANJE

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ako je moguće, sadrži:

- precizan opis supstance (identifikacija i nečistoće);

- opis supstance koju treba ispitati, njeno fizičko stanje uključujući sadržaj vlage;

- rezultate preliminarnog ispitivanja i ispitivanja za utvrđivanje brzine sagorevanja, ukoliko je izvršeno;

- sve dodatne podatke značajne za tumačenje rezultata.

3.2. TUMAČENJE REZULTATA

Praškaste supstance i supstance u obliku grnula ili paste smatraju se lako zapaljivima kada je vreme sagorevanja na bilo kom od sprovedenih ispitivanja opisanih u odeljku 1.6.2. ove metode manje od 45 sekundi. Metalni prah ili legure metala smatraju se lako zapaljivim supstancama kada se mogu zapaliti ili se zona reakcije proširi na ceo uzorak u roku od 10 minuta ili manje.

4. LITERATURA

1. NF T 20-042 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

Slika: Kalup i pribor za pripremu uzorka za ispitivanje (Sve dimenzije izražene su u milimetrima)

S