Prethodni

1.7. OPŠTE PROCEDURE I PREPARATI

Opšti uslovi koji se primenjuju u ispitivanjima navedeni su u Tabeli 2. Oprema i drugi uslovi ispitivanja specifični za svaku pojedinu metodu ispitivanja navedeni su u kod opisa konkretne metode.

Tabela 2: Uslovi u toku ispitivanja

1.7.1. Voda za razblaživanje

Koristi se dejonizovana ili destilovana voda, koja ne sadrži toksične supstance (npr. jone Cu2+) u inhibitornim koncentracijama. Voda ne sme sadržati više od 10% organskog ugljenika koji je unet sa ispitivanim materijalom. Visoka čistoća vode za razblaživanje neophodna je da se eliminišu visoke vrednosti u slepim probama. Kontaminacija može nastati zbog prirodno prisutnih nečistoća, kao i zbog smola jonskih izmenjivača i proizvoda razgradnje poreklom od bakterija i algi. U svakoj ispitivanoj seriji koristi se voda iz istog kontejnera, prethodno proverena pomoću DOC analize. Takva provera nije neophodna za ispitivanje u zatvorenoj boci, ali voda treba da ima malu potrošnju kiseonika.

1.7.2. Osnovni rastvori mineralnih materija

Da bi se pripremili ispitivani rastvori, pripremaju se osnovni rastvori mineralnih materija u odgovarajućim koncentracijama. Mogu se koristiti sledeći osnovni rastvori (sa različitim faktorima razblaženja) za metode: nestajanje DOC, modifikovani OECD skrining test, razvijanje C.4-B, manometrijska respirometrija ispitivanje u zatvorenoj boci.

Faktori razblaženja i priprema mineralne podloge specifična za MITI ispitivanje dati su u konkretnoj metodi ispitivanja.

Osnovni rastvori

Pomoću reagenasa analitičke čistoće pripremaju se osnovni rastvori:

1. rastvoriti u vodi i dopuniti do 1 L (pH rastvora da bude 7,4):

- 8,50 g KH2PO4 (kalijum-dihidrogenfosfat);

- 21,75 gK2HPO4 (dikalijum-hidrogenfosfat);

- 33,40 gNa2HPO4´2H2O (dinatrijum-hidrogenfosfat dihidrat);

- 0,50 gNH4Cl (amonijum-hlorid);

2. rastvoriti u vodi i dopuniti do 1 L:

- 27,50 g CaCl2 (kalcijum-hlorid, bezvodni) ili

- 36,40 g CaCl2´2H2O (kalcijum-hlorid dihidrat);

3. rastvoriti u vodi i dopuniti do 1 L:

- 22,50 g MgSO4´7H2O (magnezijum-sulfat heptahidrat);

4. rastvoriti u vodi i dopuniti do 1 L:

- 0,25 g FeCl3´6H2O (gvožđe(III)-hlorid heksahidrat).

Napomena: Za izbegavanje pripreme ovog rastvora neposredno pre upotrebe, dodaje se jedna kapljica koncentrovane HCl ili 0,4 g/l natrijumove soli EDTA (etilendiamintetra sirćetna kiselina).

1.7.3. Osnovni rastvori hemikalija

U zavisnosti od potrebe, rastvori se od 1 g do 10 g ispitivane ili referentne hemikalije u dejonizovanoj vodi i dopuni do 1 L nakon što rastvorljivost premaši vrednost 1 g/l. U suprotnom, osnovni rastvori se pripremaju u mineralnoj podlozi ili se hemikalija dodaje direktno u mineralnu podlogu. Za postupanje sa slabije rastvorljivim hemikalijama, videti Deo treći ove metode. U MITI ispitivanju (Metoda C.4-F) ne dozvoljava se upotreba rastvarača ni emulgatora.

1.7.4. Inokulumi

Inokulum može da potiče iz raznih izvora, kao što su: aktivni mulj, otpadna voda (dehlorisana), površinske vode i zemljište ili iz smeše ovih izvora. Ako se u ispitivanjima nestajanja DOC, razvijanja C.4-B i manometrijskoj respirometriji koristi aktivni mulj, mulj se uzima iz postrojenja za prečišćavanje otpadnih voda ili iz uređaja laboratorijskog tipa, koji prima pretežno otpadnu vodu iz domaćinstava. Pokazalo se da je rasipanje rezultata veće kad se koriste inokulumi iz drugih izvora. Za modifikovani OECD skrining test i ispitivanje u zatvorenoj boci, potreban je razređeniji inokulum bez folikula mulja, pa se uzima sekundarni efluent iz postrojenja za prečišćavanje komunalnih otpadnih voda ili uređaja laboratorijskog tipa. Za MITI ispitivanje, inokulum se izvodi iz mešanih izvora i dat je u konkretnoj metodi ispitivanja.

1.7.4.1. Inokulum iz aktivnog mulja

Svež uzorak aktivnog mulja uzima se iz aeracionog bazena postrojenja za prečišćavanje otpadnih voda ili uređaja laboratorijskog tipa u kojem se pretežno obrađuje komunalna otpadna voda. Veće grube čestice po potrebi se uklanjaju pomoću filtracije kroz fino sito, a mulj se nakon toga čuva u aerobnim uslovima.

Alternativno, nakon uklanjanja većih čestica, mulj se taloži ili centrifugira (npr. na 100 g u toku 10 minuta). Supernatant se baca. Mulj se može isprati u mineralnoj podlozi. Koncentrovani mulj se suspenduje u mineralnoj podlozi da se dobije koncentracija od 3 g do 5 g suspendovanih materija po litru i aeracija se sprovodi do upotrebe.

Mulj se uzima iz konvencionalnog uređaja koji ispravno radi. Mulj isprati ukoliko se uzima iz velikog uređaja za prečišćavanje ili se smatra da sadrži inhibitore. Nakon što se temeljno promeša, resuspendovani mulj se taloži ili centrifugira, supernatant se baca, a isprani mulj se ponovno resuspenduje u novoj zapremini mineralne podloge. Postupak se ponavlja sve dok se iz mulja ne odstrani višak supstrata ili inhibitora.

Nakon što se postigne potpuna resuspenzija ili sa neobrađenim muljem, uzima se uzorak neposredno pre određivanja suve mase suspendovanih materija.

Sledeća alternativa je homogenizacija aktivnog mulja (od 3 g/l do 5 g/l suspendovanih materija). Mulj se meša u mehaničkoj mešalici u toku 2 minuta umerenom brzinom. Promešani mulj se taloži 30 minuta ili duže, po potrebi, a tečni deo koji se koristi kao inokulum dekantuje se na 10 ml mineralne podloge.

1.7.4.2. Ostali izvori inokuluma

Inokulum može da se uzme iz sekundarnog efluenta iz postrojenja za prečišćavanje ili uređaja laboratorijskog tipa koji prima uglavnom otpadne vode iz domaćinstava. Uzme se sveži uzorak i čuva u aerobnim uslovima u toku transporta. Uzorak se taloži u toku 1 sata ili filtrira kroz grubi filter papir, a efluent ili filtrat se dekantuje i čuva u aerobnim uslovima do upotrebe. Može se koristiti do 100 ml ove vrste inokuluma po litru podloge.

Izvor inokuluma mogu da budu i površinske vode. U tom slučaju uzima se uzorak odgovarajuće površinske vode, npr. iz reke ili jezera, i čuva u aerobnim uslovima do upotrebe. Po potrebi, inokulum se koncentriše filtriranjem ili centrifugiranjem.

1.7.5. Prekondicioniranje inokuluma

Inokulumi se mogu prekondicionirati za ispitivane uslove, ali se ne mogu preadaptirati za ispitivanu hemikaliju. Prekondicioniranje se sastoji od aeracije aktivnog mulja u mineralnoj podlozi ili sekundarnom efluentu u toku 5 do 7 dana na ispitivanoj temperaturi. Prekondicioniranje nekada poboljšava preciznost postupka ispitivanja, jer smanjuje vrednosti slepe probe. Smatra se da nije potrebno prekondicionirati MITI inokulum.

1.7.6. Abiotička kontrola

Po potrebi se proverava moguća abiotička razgradnja ispitivane supstance određivanjem uklanjanja DOC, potrošnje kiseonika i razvijanja ugljen-dioksida u sterilnim kontrolama koje ne sadrže inokulum. Sterilizacija se vrši filtracijom kroz membranu promera od 0,2 µm do 0,45 µm ili dodavanjem odgovarajuće toksične supstance u odgovarajućoj koncentraciji. Ako se koristi membranska filtracija, uzorci se uzimaju aseptički da se održi sterilnost. Testovi koji mere biorazgradnju kao uklanjanje DOC, posebno sa inokulumima aktivnog mulja, sadrže i abiotičku kontrolu, koja je inokulisana i otrovana, osim u slučaju kad se prethodno isključila adsorpcija ispitivane hemikalije.

1.7.7. Broj posuda za ispitivanje

Broj posuda u tipičnom načinu ispitivanja dat je u pojedinačnom ispitivanju.

Mogu se koristiti sledeće vrste posuda:

1) ispitivana suspenzija:

- sadrži ispitivanu supstancu i inokulum;

2) slepa proba sa inokulumom:

- sadrži samo inokulum;

3) kontrola postupka:

- sadrži referentnu supstancu i inokulum;

4) sterilna abiotička kontrola:

- sadrži ispitivanu supstancu (videti odeljak 1.7.6. ove metode);

5) kontrola adsorpcije:

- sadrži ispitivanu supstancu, inokulum i sredstvo za sterilizaciju;

6) kontrola toksičnosti:

- sadrži ispitivanu supstancu, referentnu supstancu i inokulum.

Određivanje u ispitivanoj suspenziji i slepoj probi sa inokulumom obavezno se rade uporedo. Savetuje se da se i određivanja u ostalim posudama rade uporedo.

Uporedo određivanje nekada nije moguće. Vodi se računa da se uzme dovoljno uzoraka i izvrši dovoljno merenja da se može proceniti procenat uklanjanja nakon desetodnevnog perioda.

1.8. PODACI I PROCENA

Kad se izračunava procenat razgradnje (Dt) koriste se srednje vrednosti dvostrukih merenja parametara u posudi za ispitivanje i slepoj probi sa inokulumom. Formule za izračunavanje date su u pojedinim metodama ispitivanja. Tok razgradnje prikazuje se grafički i pokazuje se desetodnevni period. Izračunava se i prikazuje procenat uklanjanja koji je postignut na kraju desetodnevnog perioda i vrednost na platou ili na kraju ispitivanja, u zavisnosti šta je primerenije.

U respirometrijskim ispitivanjima jedinjenja koja sadrže azot mogu uticati na potrošnju kiseonika zbog nitrifikacije (videti Deo drugi i Deo peti ove metode).

1.8.1. Razgradnja merena pomoću određivanja DOC

Procenat razgradnje (Dt) u trenutku uzimanja uzorka izračunava se posebno za svaku posudu koja sadrži ispitivanu supstancu pomoću srednjih vrednosti DOC iz dva merenja da bi se mogla proceniti prihvatljivost ispitivanja (videti odeljak 1.6.2. ove metode). Procenat razgradnje se izračunava prema jednačini:

pri čemu:

Dt jeste procenat razgradnje u vremenu t;

C0 jeste srednja početna koncentracija DOC u inokulisanoj podlozi koja sadrži ispitivanu supstancu (u mg DOC/l);

Ct jeste srednja koncentracija DOC u inokulisanoj podlozi koja sadrži ispitivanu supstancu u vremenu t (u mg DOC/l);

Cb0 jeste srednja početna koncentracija DOC u mineralnoj podlozi inokulisanoj slepom probom (u mg DOC/l);

Cbt jeste srednja koncentracija DOC u mineralnoj podlozi inokulisanom slepom probom u vremenu t (u mg DOC/l).

Sve koncentracije mere se eksperimentalno.

1.8.2. Razgradnja koja se meri pomoću specifične analize

Primarna biorazgradnja, kad postoje podaci za specifičnu analizu, izračunava se prema formuli:

pri čemu:

Dt jeste procenat razgradnje u vremenu t koje uobičajeno iznosi 28 dana;

Sa jeste ostatak ispitivane supstance u inokulisanoj podlozi na kraju ispitivanja (mg);

Sb jeste ostatak ispitivane supstance u slepoj probi sa vodom/podlogom kojoj je dodata samo ispitivana supstanca (mg).

1.8.3. Abiotička razgradnja

Procenat abiotičke razgradnje, kad se koristi abiotička sterilna kontrola, izračuna se pomoću formuli:

pri čemu:

Cs(0) jeste DOC koncentracija u sterilnoj kontroli na dan 0;

Cs(t) jeste DOC koncentracija u sterilnoj kontroli na dan t.

1.9. IZVEŠTAJ

Izveštaj o ispitivanju sadrži podatke o:

- ispitivanim i referentnim hemikalijama i njihovim čistoćama;

- uslovima u toku ispitivanja;

- inokulumu: priroda i mesto/mesta uzimanja uzorka, koncentracija i svaka obrada prekondicioniranjem;

- udelu i prirodi industrijskog otpada prisutnog u otpadnoj vodi (ako je poznato);

- dužini ispitivanja i temperaturi;

- u slučaju slabo rastvorljivih ispitivanih hemikalija, podatke o pripremi ukoliko je bilo,

- primenjenoj metodi ispitivanja (daju se naučni razlozi i objašnjenja za svaku izmenu u postupku);

- obrascu za unos podataka;

- svakoj primećenoj pojavi inhibicije;

- svakoj primećenoj abiotičkoj razgradnji;

- specifičnim hemijskim analizama, ako postoje;

- analitičkim podacima o međuproizvodima, ako postoje;

- grafičkim prikazima procenta razgradnje u vremenu za određenu ispitivanu i referentnu supstancu; faza odgode, faza razgradnje, desetodnevni period i nagib jasno se označavaju (videti odeljak 1.2. ove metode). Ako je ispitivanje zadovoljilo kriterijume prihvatljivosti, srednje vrednosti procenta razgradnje u posudama koje sadrže ispitivanu supstancu mogu se upotrebiti za izradu grafičkog prikaza;

- procentu uklanjanja nakon desetodnevnog perioda, kao i na platou ili na kraju ispitivanja.

2. METODA ISPITIVANJA NESTAJANJE DOC
(METODA C.4-A)

2.1. PRINCIP METODE

Izmerena zapremina inokulisane mineralne podloge koja sadrži poznatu koncentraciju ispitivane supstance (10 mg DOC/l do 40 mg DOC/l) kao jedini nominalni izvor organskog ugljenika aeriše se u mraku ili pod difuznim osvetljenjem na temperaturi od 22° C ± 2° C.

Nakon razgradnje sledi DOC analiza u čestim vremenskim intervalima u toku perioda od 28 dana. Stepen biorazgradnje izračunava se prikazivanjem koncentracije uklonjenog DOC (korigovan za onaj DOC u kontroli sa inokulisanom slepom probom) kao procenta od koncentracije prisutne na početku. Stepen primarne biorazgradnje može se izračunati i iz dopunske hemijske analize sprovedene na početku i na kraju inkubacije.

2.2. OPIS METODE

2.2.1. Oprema

Oprema za ispitivanje sadrži:

- erlenmajer sudove 250 ml do 2 L, u zavisnosti od zapremine potrebne za DOC analizu;

- mešalicu u koju se mogu pričvrstiti erlenmajer sudovi (sa ili bez automatske kontrole temperature ili se koriste pri konstantnoj sobnoj temperaturi), dovoljne snage da održi aerobne uslove u svim posudama;

- uređaj za filtriranje, sa odgovarajućim membranama;

- DOC analizator;

- uređaj za određivanje rastvorenog kiseonika;

- centrifugu.

2.2.2. Priprema mineralne podloge

Za pripremu osnovnog rastvora videti odeljak 1.8.2. ove metode.

Pomeša se 10 ml osnovnog rastvora 1. sa 800 ml vode za razblaživanje, doda se 1 ml osnovnih rastvora 2. do 4. i dopuni se do 1 L vodom za razblaživanje.

2.2.3. Priprema i prekondicioniranje inokuluma

Inokulum se može uzeti iz raznih vrsta izvora: aktivnog mulja, komunalnog efluenta, površinskih voda, zemljišta ili smeše istih.

Videti odeljke 1.7.4, 1.7.4.1, 1.7.4.2. i 1.7.5. ove metode.

2.2.4. Priprema posuda za ispitivanje

Ulije se 800 ml mineralne podloge u dvolitarske erlenmajer sudove i dodaju se dovoljne zapremine osnovnih rastvora ispitivanih i referentnih supstanci u odvojene sudove tako da se dobije koncentracija hemijskog ekvivalenta 10 mg DOC/ldo 40 mg DOC/l. Provere se pH vrednosti i dovedu, po potrebi, do 7,4. Aktivni mulj ili drugi izvori inokuluma (videti odeljak 1.7.4. ove metode) inokuliraju se u obične sudove tako da se dobije konačna koncentracija do najviše 30 mg/l suspendovanih materija. Pripreme se i kontrole inokuluma u mineralnoj podlozi, ali bez ispitivane ili referentne hemikalije.

Po potrebi, jedna posuda se koristi za proveru mogućeg inhibitornog efekta ispitivane hemikalije inokulacijom rastvora koji sadrži, u mineralnoj podlozi, slične koncentracije kako ispitivane, tako i referentne hemikalije.

Ako je potrebno postavi se još jedan sterilan običan sud da se pomoću neinokulisanog rastvora hemikalije proveri da li se hemikalija abiotički razgrađuje (videti odeljak 1.7.6. ove metode).

Ako se sumnja da se ispitivana hemikalija značajno adsorbuje na staklo, mulj, idr. napravi se preliminarna procena da se odredi verovatni opseg adsorpcije i tako pogodnost metode ispitivanja za date hemikalije (videti Tabelu 1). Postavi se običan sud koji sadrži ispitivanu supstancu, inokulum i sredstvo za sterilizaciju.

Zapremina u svim običnim sudovima se dopuni do 1 L mineralnom podlogom i nakon mešanja, uzima se uzorak iz svakog običnog suda da se odredi početna koncentracija DOC (videti odeljak 2.4. ove metode). Otvori običnih sudova se pokriju, npr. aluminijskom folijom, ali tako da se omogući slobodna razmena vazduha između običnog suda i okolne atmosfere. Zatim se posuda stavi na mešalicu da bi se započelo ispitivanje.

2.2.5. Broj običnih sudova u tipičnom ispitivanju

- ispitivana suspenzija: obični sudovi br. 1 i 2;

- slepa proba sa inokulumom: obični sudovi br. 3 i 4;

- kontrola postupka: običan sud broj 5.

Preporučeno i po potrebi:

- sterilna abiotička kontrola: običan sud broj 6;

- kontrola adsorpcije: običan sud broj 7;

- kontrola toksičnosti: običan sud broj 8.

Videti odeljak 1.7.7. ove metode.

2.2.6. Postupak

Tokom ispitivanja, koncentracije DOC u svakom običnom sudu određuju se u duplikatu u poznatim vremenskim intervalima, dovoljno često da se može odrediti početak desetodnevnog perioda i procenat uklanjanja na kraju desetodnevnog perioda. Uzima se samo minimalna zapremina ispitivane suspenzije potrebna za svako određivanje.

Pre uzimanja uzoraka gubitak nastao isparavanjem iz tikvica po potrebi se nadoknađuje dodavanjem vode za razblaživanje (videti odeljak 1.8.1. ove metode) u odgovarajućoj količini. Pre uzimanja uzorka, podloga za kulturu temeljno se promeša i osigura se da materijal koji prileže uz zidove posude bude rastvoren i suspendovan. Filtrira se kroz membrane ili centrifugira (videti odeljak 2.4. ove metode) odmah nakon uzimanja uzorka. Filtrirani ili centrifugirani uzorci analiziraju se istog dana; u suprotnom, čuvaju se najviše 48 sati na temperaturi od 2° C do 4° C ili na temperaturi ispod - 18° C u toku dužeg perioda.

2.3. PODACI I IZVEŠTAJ

2.3.1. Obrada rezultata

Izračuna se procenat razgradnje u vremenu t kako je opisano u odeljku 1.8.1. ove metode (određivanje DOC) i, po izboru, u odeljku 1.8.2. ove metode (specifična analiza).

Rezultati se zapisuju na obrascima za unos podataka.

2.3.2. Prihvatljivost rezultata

Videti odeljak 1.6.2. ove metode.

2.3.3. Izveštaj

Videti odeljak 1.9. ove metode.

2.4. OBRASCI ZA UNOS PODATAKA

Primer obrasca za unos podataka:

METODA ISPITIVANJA NESTAJANJA DOC

1. LABORATORIJA

2. DATUM POČETKA ISPITIVANJA

3. ISPITIVANA SUPSTANCA

Hemijski naziv:

Koncentracija osnovnog rastvora:... mg/l kao hemikalija

Početna koncentracija u podlozi, do/prema:... mg/l kao hemikalija

4. INOKULUM

Izvor:

Sprovedena obrada:

Prekondicioniranje, ako je sprovedeno:

Koncentracija suspendovanih materija u reakcionoj smeši: … mg/l

5. ODREĐIVANJE UGLJENIKA

Analizator ugljenika:

6. PROCENA NEOBRAĐENIH PODATAKA

Napomena: Za referentne hemijske kontrole i kontrole toksičnosti mogu se koristiti slični obrasci.

7. ABIOTIČKA KONTROLA (po izboru)

8. SPECIFIČNA HEMIJSKA ANALIZA (po izboru)

3. MODIFIKOVANI OECD SKRINING TEST
(METODA C.4-B)

3.1. PRINCIP METODE

Izmerena zapremina mineralne podloge koja sadrži poznatu koncentraciju ispitivane supstance (10 mg DOC/l do 40 mg DOC/l) kao jedini nominalni izvor organskog ugljenika inokulira se sa 0,5 ml efluenta po litru medijuma. Smeša se aeriše u mraku ili pod difuznim osvetljenjem na 22° C ± 2° C.

Nakon razgradnje sledi DOC analiza u čestim razmacima u toku 28 dana. Stepen biorazgradnje izračunava se prikazivanjem koncentracije uklonjenog DOC (korigovanog za onaj u kontroli koju predstavlja inokulisana slepa proba) kao procenat od koncentracije prisutne na početku. Stepen primarne biorazgradnje može se izračunati iz dodatne hemijske analize koja se radi na početku i na kraju inkubacije.

3.2. OPIS METODE

3.2.1. Oprema

Oprema za ispitivanje sadrži:

- erlenmajer sudove zapremine od 250 ml do 2 L, u zavisnosti od zapremine potrebne za DOC analizu;

- mešalicu (u koju se mogu pričvrstiti erlenmajer sudovi sa automatskom kontrolom temperature ili bez, ako se koriste pri konstantnoj sobnoj temperaturi) dovoljne snage da održi aerobne uslove u svim posudama;

- uređaj za filtriranje, sa odgovarajućim membranama;

- DOC analizator;

- uređaj za određivanje rastvorenog kiseonika;

- centrifugu.

3.2.2. Priprema mineralne podloge

Za pripremu osnovnog rastvora, videti odeljak 1.7.2. ove metode.

Pomešati 10 ml osnovnog rastvora 1. sa 80 ml vode za razblaživanje, dodati 1 ml osnovnog rastvora 2. do 4. i dopuniti vodom za razblaživanje do ukupne zapremine od 1 L.

U ovom postupku se koristi samo 0,5 ml/l efluenta kao inokulum, pa bi podlogu trebalo obogatiti elementima u tragovima i faktorima rasta. To se postiže dodatkom 1 ml svakog od sledećih rastvora po litru gotove podloge:

1. Rastvor elemenata u tragovima:

- 39,9 mg MnSO4´4H2O (mangan-sulfat tetrahidrat);

- 57,2 mg H3BO3 (borna kiselina);

- 42,8 mg ZnSO4´7H2O (cink-sulfat heptahidrat);

- 34,7 mg (NH4)6Mo7O24 (amonijum heptamolibdat);

- 100,0 mg FeCl3 i EDTA (helat gvožđa).

Rastvoriti u vodi za razblaživanje i dopuniti vodom do ukupno 1.000 ml.

2. Rastvor vitamina:

- ekstrakt kvasca 15,0 mg.

Rastvoriti ekstrakt kvasca u 100 ml vode. Sterilisati filtracijom kroz membranu od 0,2 µ ili pripremiti neposredno pred upotrebu.

3.2.3. Priprema i prekondicioniranje inokuluma

Inokulum se uzima iz sekundarnog efluenta iz postrojenja za prečišćavanje ili uređaja laboratorijskog tipa koji prima pretežno otpadnu vodu iz domaćinstava. Videti odeljke 1.7.4.2. i 1.7.5. ove metode.

Koristi se 0,5 ml po litru mineralnog medijuma.

3.2.4. Priprema običnih sudova

Sipa se 800 ml mineralne podloge u dvolitarske erlenmajer sudove i doda se dovoljno velika zapremina osnovnih rastvora ispitivane i referentne supstance u odvojene obične sudove da se dobije koncentracija hemijskog ekvivalenta 10 mg DOC/l do 40 mg DOC/l. Proveri se pH vrednost i po potrebi dovede na 7,4. Izlazni efluent inokuliše se u obične sudove u koncentraciji od 0,5 ml po litru (videti odeljak 1.7.4.2. ove metode). Pripreme se i kontrole inokuluma u mineralnoj podlozi, ali bez ispitivane ili referentne hemikalije.

Po potrebi, koristi se jedna posuda da se proveri mogući inhibitorni efekat ispitivane hemikalije inokulacijom rastvora koji sadrži, u mineralnoj podlozi, slične koncentracije i ispitivane i referentne hemikalije.

Ako je potrebno, postavi se još jedan sterilan običan sud da se pomoću neinokulisanog rastvora hemikalije proveri da li se ispitivana hemikalija razgrađuje abiotički (videti odeljak 1.8.6. ove metode).

Ako se sumnja da se ispitivana hemikalija značajno adsorbuje na staklo, mulj, itd. radi se preliminarna procena da se odredi verovatni opseg adsorpcije i time pogodnost metode za ispitivanje te hemikalije (videti Tabelu 1). Postavi se običan sud koji sadrži ispitivanu supstancu, inokulum i sredstvo za sterilizaciju.

U sve obične sudove dodaje se mineralna podloga do zapremine od 1 L. Nakon mešanja, uzima se uzorak iz svakog pojedinog običnog suda da se odredi početna koncentracija DOC (videti odeljak 2.4. ove metode). Pokriju se otvori običnih sudova, npr. sa aluminijskom folijom, ali tako da se omogući razmena vazduha između običnog suda i okolne atmosfere. Zatim se posude stavljaju na mešalicu i započinje se sa ispitivanjem.

3.2.5. Broj običnih sudova u tipičnom ispitivanju

Redni broj običnih sudova:

- ispitivana suspenzija: obični sudovi br. 1 i 2;

- slepa proba sa inokulumom: obični sudovi br. 3 i 4;

- kontrola postupka: običan sud broj 5.

Preporučeno i po potrebi:

- sterilna abiotička kontrola: običan sud broj 6;

- kontrola adsorpcije: običan sud broj 7;

- kontrola toksičnosti: običan sud broj 8.

Videti odeljak 1.7.7. ove metode.

3.2.6. Postupak

Tokom čitavog ispitivanja, koncentracije DOC određuju se u svakom običnom sudu u duplikatu u poznatim vremenskim intervalima, dovoljno često da se može odrediti početak desetodnevnog perioda i procenat uklanjanja na kraju desetodnevnog perioda. Uzima se samo minimalna zapremina ispitivane suspenzije potrebne za svako određivanje.

Pre uzimanja uzoraka zapremina koja se izgubila isparavanjem iz tikvica nadoknađuje se po potrebi dodavanjem vode za razblaživanje (videti odeljak 1.7.1. ove metode) u odgovarajućoj količini. Pre uzimanja uzorka, podloga se temeljno promeša i pazi se da materijal koji prileže uz zidove posude bude rastvoren ili suspendovan. Odmah nakon uzimanja, uzorak se membranski filtrira ili centrifugira (videti odeljak 2.4. ove metode). Filtrirani ili centrifugirani uzorci analiziraju se istog dana; u suprotnom, čuvaju se na 2° C do 4° C u toku najviše 48 sati ili na temperaturi manjoj od - 18° C u toku dužeg perioda.

3.3. PODACI I IZVEŠTAJ

3.3.1. Obrada rezultata

Izračuna se procenat razgradnje u vremenu t kako je dato u odeljku 1.8.1. ove metode (DOC određivanje) i po izboru, u odeljku 1.8.2. ove metode (specifična analiza).

Rezultati se zapisuju na obrascima za unos podataka.

3.3.2. Prihvatljivost rezultata

Videti odeljak 1.6.2. ove metode.

3.3.3. Izveštaj

Videti odeljak 1.9. ove metode.

3.4. OBRASCI ZA UNOS PODATAKA

Primer obrasca za unos podataka:

MODIFIKOVANAOECDTRIJAŽA

1. LABORATORIJA

2. DATUM POČETKA ISPITIVANJA

3. ISPITIVANA SUPSTANCA

Hemijski naziv:

Koncentracija osnovnog rastvora:... mg/l kao hemikalija

Inicijalna koncentracija u podlozi, do:... mg/l kao hemikalija

4. INOKULUM

Izvor:

Obavljena obrada:

Prekondicioniranje, ako je obavljeno:

Koncentracija suspendovanih materija u reakcionoj smeši: … mg/l

5. ODREĐIVANJE UGLJENIKA

Analizator ugljenika:

6. PROCENA NEOBRAĐENIH PODATAKA

Napomena: Za referentne hemijske kontrole i kontrole toksičnosti mogu se koristiti slični obrasci.

7. ABIOTIČKA KONTROLA (po izboru)

8. SPECIFIČNA HEMIJSKA ANALIZA (po izboru)

4. RAZVIJANJE METODE C.4-B (METODA C.4-C)

4.1. PRINCIP METODE

Izmerena zapremina inokulisane mineralne podloge koja sadrži poznatu koncentraciju ispitivane hemikalije (10 mg do 20 mg DOC ili TOC/l) kao jedini nominalni izvor organskog ugljenika aeriše se prolaskom vazduha bez ugljen-dioksida pri kontrolisanoj brzini u mraku ili pod difuznim osvetljenjem. Razgradnja se prati u toku 28 dana određivanjem proizvedenog ugljen-dioksida, koji se hvata barijum ili natrijum hidroksidom i meri titracijom rezidualnog hidroksida ili kao neorganski ugljenik. Količina ugljen-dioksida proizvedena iz ispitivane hemikalije (korigovano za onu količinu izvedenu iz slepe probe sa inokulumom) izražava se kao procenat ThC.4-B. Stepen biorazgradnje može se izračunati iz dodatne DOC analize koja se obavlja na početku i na kraju inkubacije.

4.2. OPIS METODE

4.2.1. Oprema

Oprema za ispitivanje sadrži:

- obične sudove, od 2 L do 5 L, svaki opremljen sa cevčicom za vazduh koja doseže skoro do dna posude i otvorom;

- magnetne mešalice, ako se ispituju slabo rastvorljive hemikalije;

- boce za apsorpciju gasova;

- uređaj za kontrolu i merenje protoka vazduha;

- opremu za uklanjanje ugljen-dioksida, tj. za pripremu vazduha koji ne sadrži ugljen-dioksid; alternativno se može koristiti smeša kiseonika bez C.4-B i azota bez C.4-B, iz gasnih cilindara, u pravoj proporciji (20% O2 : 80% N2);

- uređaj za određivanje ugljen-dioksida, ili titrimetrijski ili pomoću nekog tipa analizatora neorganskog ugljenika;

- uređaj za membransku filtraciju (nije obavezan);

- DOC analizator (nije obavezan).

4.2.2. Priprema mineralne podloge

Za pripremu osnovnog rastvora videti odeljak 1.8.2. ove metode.

Pomeša se 10 ml osnovnog rastvora 1. sa 800 ml vode za razblaživanje, doda se 1 ml osnovnog rastvora 2. do 4. i dopuni vodom za razblaživanje do ukupno 1 L.

4.2.3. Priprema i prekondicioniranje inokuluma

Inokulum se može uzeti iz raznih izvora: aktivnog mulja; efluenata otpadne vode; površinskih voda, zemljišta ili iz smeše istih.

Videti odeljke 1.7.4, 1.7.4.1, 1.7.4.2. i 1.7.5. ove metode.

4.2.4. Priprema običnih sudova

Kao primer, dole navedene zapremine i težine pokazuju vrednosti koje se koriste za petolitarske obične sudove koje sadrže 3 L suspenzije. Ako se koriste manje zapremine, vrednosti se prilagođavaju, s tim da se stvoreni ugljen-dioksid tačno meri.

U svaki petolitarski običan sud sipa se 2.400 ml mineralne podloge. Doda se odgovarajuća zapremina pripremljenog aktivnog mulja (videti odeljak 1.7.4.1. i 1.7.5. ove metode) tako da se u konačnoj inokulisanoj mešavini od 3 L dobije koncentracija suspendovanih materija od najviše 30 mg/l. Alternativno, prvo se može razrediti pripremljeni mulj da se formira suspenzija od 500 mg/l do 1.000 mg/l u mineralnoj podlozi pre dodavanja uzorka - tako da se dobije koncentracija od 30 mg/l. Postupak obezbeđuje veću preciznost. Mogu se koristiti i ostali izvori inokuluma (videti odeljak 1.7.4.2. ove metode).

Inokulirane smeše aerišu se vazduhom koji ne sadrži C.4-B u toku noći, da se sistem pročisti od ugljen-dioksida.

Ispitivani materijal i referentna supstanca dodaju se odvojeno, kao poznate zapremine osnovnih rastvora, u običnim sudovima u duplikatu, tako da finalne koncentracije, kojima su doprinele dodate hemikalije, budu od 10 mg do 20 mg DOC ili TOC/l. U neke obične sudove ne dodaju se hemikalije i one služe kao kontrola inokuluma. Slabo rastvorljive ispitivane supstance dodaju se direktno u obične sudove na bazi težine ili zapremine, kao što je opisano u Delu trećem ove metode.

Po potrebi, jedan običan sud se koristi za proveru mogućeg inhibitornog efekata ispitivane hemikalije tako što se dodaju i ispitivana i referentna hemikalija u istim koncentracijama u kojima su prisutne u drugim običnim sudovima.

Po potrebi, jedan sterilan običan sud koristi se kako bi se upotrebom neinokulisanog rastvora hemikalije proverilo da li se ispitivana hemikalija razgrađuje abiotički (videti odeljak 1.8.6. ove metode). Steriliše se dodavanjem toksične supstance u odgovarajućoj koncentraciji.

Suspenzija se u svim običnim sudovima dopuni do zapremine od 3 L dodavanjem mineralne podloge prethodno aerisane vazduhom koji ne sadrži C.4-B. Po izboru, mogu se izvući uzorci za analizu DOC (videti Deo drugi ove metode), odnosno uzorci za specifičnu analizu. Apsorpcione boce spajaju se sa otvorima za vazduh na običnim sudovima.

Ako se koristi barijum-hidroksid, spoje se tri apsorpcione boce, od kojih svaka sadrži 100 ml rastvora barijum-hidroksida od 0,0125 M, u seriji sa svakim petolitarskim običnim sudom. Navedeni rastvor ne sadrži istaloženi sulfat ni karbonat i njegova jačina se određuje neposredno pre upotrebe. Ako se koristi natrijum hidroksid, spajaju se dve klopke, od kojih druga ima ulogu kontrole, da se pokaže da se sav ugljen-dioksid apsorbovao u prvoj. Pogodne su apsorpcione boce sa gumenim čepom. U svaku bocu se doda po 200 ml 0,05 M natrijum-hidroksida, što je dovoljno da se apsorbuje ukupna količina ugljen-dioksida koja se razvije kad ispitivana hemikalija bude potpuno razgrađena. Rastvor natrijum-hidroksida, čak i kad je sveže pripremljen, sadrži tragove karbonata, što se koriguje oduzimanjem vrednosti karbonata u slepoj probi.

4.2.5. Broj običnih sudova u tipičnom ispitivanju

Redni broj običnih sudova:

- ispitivana suspenzija: obični sudovi br. 1 i 2;

- slepa proba sa inokulumom: obični sudovi br. 3 i 4;

- kontrola postupka: običan sud broj 5.

Preporučeno i po potrebi:

- sterilna abiotička kontrola: običan sud broj 6;

- kontrola adsorpcije: običan sud broj 7;

- kontrola toksičnosti: običan sud broj 8.

Videti odeljak 1.7.7. ove metode.

4.2.6. Postupak

Ispitivanje započinje propuštanjem mehurića vazduha koji ne sadrži C.4-B kroz suspenzije brzinom od 30 ml/min do 100 ml/min. Periodično se uzimaju uzorci apsorbenta ugljen dioksida za analizu sadržaja C.4-B. Tokom prvih 10 dana preporučuje se da se analiza uradi svaki drugi ili treći dan, a zatim svaki peti dan sve do 28. dana, tako da se može identifikovati desetodnevni period.

Dvadesetosmog dana, uzimaju se uzorci (po izboru) za DOC, odnosno za specifičnu analizu, meri se pH suspenzije i dodaje 1 ml koncentrovane hlorovodične kiseline u svaki običan sud. Preko noći obični sudovi se aerišu da se izvuče ugljen-dioksid prisutan u ispitivanim suspenzijama. Dvadesetdevetog dana radi se poslednja analiza stvorenog ugljen-dioksida.

Na dane merenja C.4-B, odvaja se apsorber sa barijum hidroksidom koji je najbliži običnom sudu i hidroksidni rastvor se titrira sa 0,05 M HCl, pri čemu se fenolftalein koristi kao indikator. Preostali apsorberi se pomiču za jedno mesto bliže običnom sudu i postavlja se novi apsorber koji sadrži 100 ml svežeg 0,0125 M barijum hidroksida na najdalji kraj serije. Titracije se rade po potrebi, npr. kad se vidi velika precipitacija u prvoj klopci, a pre nego postane vidljiva u drugoj, ili najmanje jednom nedeljno. Alternativno se može, sa NaOH kao apsorbentom, pipetom izvući mali uzorak (u zavisnosti od karakteristika upotrebljenog analizatora ugljenika) rastvora natrijum hidroksida u apsorberu bližem običnom sudu. Uzorak se injektira direktno u IC deo analizatora ugljenika za analizu nastalog ugljen-dioksida.

Sadržaj druge klopke analizira se na kraju ispitivanja, radi korekcije za eventualni preneti ugljen-dioksid.

4.3. PODACI I IZVEŠTAJ

4.3.1. Obrada rezultata

Kad se istitrira, količina C.4-B uhvaćenog u apsorberu izražava se pomoću formule:

mgCO2 = (100 x CB - 0,5 x V x CA) x 44

pri čemu:

V jeste zapremina HCl upotrebljene za titraciju 100 ml u apsorberu (ml);

CB jeste koncentracija rastvora barijum hidroksida (M);

CA jeste koncentracija rastvora hlorovodične kiseline (M).

Ako CB iznosi 0,0125 M i CA iznosi 0,05 M, titracija za 100 ml barijum hidroksida jeste 50 ml, a masu C.4-B daje izraz:

U ovom slučaju, za prevođenje zapremine istitrovane HCl u mg proizvedenog C.4-B primenjuje se faktor 1,1.

Izračunaju se mase C.4-B proizvedenog iz čistog inokuluma i inokuluma sa ispitivanom hemikalijom pomoću odgovarajućih titracijskih vrednosti, a dobijena razlika je masa C.4-B proizvedenog samo iz ispitivane hemikalije.

Na primer, ako sam inokulum daje titraciju od 48 ml, a inokulum sa ispitivanom hemikalijom daje 45 ml:

C.4-Biz inokuluma = 1,1 x (50 - 48) = 2,2 mg

C.4-Biz inokuluma sa ispitivanom hemikalijom = 1,1 x (50 - 45) = 5,5 mg

Masa C.4-B proizvedenog iz ispitivane hemikalije iznosi 3,3 mg.

Procenat biorazgradnje izračunava se formulom:

ili formulom:

uz 3,67 kao faktor konverzije (44/12) za ugljenik u ugljen-dioksid.

Da bi se dobio procenat razgradnje nakon bilo kog vremenskog intervala, doda se procenat vrednosti ThC.4-B izračunate za svaki pojedini dan, do vremena na koji se radilo merenje.

Za apsorbere od natrijum hidroksida, izračuna se količina proizvedenog ugljen-dioksida, izražena kao IC (mg), množenjem koncentracije IC u apsorbentu sa zapreminom apsorbenta.

Procenat razgradnje izračunava se formulom:

Uklanjanje DOC (po izboru) se izračuna na način iz odeljka 1.8. ove metode. Rezultati se zapisuju u obrascima za unos podataka.

4.3.2. Prihvatljivost rezultata

Sadržaj IC u suspenziji ispitivane hemikalije u mineralnoj podlozi na početku ispitivanja iznosi manje od 5% TC, a ukupno razvijeni C.4-B u slepoj probi sa inokulumom na kraju ispitivanja ne sme normalno da premaši 40 mg/l podloge. Ako se dobiju vrednosti iznad 70 mg C.4-B/l, podaci i ispitivana tehnika se kritički ispituju.

Videti odeljak 1.6.2. ove metode.

4.3.3. Izveštaj

Videti odeljak 1.9. ove metode.

4.4. OBRASCI ZA UNOS PODATAKA

Primer obrasca za unos podataka:

METODA ISPITIVANJA RAZVIJANJA C.4-B

1. LABORATORIJA

2. DATUM POČETKA ISPITIVANJA

3. ISPITIVANA SUPSTANCA

Hemijski naziv:

Koncentracija osnovnog rastvora:... mg/l kao hemikalija

Početna koncentracija u podlozi:... mg/l kao hemikalija

Ukupni C dodat u običnu posudu :... mg C

ThC.4-B: … mg C.4-B

4. INOKULUM

Izvor:

Sprovedena obrada:

Prekondicioniranje, ako je sprovedeno:

Koncentracija suspendovanih materija u reakcionoj smeši:... mg/l

Napomena: Slični formati mogu se koristiti za referentne hemijske kontrole i kontrole toksičnosti.

6. ANALIZA UGLJENIKA (PO IZBORU)

Analizator ugljenika

7. ABIOTIČKA RAZGRADNJA (po izboru)

5. MANOMETRIJSKA RESPIROMETRIJA (METODA C.4-D)

5.1. PRINCIP METODE

Odmerena zapremina inokulisane mineralne podloge, koja sadrži poznatu koncentraciju ispitivane hemikalije (100 mg/l ispitivane supstance, da se dobije najmanje 50 mg ThOD/ldo 100 mg ThOD/l) kao jedini nominalni izvor organskog ugljenika, meša se u zatvorenom običnom sudu na stalnoj temperaturi (± 1° C ili manje) ne duže od 28 dana. Potrošnja kiseonika određuje se ili pomoću merenja količine kiseonika (proizvedenog elektrolizom) potrebnog da se održi konstantna zapremina gasa u običnom sudu respirometra ili iz promena u zapremini ili pritisku (ili kombinacijom ova dva načina) u opremi. Razvijeni ugljen-dioksid apsorbuje se u rastvoru kalijum hidroksida ili drugog pogodnog apsorbenta. Količina kiseonika koju potroši ispitivana hemikalija (korigovano za potrošnju inokuluma iz slepe probe, radi se uporedo) izražava se kao procenat ThOD ili HPK. Po izboru, primarna biorazgradnja može se izračunatii iz dodatne specifične analize urađene na početku i na kraju inkubacije, a krajnja biorazgradnja pomoću DOC analize.

5.2. OPIS METODE

5.2.1. Oprema

Oprema za ispitivanje sadrži:

- pogodni respirometar;

- kontrolu temperature, koja se održava unutar ± 1° C ili manje;

- sistem za membransku filtraciju (nije obavezan);

- analizator ugljenika (nije obavezan).

5.2.2. Priprema mineralne podloge

Za pripremu osnovnog rastvora, videti odeljak 1.7.2. ove metode.

Pomeša se 10 ml osnovnog rastvora 1 sa 800 ml vode za razblaživanje, doda se 1 ml osnovnog rastvora 2 do 4 i dopuni do zapremine od 1 L sa vodom za razblaživanje.

5.2.3. Priprema i prekondicioniranje inokuluma

Inokulum se može uzeti iz raznih vrsta izvora: aktiviranog mulja, efluenta otpadnih voda, površinskih voda i zemljišta ili smeše istih.

Videti odeljke 1.7.4, 1.7.4.1, 1.7.4.2. i 1.7.5. ove metode.

5.2.4. Priprema običnog suda

Rastvori ispitivanih i referentnih hemikalija pripremaju se u odvojenim serijama, u mineralnoj podlozi ekvivalentno koncentraciji obično od 100 mg hemikalije/l (dajući najmanje 50 mg ThOD/ldo 100 mg ThOD/l), pomoću osnovnih rastvora.

ThOD se izračunava na osnovu nagrađenih soli amonijaka, osim u slučaju kad se očekuje nitrifikacija. Tada se izračunavanje bazira na stvaranju nitrata (videti odeljak 2.2. ove metode).

Odrede se pH vrednosti i po potrebi svedu na vrednosti od 7,4 ± 0,2.

Slabo rastvorljive supstance se dodaju u kasnijoj fazi.

Ako se određuje toksičnost ispitivane hemikalije, priprema se još jedan rastvor u mineralnoj podlozi koja sadrži i ispitivanu i referentnu hemikaliju u istim koncentracijama kao i pojedinačni rastvori.

Ako se meri fizičko-hemijska potrošnja kiseonika, priprema se rastvor ispitivane hemikalije u koncentraciji obično od 100 mg ThOD/l koja je prethodno bila sterilisana dodatkom odgovarajuće toksične supstance (videti odeljak 1.7.6. ove metode).

Potrebna zapremina svakog od rastvora ispitivane i referentne hemikalije sipa se u najmanje dva obična suda. U ostale obične sudove dodaje se samo mineralna podloga (za kontrolu inokuluma) i po potrebi, pomešani rastvori ispitivane/referentne supstance i sterilni rastvor.

Ako je ispitivana supstanca slabo rastvorljiva, u ovoj fazi se ona dodaje direktno na osnovu mase ili zapremine, ili se obrađuje na način iz odeljka 3. ove metode. U odeljke C.4-B apsorbera dodaju se kalijum-hidroksid, zrnca natrijum i kalcijum-hidroksida (kreč) ili drugi apsorbensi.

5.2.5. Broj običnih sudova u tipičnom ispitivanju

Redni broj običnih sudova:

- ispitivana suspenzija: obični sudovi br. 1 i 2;

- slepa proba sa inokulumom: obični sudovi br. 3 i 4;

- kontrola postupka: običan sud broj 5.

Preporučeno i po potrebi:

- sterilna kontrola: običan sud broj 6;

- kontrola toksičnosti: običan sud broj 7.

Videti odeljak 1.7.7. ove metode.

5.2.6. Postupak

Nakon što se u posudama postigne željena temperatura, u odgovarajuće posude se inokuliše pripremljeni aktivni mulj ili inokulum iz drugog izvora da se dobije koncentracija suspendovanih materija ne veća od 30 mg/l. Sastavi se oprema, pokrene mešalica, proveri se izolacija vazduha i započne sa merenjem potrošnje kiseonika. Obično nije potreban dodatni oprez osim što se rade obavezna očitavanja i svakodnevno proverava da je temperatura tačna i da mešalica radi.

Potrošnja kiseonika izračunava se iz očitavanja obavljenih u redovnim i čestim intervalima, pomoću postupaka koje je dao proizvođač opreme. Na kraju inkubacije, obično od 28 dana, izmeri se pH vrednost sadržaja običnih sudova, posebno ako je potrošnja kiseonika niska ili veća od ThODNH4 (za jedinjenja koja sadrže azot).

Po potrebi se uzimaju uzorci iz respirometrijskih običnih sudova, na početku i na kraju, za analizu DOC ili specifične hemikalije (videti odeljak 2.4. ove metode). Kad se prvi put uzimaju uzorci, potrebno je znati zapreminu test suspenzije koja je preostala u običnom sudu. Kad test supstanca koja sadrži azot troši kiseonik, određuje se porast koncentracije nitrita ili nitrata u toku 28 dana i izračuna se korekcija za kiseonik potrošen u nitrifikaciji (videti Deo peti ove metode).

5.3. PODACI I IZVEŠTAJ

5.3.1. Obrada rezultata

Kiseonik (mg) koji je potrošila ispitivana hemikalija u određenom vremenskom periodu (korigovan za onaj pomoću kontrole slepe probe sa inokulumom u istom vremenskom periodu) podeli se sa masom upotrebljene ispitivane hemikalije. Time se dobije BPK izražen kao mg kiseonika po mg ispitivane hemikalije, to jest:

Procenat biorazgradnje izračunava se pomoću jednačine:

ili jednačine:

Ova dva postupka ne daju obavezno iste vrednosti. Prednost se daje prvom postupku.

Za ispitivanje supstanci koje sadrže azot, koristi se odgovarajući ThOD (NH4 ili NO3) u zavisnosti od toga šta se zna ili šta se očekuje u vezi sa pojavom nitrifikacije (videti odeljak 2.2. ove metode). Ako nastupi nitrifikacija, ali ne bude potpuna, izračuna se korekcija za kiseonik potrošen u nitrifikaciji iz promena u koncentraciji nitrita i nitrata (videti Deo peti ove metode).

Kad se rade opciona određivanja organskog ugljenika, odnosno specifične hemikalije, procenat razgradnje se izračunava na način iz odeljka 1.8. ove metode.

Rezultati se zapisuju u obrasce za unos podataka.

5.3.2. Prihvatljivost rezultata

Potrošnja kiseonika slepe probe sa inokulumom normalno iznosi 20 mg/lO2 do 30 mg/l O2 i ne sme biti veća od 60 mg/l u 28 dana. Ako su vrednosti veće od 60 mg/l, kritički proveriti podatke i ispitivane tehnike. Ako pH vrednost izlazi izvan opsega od 6 do 8,5 i potrošnja kiseonika ispitivane hemikalije je manja od 60% kiseonika, ispitivanje se ponavlja sa nižim koncentracijama ispitivane hemikalije.

Videti odeljak 1.6.2. ove metode.

5.3.3. Izveštaj

Videti odeljak 1.9. ove metode.

5.4. OBRASCI ZA UNOS PODATAKA

Primer obrasca za unos podataka:

MANOMETRIJSKA RESPIROMETRIJA

1. LABORATORIJA

2. DATUM POČETKA ISPITIVANJA

3. ISPITIVANA SUPSTANCA

Hemijski naziv:

Koncentracija osnovnog rastvora:... mg/l

Početna koncentracija u podlozi, Co :... mg/l

Zapremina u običnom sudu (V):... ml

ThOD ili HPK:... mg O2/... mg ispitivane supstance (NH4 ili NO3)

4. INOKULUM

Izvor:

Sprovedena obrada:

Prekondicioniranje, ako je obavljeno:

Koncentracija suspendovanih materija u reakcionoj smesi:... mg/l

5. POTROŠNJA KISEONIKA: BIORAZGRADLJIVOST

Napomena: Slični obrasci mogu se koristiti za referentnu hemikaliju i kontrolu toksičnosti.

6. KOREKCIJA ZBOG NITRIFIKACIJE (videti Deo peti ove metode)

7. ANALIZA UGLJENIKA (po izboru)

Analizator ugljenika:

8. SPECIFIČNA HEMIKALIJA (po izboru)

Sb = koncentracija u fizičko-hemijskoj (sterilnoj) kontroli 28. dana

Sa = koncentracija u inokulisanom običnom sudu 28. dana

Pri čemu:

Sb jeste koncentracija u fizičko-hemijskoj (sterilnoj) kontroli 28. dana;

Sa jeste koncentracija u inokulisanom običnom sudu 28. dana

9. ABIOTIČKA RAZGRADNJA (po izboru)

(videti odeljak 1. i 3. ove metode)

Pri čemu a jeste potrošnja kiseonika u sterilnom običnom sudu nakon 28 dana, (mg).

6. METODA ISPITIVANJA U ZATVORENOJ BOCI (METODA C.4-E)

6.1. PRINCIP METODE

Rastvor ispitivane hemikalije u mineralnoj podlozi, obično 2 mg/l do 5 mg/l, inokuliše se sa relativno malim brojem mikroorganizama iz mešane populacije i čuva u potpuno punim, zatvorenim bocama u mraku na stalnoj temperaturi. Nakon razgradnje sledi analiza rastvorenog kiseonika u toku 28 dana. Količina kiseonika koju veže ispitivana hemikalija, korigiovana za kiseonik koji je potrošila uporedna slepa proba sa inokulumom, izražava se kao procenat ThOD ili HPK.

6.2. OPIS METODE

6.2.1. Oprema

Oprema za ispitivanje sadrži:

- BPK boce sa staklenim zatvaračima, npr. 250 ml do 300 ml;

- vodeno kupatilo ili inkubator, za čuvanje boca na stalnoj temperaturi (± 1° C ili manje) bez svetla;

- velike staklene boce (od 2 L do 5 L) za pripremu podloge i za punjenje BPK boca;

- kiseoničnu elektrodu i merni instrument ili opremu i reagense za Vinklerovu titraciju (Winkler titration).

6.2.2. Priprema mineralne podloge

Za pripremu osnovnog rastvora, videti odeljak 1.7.2. ove metode.

Pomeša se 1 (jedan) ml osnovnog rastvora 1 do 4 i dopuni do zapremine od 1 L sa vodom za razblaživanje.

6.2.3. Priprema inokuluma

Inokulum se normalno dobija iz sekundarnih otpadnih voda postrojenja za prečišćavanje ili uređaja laboratorijskog tipa koji prima uglavnom otpadnu vodu iz domaćinstava. Alternativni izvor inokuluma su površinske vode. Obično se koristi jedna kapljica (od 0,05 ml do 5,0 ml filtrata po litru podloge). Da bi se pronašla optimalna zapremina za određenu otpadnu vodu, ponekad će biti potrebno više pokušaja (videti odeljke 1.7.4.2. i 1.7.5. ove metode).

6.2.4. Priprema običnih sudova

Mineralna podloga se temeljno aeriše u toku najmanje 20 minuta. Svaka ispitivana serija postavlja se sa mineralnom podlogom dobijenom iz iste serije. Podloga je spremna za upotrebu nakon što odstoji 20 sati, na ispitivanoj temperaturi. Odredi se koncentracija rastvorenog kiseonika zbog kontrole. Vrednost koncentracije iznosi oko 9 mg/l na 20° C. Prilikom prenosa i punjenja podloge zasićene vazduhom ne smeju se stvoriti mehurići, što se postiže pomoću sifona.

Pripreme se paralelno grupe BPK boca za određivanje ispitivane i referentne hemikalije u uporednim serijama. Prikupi se dovoljan broj BPK boca, uključujući slepe probe sa inokulumom, da se potrošnja kiseonika može meriti najmanje u duplikatu u željenim intervalima, npr. nakon 0, 7, 14, 21 i 28 dana. Da bi se identifikovao desetodnevni period, može biti potrebno više boca.

Velike boce se pune potpuno aerisanom mineralnom podlogom do jedne trećine zapremine. Zatim se sipa dovoljno osnovnog rastvora ispitivane hemikalije i referentne hemikalije u odvojene velike boce, tako da konačna koncentracija hemikalije ne bude veća od 10 mg/l. U podlogu sa slepom probom kao kontrolnom u narednoj velikoj boci ne dodaju se nikakve hemikalije.

Da bi se osiguralo da aktivnost inokuluma ne bude ograničena, koncentracija rastvorenog kiseonika ne sme pasti ispod 0,5 mg/l u BPK bocama. Ovo ograničava koncentraciju ispitivane hemikalije na oko 2 mg/l. Za slabo razgradljiva jedinjenja i ona sa niskim ThOD, može se upotrebiti 5 mg/l do 10 mg/l. U nekim slučajevima, preporučljivo je postaviti uporedne serije ispitivane hemikalije u dve različite koncentracije, npr. od 2 mg/l do 5 mg/l. ThOD se računa na osnovu nagrađenih amonijevih soli, ali ako se očekuje ili se zna da postoji nitrifikacija, izračunava se na osnovu stvorenih nitrata (ThODNO3: videti odeljak 2.2. ove metode). Ako nitrifikacija nije potpuna, iako postoji, radi se korekcija za promene u koncentraciji nitrita i nitrata, određena analizom (videti Deo peti ove metode).

Ako se određuje toksičnost ispitivane hemikalije (u slučaju, npr. da je prethodno utvrđena niska vrednost biorazgradljivosti), potreban je još jedan niz boca.

Pripremi se još jedna velika boca i napuni aerisanom mineralnom podlogom (do otprilike jedne trećine zapremine boce) pa se u bocu dodaju ispitivana i referentna hemikalija u konačnim koncentracijama koje su iste kao i koncentracije u drugim velikim bocama.

Ovi rastvori se inokulišu u velike boce koje sadrže sekundarni efluent (jedna kapljica ili 0,05 ml/l do 5,0 ml/l) ili drugi izvor, kao što je rečna voda (videti odeljak 1.7.4.2. ove metode). Na kraju se pripremaju rastvori sa aerisanom mineralnom podlogom pomoću gumene cevi koja doseže do dna boce, da bi se postiglo odgovarajuće mešanje podloge i rastvora.

6.2.5. Broj običnih sudova u tipičnom ispitivanju

U tipičnom ispitivanju koristi se:

- najmanje 10 boca koje sadrže ispitivanu hemikaliju i inokulum (ispitivana suspenzija);

- najmanje 10 boca koje sadrže samo inokulum (slepa proba sa inokulumom);

- najmanje 10 boca koje sadrže referentnu hemikaliju i inokulum (kontrola postupka);

- i, po potrebi, 6 boca koje sadrže ispitivanu hemikaliju, referentnu hemikaliju i inokulum (kontrola toksičnosti). Da bi se desetodnevni period mogao sa sigurnošću identifikovati, potrebno je najmanje dvostruko više boca.

6.2.6. Postupak

Pojedinačni pripremljeni rastvori iz donje četvrtine (ne sa dna) odgovarajuće velike boce odmah se raspodele pomoću cevi u odgovarajući niz BPK boca, tako da sve BPK boce budu potpuno pune. Nežnim kuckanjem po zidu boce uklone se mogući mehurići vazduha. Odmah se u nultom vremenu radi analiza rastvorenog kiseonika u BPK bocama pomoću Vinklerove metode ili elektroda. Sadržaj boca može se sačuvati za kasniju analizu Vinklerovom metodom dodavanjem mangan(II)-sulfata i natrijum-hidroksida (prvi Vinklerov reagens). Boce se čuvaju dobro zatvorene, jer je prisutan kiseonik fiksiran u obliku smeđeg mangan(III)-hidroksida, u mraku na temperaturi od 10° C do 20° C ne duže od 24 sata pre nastavka sa preostalim koracima Vinklerove metode. Zatvaračem se zatvore preostali duplikati boca (pazi se da u bocama ne ostanu mehurići vazduha) i inkubiraju se na 20° C u mraku. Uz svaku seriju postoji potpuno uporedna serija za određivanje podloge inokulirane slepom probom. Za potrebe analize uzimaju se najmanje po dve boce iz iste serije zbog analize rastvorenog kiseonika u određenim vremenskim intervalima (najmanje jedanput nedeljno) u toku 28 dana inkubacije.

Nedeljni uzorci treba da omoguće predviđanje procenta uklanjanja u razdoblju od 14 dana. Uzimanje uzoraka svaka 3 do 4 dana treba da omogući identifikaciju razdoblja od 10 dana, za što je potrebno dvostruko više boca.

Za ispitivane supstance koje sadrže azot, prave se korekcije za potrošnju kiseonika zbog moguće nitrifikacije. Prvo se koristi metoda O2-elektrode da bi se odredila koncentracija rastvorenog kiseonika, a zatim se izvlači uzorak iz BPK boce za analizu na nitrate i nitrite. Iz povećanja u koncentraciji nitrata i nitrita, izračuna se potrošeni kiseonik (videti Deo peti ove metode).

6.3. PODACI I IZVEŠTAJ

6.3.1. Obrada rezultata

Prvo se izračuna BPK nakon svakog vremenskog intervala tako što se oduzme vrednost pada kiseonika (mg O2/l) iz slepe probe sa inokulumom od one koju je pokazala ispitivana hemikalija. Korigovani pad kiseonika podeli se sa koncentracijom (mg/l) ispitivane hemikalije, da se dobije specifični BPK kao mg kiseonika po mg ispitivane hemikalije. Izračuna se procenat biološke razgradljivosti deljenjem specifičnog BPK sa specifičnim ThOD (izračunati u skladu sa odeljkom 2.2. ove metode) ili HPK (određeno analizom, videti odeljak 2.3. ove metode), pa je:

ili:

Ova dva postupka ne daju obavezno iste vrednosti. Prednost se daje prvom postupku.

Za ispitivane supstance koje sadrže azot, koristi se odgovarajući ThOD (NH4 ili NO3) prema onome što se zna ili očekuje u pogledu pojave nitrifikacije (videti odeljak 2.2. ove metode). Ako je nitrifikacija prisutna, ali nije potpuna, izračuna se korekcija za kiseonik potrošen nitrifikacijom iz promena u koncentraciji nitrita i nitrata (videti Deo peti ove metode).

6.3.2. Prihvatljivost rezultata

Pad kiseonika u slepoj probi sa inokulumom ne sme da bude viši od 1,5 mg rastvorenog kiseonika po litru nakon 28 dana. Vrednosti veće od ove zahtevaju proveru eksperimentalnih tehnika. Rezidualna koncentracija kiseonika u ispitivanim bocama ne sme da se spusti na vrednosti niže od 0,5 mg/l ni u jednom trenutku. Tako niski nivoi kiseonika prihvatljivi su samo ako se postupkom koji se koristi za određivanje rastvorenog kiseonika mogu tačno meriti takve koncentracije.

Videti odeljak 1.6.2. ove metode.

6.3.3. Izveštaj

Videti odeljak 1.9. ove metode.

6.4. OBRAZAC ZA UNOS PODATAKA

Primer obrasca za unos podataka:

METODA ISPITIVANJA U ZATVORENOJ BOCI

1. LABORATORIJA

2. DATUM POČETKA ISPITIVANJA

3. ISPITIVANA SUPSTANCA

Hemijski naziv:

Koncentracija osnovnog rastvora:... mg/l

Početna koncentracija u boci:... mg/l

ThOD ili HPK:... mg O2 /... mg ispitivane supstance

4. INOKULUM

Izvor:

Obavljena obrada:

Prekondicioniranje, ako ga je bilo:

Koncentracija u reakcionoj smesi:... mg/l

5. ODREĐIVANJE DO

Postupak: Vinkler/elektroda

Analize običnih sudova

Napomena: Sličan obrazac može se koristiti za referentno jedinjenje i kontrolu toksičnosti.

6. KOREKCIJA ZBOG NITRIFIKACIJE (videti Deo peti ove metode)

7. PAD KONCENTRACIJE RASTVORENOG KISEONIKA (DO): PROCENAT RAZGRADNJE

Pri čemu:

mt0 jeste vrednost u običnom sudu u vremenu 0;

mtx jeste vrednost u običnom sudu u vremenu x;

mb0 jeste srednja vrednost slepe probe u vremenu 0;

mbx jeste srednja vrednost slepe probe u vremenu x.

Primenjuje se korekcija zbog nitrifikacije u tački 6 (III + VI).

8. PAD KONCENTRACIJE RASTVORENOG KISEONIKA (DO) SLEPE PROBE

Potrošnja kiseonika slepe probe: (mbo - mb28) mg/l. Ova potrošnja je važna za prihvatljivost ispitivanja i niža je od 1,5 mg/l.

7. MITI ISPITIVANJE (METODA C.4-F)

7.1. PRINCIP METODE

Kiseonik koji potroše mešani rastvor ili suspenzija, ispitivana hemikalija u mineralnoj podlozi, inokulisana sa specijalno uzgojenim, neprilagođenim mikroorganizmima, meri se automatski u toku 28 dana u zamračenom zatvorenom respirometru na temperaturi od 25° C ± 1° C. Ugljen-dioksid koji se razvije apsorbuje kreč. Biorazgradljivost se izražava kao procenat potrošnje kiseonika (korigovan za potrošnju kiseonika slepe probe) teoretske potrošnje (u daljem tekstu: ThOD). Procenat primarne biološke razgradljivosti izračunava seiz dodatne specifične hemijske analize urađene na početku i kraju inkubacije i opciono, DOC analizom.

7.2. OPIS METODE

7.2.1. Oprema

Oprema za ispitivanje sadrži:

- automatski elektrolitski BPK merač ili respirometar obično opremljen sa 6 boca, svaka zapremine od 300 ml i sa posudicama koje sadrže apsorbent za ugljen-dioksid;

- stalnu sobnu temperaturu, odnosno vodeno kupatilo temperature 25° C ± 1° C ili manje;

- sistem za membransku filtraciju (nije obavezan);

- uređaj za analizu ugljenika (nije obavezan).

7.2.2. Priprema mineralne podloge

Pripreme se sledeći osnovni rastvori, pomoću analitičkih reagenasa i vode (videti odeljak 1.7.1. ove metode):

1. rastvoriti u vodi i dopuniti do 1 L (pH rastvora je potrebno da bude 7,2):

- 8,50 g KH2PO4 (kalijum-dihidrogenfosfat);

- 21,75 gK2HPO4 (dikalijum-hidrogenfosfat);

- 44,60 g Na2HPO4´12H2O (dinatrijum-hidrogenfosfat dodekahidrat);

- 1,70 g NH4Cl (amonijum-hlorid);

2. rastvoriti u vodi i dopuniti do 1 L:

- 22,50 g MgSO4´7H2O (magnezijum-sulfat heptahidrat);

3. rastvoriti u vodi i dopuniti do 1 L:

- 27,50 g CaCl2 (kalcijum-hlorid, bezvodni);

4. rastvoriti u vodi i dopuniti do 1 L:

- 0,25 g FeCl3´6H2O (gvožđe(III)-hlorid heksahidrat).

Uzme se 3 ml osnovnog rastvora 1, 2, 3. i 4. i dopuni do 1 L.

7.2.3. Priprema inokuluma

Uzmu se sveži uzorci iz najmanje 10 različitih mesta, uglavnom u područjima u kojima se koriste i u koja se ispuštaju razne hemikalije. Sa lokacija, kao što su postrojenja za prečišćavanje otpadne vode iz domaćinstava, za obradu industrijske otpadnih voda, reka, jezera, mora, prikupi se 11 uzoraka mulja, površinskog zemljišta, vode, itd. i sve zajedno temeljno se promeša. Nakon uklanjanja plutajućih materija i nakon sleganja, supernatant se svede na pH (7 ± 1) pomoću natrijum hidroksida i fosforne kiseline.

Koristi se odgovarajuća zapremina filtriranog supernatanta da se napuni posuda za punjenje i izvlačenje aktivnog mulja, a tečnost se aeriše u toku otprilike 23 1/2 sata. Trideset minuta nakon aeracije, baci se oko jedne trećine ukupne zapremine supernatanta i istaloženom materijalu doda jednaka zapremina rastvora (pH 7) koji sadrži 0,1% glukoze, peptona i kalijum ortofosfata i ponovo aeriše. Ovaj postupak se ponavlja jedanput dnevno. Jedinicom za mulj upravlja se u skladu sa dobrom praksom: otpadna voda je bistra, temperatura se održava na 25° C ± 2° C, pH je 7 ± 1, mulj se dobro taloži, aeracija je dovoljno dobra tako da smeša bude stalno u aerobnim uslovima, prisutne su protozoe, a aktivnost mulja se ispituje pomoću referentnih supstanci najmanje jednom u tri meseca. Mulj se obrađuje na ovakav način najmanje mesec dana pre nego što se može iskoristiti kao inokulum, ali ne duže od četiri meseca. Nakon toga, uzima se uzorak iz najmanje 10 mesta u redovnim razmacima, jednom svaka tri meseca.

Da bi se održala ista aktivnost svežeg i starog mulja, filtrirani supernatant aktivnog mulja koji se koristi pomeša se sa jednakom zapreminom filtriranog supernatanta sveže smeše prikupljene sa 10 različitih izvora i tako kombinovana tečnost održava se u kulturi, kako je opisano. Mulj se koristi kao inokulum 18 do 24 sata nakon što je jedinica napunjena.

7.2.4. Priprema običnih sudova

Pripremi se 6 običnih sudova:

- 100 mg/l ispitivane hemikalija u vodi za razblaživanje: običan sud br. 1;

- 100 mg/l ispitivana hemikalija u mineralnoj podlozi: običan sud br. 2, 3 i 4;

- 100 mg/l referentne hemikalije (npr. anilin) u mineralnoj podlozi: običan sud br. 5;

- samo mineralna podloga: običan sud br. 6.

Slabo rastvorljiva ispitivana hemikalija dodaje se direktno na bazi mase ili zapremine ili na način kako je opisano u Delu trećem ove metode, osim što se ne koriste ni rastvarači ni emulgatori. U sve obične sudove doda se apsorbens C.4-B u ponuđenim specijalnim posudicama. U običnim sudovima br. 2, 3 i 4 pH vrednost se svede na 7,0.

7.2.5. Izvođenje

Malom zapreminom inokuluma inokuliraju se obični sudovi br. 2, 3 i 4 (ispitivana suspenzija), broj 5 (kontrola aktivnosti) i broj 6 (slepa proba sa inokulumom) da se dobije koncentracija od 30 mg/l suspendovanih materija. Inokulum se ne dodaje u tikvicu broj 1, koja služi kao abiotička kontrola. Poveže se oprema i proveri da nema dotoka vazduha, pokrenu se mešalice i započne sa merenjem potrošnje kiseonika u mraku. Svakodnevno se proverava temperatura, rad mešalice i kulometrijski uređaj za zapisivanje potrošnje kiseonika i zapisuje se svaka promena u boji sadržaja običnih sudova. Potrošnja kiseonika u šest običnih sudova očitava se direktno odgovarajućim postupkom, npr. iz zapisa šesto-kanalnog čitača koji proizvodi BPK krivu. Na kraju inkubacije, obično nakon 28 dana, meri se pH sadržaja običnih sudova i određuje koncentracija rezidualne ispitivane hemikalije i svake koncentracije koja nastane u međuvremenu, a u slučaju supstanci rastvorljivih u vodi, i koncentracija DOC (videti odeljak 2.4. ove metode). Posebnu pažnju posvetiti nepostojanim hemijskim supstancama. Ako se očekuje nitrifikacija i ako je moguće određuje se koncentracija nitrata i nitrita.

7.3. PODACI I IZVEŠTAJ

7.3.1. Obrada rezultata

Potrošnja kiseonika (mg) ispitivane hemikalije u toku određenog vremena, korigovana za vrednost potrošnje kiseonika u kontrolnoj slepoj probi sa inokulumom za to isto vreme, podeli se sa masom upotrebljene ispitivane hemikalije. Ovo daje BPK izražen kao mg kiseonika/mg ispitivane hemikalije, odnosno:

Procenat biorazgradnje se zatim izračunava prema formuli:

Za smeše, izračuna se ThOD iz elementarne analize, kao za jednostavna jedinjenja. Koristi se odgovarajuća ThOD (ThODNH4 ili ThODNO3) u zavisnosti od toga da li nitrifikacija ne postoji ili je nepotpuna (videti odeljak 2.2. ove metode). Ako nitrifikacija postoji, čak i samo delimična, radi se korekcija za kiseonik potrošen nitrifikacijom koji se izračuna iz promena u koncentracijama nitrita i nitrata (videti Deo peti ove metode).

Procenat primarne biorazgradnje izračunava se na osnovu gubitka početne hemikalije (videti odeljak 1.8.2. ove metode):

Ako se prilikom merenja fizičko-hemijskog uklanjanja izgubio deo ispitivane hemikalije u običnom sudu broj 1, to se navodi, a za izračunavanje procenta biorazgradnje koristi se koncentracija ispitivane hemikalije (Sb) u ovom običnom sudu nakon 28 dana.

Kad se odredi DOC (opciono), procenat potpune biorazgradnje računa se prema formuli:

Kao što je opisano u odeljku 1.8.1. ove metode ako postoji gubitak DOC u običnom sudu 1, merenjem fizičko-hemijskog uklanjanja, za izračunavanje procenta biorazgradnje koristi se koncentracija DOC u ovom običnom sudu.

Rezultati se upisuju u obrasce za unos podataka.

7.3.2. Prihvatljivost rezultata

Potrošnja kiseonika u slepoj probi sa inokulumom obično je 20 mg/lO2 do 30 mg/l O2 i ne sme da bude veća od 60 mg/lO2 u 28 dana. Vrednosti veće od 60 mg/lO2 zahtevaju kritičko preispitivanje podataka i procedura ispitivanja. Ako pH vrednost izlazi izvan opsega od 6 do 8,5 i potrošnja kiseonika ispitivane hemikalije je manja od 60%, ispitivanje se ponavlja uz niže koncentracije ispitivane hemikalije.

Videti odeljak 1.7.2. ove metode.

Ako procenat razgradnje aninila dobijen iz potrošnje kiseonika ne prelazi 40% nakon 7 dana i 65% nakon 14 dana, rezultati ispitivanja nisu prihvatljivi.

7.3.3. Izveštaj

Videti odeljak 1.9. ove metode.

7.4. OBRAZAC ZA UNOS PODATAKA

Primer obrasca za unos podataka:

METODA ISPITIVANJA: MITI (I)

1. LABORATORIJA

2. DATUM POČETKA ISPITIVANJA

3. ISPITIVANA SUPSTANCA

Hemijski naziv:

Koncentracija osnovnog rastvora: … mg/l kao hemikalija

Početna koncentracija u podlozi, C0:... mg/l kao hemikalija

Zapremina reakcione smeše, V:... ml

ThOD:... mg/l O2

4. INOKULUM

Mesta uzimanja uzoraka mulja:

1)..., 6)...,

2)..., 7)...,

3)..., 8)...,

4)..., 9)...,

5)..., 10)...,

Koncentracija suspendovanih materija u aktivnom mulju nakon aklimatizacije sa sintetičkom otpadnom vodom =... mg/l

Zapremina aktivnog mulja po litru gotove podloge =... ml

Koncentracija mulja u gotovoj podlozi =... mg/l

5. POTROŠNJA KISEONIKA: BIORAZGRADLJIVOST

Vrsta upotrebljenog respirometra:

Napomena: Slični obrasci mogu se koristiti za referentnu supstancu.

6. ANALIZA UGLJENIKA (nije obavezno)

Analizator ugljenika

7. PODACI SPECIFIČNE HEMIJSKE ANALIZE

Izračunava se procenat razgradnje za obične sudove a1, a2 i a3.

8. NAPOMENE

Ako je moguće priložiti BPK krivu u funkciji vremena.

Deo drugi

IZRAČUNAVANJE I ODREĐIVANJE ODGOVARAJUĆIH UKUPNIH PARAMETARA

U zavisnosti od izabrane metode ispitivanja, zahtevaju se određeni zbirni parametri. Ovaj deo opisuje postupak dobijanja njihovih vrednosti. Upotreba ovih parametara data je u pojedinim metodama ispitivanja.

1. SADRŽAJ UGLJENIKA

Sadržaj ugljenika izračunava se iz poznatog sastava elemenata ili elemenata određenih analizom ispitivane supstance.

2. TEORIJSKA POTROŠNJA KISEONIKA (ThOD)

Teorijska potrošnja kiseonika (u daljem tekstu: ThOD) može se izračunati ako je sastav elemenata poznat ili određen analizom elemenata. To je za jedinjenje:

CcHhClclNnNanaOoPpSs

bez nitrifikacije,

ili sa nitrifikacijom

3. HEMIJSKA POTROŠNJA KISEONIKA (HPK)

Hemijska potrošnja kiseonika (u daljem tekstu: HPK) određuje se prema Metodi C.6. koja je data u ovom prilogu.

4. RASTVORENI ORGANSKI UGLJENIK (DOC)

Rastvoreni organski ugljenik (u daljem tekstu: DOC) jeste organski ugljenik bilo koje hemikalije ili smeše u vodi koji prolazi kroz filter promera 0,45 µ.

Izvuku se uzorci iz posuda za ispitivanje i odmah filtriraju u filtracijskom uređaju koji koristi odgovarajući membranski filter. Prvih 20 ml (količina se može smanjiti kad se koriste mali filteri) filtrata se bacaju. Zapremine od 10 ml do 20 ml ili manje, ako se injektiraju (zapremina zavisi od količine koja je potrebna za analizator ugljenika) zadržavaju se zbog analize ugljenika. Koncentracija DOC određuje se pomoću analizatora organskog ugljenika koji može tačno da izmeri koncentraciju ugljenika koja je jednaka ili niža od 10% početne koncentracije DOC korišćene u ispitivanju.

Filtrirani uzorci koji se ne mogu analizirati istog dana mogu da se sačuvaju u frižideru na temperaturi od 2° C do 4° C u toku 48 sata ili na temperaturi ispod - 18° C u toku dužeg perioda.

Napomene:

Membranski filteri su često impregnirani površinski aktivnim materijama za hidrofilizaciju. Zato filter može sadržati do nekoliko mg rastvorenog organskog ugljenika koji utiče na određivanje biorazgradljivosti. Površinski aktivne materije i druga rastvorljiva organska jedinjenja uklanjaju se iz filtera kuvanjem filtera u dejonizovanoj vodi tri puta po sat vremena. Filteri se mogu čuvati u vodi nedelju dana. Ako se koriste jednokratna punjenja filtera, svako punjenje se proverava da bi se potvrdilo da ne otpušta rastvorljivi organski ugljenik.

Membranski filter, zavisno od tipa, može usled adsorpcije zadržati test supstancu. Poželjno je proveriti da li filter zadržava ispitivanu hemikaliju.

Centrifugiranje na 40.000 m/s2 (4.000 g) u toku 15 minuta može se koristiti umesto filtracije za razlikovanje TOC od DOC. Postupak nije pouzdan pri početnim koncentracijama manjim od 10 mg DOC/l, s obzirom na to dali su ili nisu uklonjene sve bakterije ili se ugljenik kao deo bakterijske plazme ponovno rastvorio.

LITERATURA

1. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. COntrol Fed., Oxygen Demand, 1965, P 65.

2. Wagner, R., Von Wasser, 1976, vol. 46, 139.

3. DIN-Entwurf 38 409 Teil 41 Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und Stoffkenngrößen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuß Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e. V.

4. Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble COmpounds. Chemosphere, 1984, vol 13 (1), 169.

Deo treći

PROCENA BIOLOŠKE RAZGRADLJIVOSTI SLABO RASTVORLJIVIH SUPSTANCI

U ispitivanju biorazgradnje slabo rastvorljivih supstanci, posebnu pažnju posvetiti sledećim aspektima:

Dok su homogene tečnosti retko problem za uzimanje uzoraka, preporučuje se da čvrste supstance budu homogenizovane odgovarajućim sredstvima kako bi se izbegle greške usled nehomogenosti. Posebno se pazi kad su potrebni reprezentativni uzorci od nekoliko miligrama iz smeše hemikalija ili supstanci sa velikom količinom nečistoća.

Tokom ispitivanja mogu se koristiti različiti oblici mešanja. Hemikalija se meša tek toliko da ostane dispergovana. Pregrejavanje, prekomerno stvaranje pene i preterane vučne sile izbegavaju se.

Može se koristiti emulgator koji omogućava stabilnu disperziju hemikalije. Emulgator ne sme da bude toksičan za bakterije i ne sme da bude biorazgradljiv ili da uzrokuje stvaranje pene u ispitivanim uslovima.

Na rastvarače se primenjuju isti kriterijumi kao i na emulgatore.

Ne preporučuje se korišćenje čvrstih nosača za ispitivane čvrste supstance, ali oni mogu biti pogodni samo za supstance.

Kad se koriste pomoćne supstance kao što su emulgatori, rastvarači i nosači, ispituje se posuda sa slepom probom koja sadrži te pomoćne supstance.

Za ispitivanje biorazgradljivosti slabo rastvorljivih jedinjenja može se koristiti bilo koji od tri respirometrijska ispitivanja: C.4-B, BPK, MITI.

LITERATURA

1. de Morsier, A. et al., Biodegradation tests for poorly soluble COmpounds. Chemosphere, 1987, vol. 16, 833.

2. Gerike, P, The Biodegradability testing of poorly water soluble COmpounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.

Deo četvrti

PROCENA BIORAZGRADLJIVOSTI HEMIKALIJA ZA KOJE SE SUMNJA DA SU TOKSIČNE ZA INOKULUM

Kad se ispitivana hemikalija podvrgne ispitivanju biorazgradljivosti i pokaže se da nije brzo biorazgradljiva, preporučuje se sledeći postupak za utvrđivanje razlika između inibicije i inercije1:

Za ispitivanja toksičnosti i biorazgradnje, koristiti slične ili identične inokulume.

Da bi se ispitivanjem brze biorazgradljivosti procenila toksičnost hemikalije, primenjuje se jedan ili kombinacija postupaka za utvrđivanje inhibicije stepena respiracije mulja (ispitivanje inhibicije respiracije aktivnog mulja, videti u literaturi2), BPK, odnosno postupaka za utvrđivanje inhibicije rasta.

Ako je potrebno izbeći inhibiciju izazvanu toksičnošću, preporučuje se da koncentracije ispitivane supstance koja se koristi u ispitivanju brze biološke razgradljivosti budu manje od 1/10 EC50 vrednosti (ili manje od EC20 vrednosti) koja se dobije ispitivanjem toksičnosti. Jedinjenja sa EC50 vrednošću većom od 300 mg/l najverovatnije nemaju toksične efekte u ispitivanju brze biorazgradljivosti.

EC50 vrednosti manje od 20 mg/l verovatno predstavljaju ozbiljne probleme za dalje testove. Koriste se niske ispitivane koncentracije, zbog čega se koristi stroga i osetljiva metoda ispitivanja u zatvorenoj boci ili materijal označen izotopom ugljenika C14. Alternativno, ako se radi sa aklimatizovanim inokulumom, koriste se više koncentracije ispitivane supstance. U tom slučaju, gubi se specifični kriterijum metode ispitivanja brze biološke razgradljivosti.

LITERATURA

1. Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, vol. 16, 2259.

2. Directive 87/302/EEC.

Deo peti

KOREKCIJA POTROŠNJE KISEONIKA ZBOG UTICAJA NITRIFIKACIJE

Greške zbog propusta da se uračuna nitrifikacija u procenu biorazgradljivosti ispitivane supstance koja ne sadrži N na osnovu potrošnje kiseonika su marginalne (ne veće od 5%), čak i ako je pojava oksidacije amonijačnog azota u podlozi vrlo nepravilna, kao između posuda za ispitivanje i posuda sa slepom probom. Kad ispitivane supstance sadrže N, mogu se javiti ozbiljne greške.

Ako je došlo do nitrifikacije, ali ona nije potpuna, opažena potrošnja kiseonika reakcione smeše može se korigovati za količinu kiseonika potrošenog u oksidaciji amonijaka na nitrite i nitrate, ako se promene u koncentraciji u toku inkubacije nitrita i nitrata određuju pomoću jednačina:

2NH4Cl+3O2=2HNO2+2HCl+2H2O [1]

2HNO2+O2=2HNO3 [2]

Ukupno:

2NH4Cl+4O2=2HNO2+2HCl+2H2O [3]

Iz jednačine [1] vidi se da 28 g azota iz amonijum hlorida (NH4Cl) potroši 96 g kiseonika u toku oksidacije do nitrita, odnosno faktor je 3,43 (96/28). Na isti način, iz jednačine [3] vidi se da 28 g azota potroši 128 g kiseonika u toku oksidacije do nitrata, odnosno faktor je 4,57 (128/28).

S obzirom da su reakcije sekvencijalne, a za njih su zaslužne različite bakterijske vrste, koncentracija nitrita se može povećati ili smanjiti. Dakle:

O2 potrošen u stvaranju nitrata = 4,57 x povećanje koncentracije nitrata [4]

i

O2 potrošen u stvaranju nitrata = 3,43 x povećanje koncentracije nitrata [5]

i

gubitak O2 zbog gubljenja nitrata = -3,43 x smanjenje koncentracije nitrata [6]

tako da je:

O2 potrošnja zbog nitrifikacije = ±3,43 x promena konc. nitrita + 4,57 x povećanje koncentracije nitrita [7]

i stoga je:

O2 potrošnja zbog C oksidacije = ukupna opažena potrošnja zbog nitrifikacije. [8]

Alternativno, ako se određuje samo ukupni oksidovani N, može se prihvatiti da je potrošnja kiseonika zbog nitrifikacije, kao prva aproksimacija, 4,57 puta povećanje u oksidovanom N.

Korigovana vrednost za potrošnju kiseonika zbog C oksidacije se onda poredi sa ThODNH3, kao što je izračunato u Delu drugom ove metode.

C.5. RAZGRADNJA - BIOHEMIJSKA POTROŠNJA KISEONIKA

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Cilj ove metode je merenje biohemijske potrošnje kiseonika (u daljem tekstu: BPK) za čvrste i tečne organske supstance.

Podaci dobijeni u ovom ispitivanju odnose se na jedinjenja rastvorljiva u vodi. Mogu se ispitivati i jedinjenja koja su isparljiva, kao i jedinjenja koja su slabo rastvorljiva u vodi.

Metoda se može primeniti samo za one organske supstance koje ne deluju inhibitorno na bakterije u koncentracijama koje se koriste u ispitivanju. Ako ispitivana supstanca nije rastvorljiva u izabranim koncentracijama, dodatne mere (kao što je ultrazvučna disperzija) mogu se koristiti kako bi se postigla dobra disperzija ispitivane supstance.

Podaci o toksičnosti ispitivane supstance mogu da budu korisni pri tumačenju rezultata ispitivanja gde su dobijene male vrednosti za BPK, a pomažu i u izboru odgovarajućih koncentracija za ispitivanje date supstance.

1.2. DEFINICIJE I MERNE JEDINICE

Biohemijska potrošnja kiseonika (BPK) jeste masa rastvorenog kiseonika potrebna za proces biohemijske oksidacije u specifičnoj zapremini rastvora ispitivane supstance pod uslovima definisanim za ovo ispitivanje.

Rezultati se izražavaju u gramima kao g BPK/g ispitivane supstance.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Poželjno je koristiti adekvatne referentne supstance da bi se proverila aktivnost inokuluma.

1.4. PRINCIP METODE

Unapred određena količina ispitivane supstance, koja je rastvorena ili dispergovana u dobro aerisanom medijumu, inokulira se sa mikroorganizmima i inkubira na tačno određenoj konstantnoj temperaturi u odsustvu svetlosti.

BPK se određuje kao razlika sadržaja rastvorenog kiseonika na početku i na kraju ispitivanja. Ispitivanje traje najmanje pet dana, ali ne duže od 28 dana.

Kao slepu probu koristiti rezultate naporednog ispitivanja bez prisustva ispitivane supstance.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Određivanje BPK ne može da se smatra validnom merom biorazgradljivosti ispitivane supstance. Ovo ispitivanje se može posmatrati samo kao skrining test.

1.6. OPIS METODE

Preliminarni rastvor ili disperzija pripremaju se tako da se postigne odgovarajuća koncentracija BPK kompatibilna sa metodom koja se koristi. BPK se zatim određuje primenom bilo koje odgovarajuće standardizovane metode.

2. PODACI I PROCENA

BPK za preliminarni rastvor ispitivane supstance izračunava se prema izabranoj standardizovanoj metodi i izražava se u gramima BPK po gramu ispitivane supstance.

3. IZVEŠTAJ

U izveštaju o ispitivanju navodi se koja metoda je korišćena u ispitivanju.

Vrednost BPK predstavlja srednju vrednost za najmanje tri validna merenja.

Navode se i svi podaci i napomene relevantne za tumačenje rezultata, a posebno podaci koji su u vezi sa nečistoćama, fizičkim karakteristikama, toksičnim efektom i sastavom ispitivane supstance.

U izveštaju se navodi i upotreba aditiva koji se koriste radi sprečavanja biološke nitrifikacije.

4. LITERATURA

Lista standardizovanih metoda:

1. NF T 90-103: Determination of the biochemical oxygen demand.

2. NBN 407: Biochemical oxygen demand.

3. NEN 32355.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik (BZV).

4. The determination of biochemical oxygen demand, Methods for the examination of water and associated materials, HMSO, London.

5. ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days.

C.6. RAZGRADNJA - HEMIJSKA POTROŠNJA KISEONIKA

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Cilj ove metode je merenje hemijske potrošnje kiseonika (u daljem tekstu: HPK) za čvrste i tečne organske supstance, u tačno definisanim laboratorijskim uslovima.

Poznavanje hemijske formule supstance korisno je za izvođenje metode ispitivanja kao i za tumačenje dobijenih rezultata (npr. soli halogenih elemenata, organske soli gvožđa, organohlorna jedinjenja).

1.2. DEFINICIJE I MERNE JEDINICE

Hemijska potrošnja kiseonika (HPK) jeste mera sposobnosti neke supstance da bude oksidovana, a izražava se kao ekvivalentna količina kiseonika oksidujućeg sredstva koja je potrebna za oksidaciju supstance u tačno definisanim laboratorijskim uslovima.

Rezultat se izražava u gramima, kao g HPK/g ispitivane supstance.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Referentne supstance se ne koriste u svim slučajevima prilikom testiranja novih supstanci. Referentne supstance služe prvenstveno za periodičnu kalibraciju metode i omogućavaju poređenje rezultata ukoliko se primenjuje neka druga metoda.

1.4. PRINCIP METODE

Unapred određena količina ispitivane supstance koja je rastvorena ili dispergovana u vodi, se oksiduje sa kalijum dihromatom u medijumu zakiseljenom sa sumpornom kiselinom i sa srebro-sulfatom kao katalizatorom, pod refluksom u toku 2 sata. Preostali dihromat se određuje titracijom pomoću standardizovanog gvožđe-amonijum sulfata.

U slučaju da ispitivane supstance sadrže hlor, dodati živu-sulfatIII da bi se smanjila interferencija hlorida.

______________
III Nakon upotrebe, rastvori koje sadrže živine soli tretiraju se da bi se izbeglo ispuštanje žive u životnu sredinu.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Zbog arbitrarnog načina određivanja, HPK je "indikator sposobnosti oksidovanja", pa se ova metoda koristi kao praktičan postupak za određivanje sadržaja organske materije.

Hloridi mogu da utiču na ovo ispitivanje. Neorganska redukujuća ili oksidujuća sredstva takođe mogu da utiču na određivanje HPK.

Neka ciklična jedinjenja i mnoge isparljive supstance (npr. niže masne kiseline) ne mogu se potpuno oksidovati primenom postupka opisanog u ovoj metodi.

1.6. OPIS METODE

Pripremi se preliminarni rastvor ili disperzija ispitivane supstance da se dobije HPK između 250 mg/l i 600 mg/l.

Napomene:

U slučaju da se radi o slabo rastvorljivim supstancama ili supstancama koje se ne mogu dispergovati, može se odmeriti količina praškaste supstance ili supstance u tečnom obliku koja odgovara količini od 5 mg HPK i staviti u posudu sa vodom.

HPK se često, i naročito u slučaju slabo rastvorljivih supstanci, pogodno određuje modifikacijom postupka, odnosno u zatvorenom sistemu sa izjednačavanjem pritiska1. Primenom ove modifikovane metode, supstance za koje nisu prikladne konvencionalne metode, kao npr. sirćetna kiselina, mogu se uspešno kvantifikovati. U slučaju piridina ova metoda nije primenljiva.

Ukoliko se koncentracija kalijum dihromata, kao što je preporučeno u literaturi1, poveća na 0,25 N (0,0416 M), olakšano je direktno merenje 5 mg do 10 mg supstance, što je neophodno za određivanje HPK za slabo rastvorljive supstance2.

U ostalim slučajevima, HPK se određuje primenom bilo koje odgovarajuće domaće ili međunarodne standardizovane metode ispitivanja.

2. PODACI I PROCENA

HPK u posudi izračunava se prema izabranom normalizovanom postupku i pretvara se u grame HPK po gramu ispitivane supstance.

3. IZVEŠTAJ

U izveštaju o ispitivanju navodi se koja metoda je korišćena pri ispitivanju.

HPK predstavlja srednju vrednost najmanje tri merenja. Navode se svi podaci i napomene merodavne za tumačenje rezultata, naročito one koje se odnose na prisustvo nečistoća i svojstva ispitivane supstance (ako su poznata), koja bi mogla uticati na rezultate.

Navodi se i da li je korišćen živin sulfat u cilju smanjenja uticaja hlorida.

4. LITERATURA

1. NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen demand.

2. ISBN O 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate value) of polluted and waste waters.

3. NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen demand.

4. DS 217 = water analysis Determination of the chemical oxygen demand.

5. DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen demand (COD) within the range above 15 mg per litre.

6. NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.

7. ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichromate methods.

C.7. RAZGRADNJA - ABIOTIČKA RAZGRADNJA: HIDROLIZA KAO FUNKCIJA pH

Deo prvi

1. METODA ISPITIVANJA

Metoda se zasniva na Uputstvu za ispitivanje OECD 111 (2004).

1.1. UVOD

Hemikalije mogu dospeti u površinske vode direktnim unošenjem, raspršivanjem, izlivanjem, drenažom ili kao posledica odlaganja otpada iz industrije, domaćinstava i poljoprivrede, iz otpadnih voda ili atmosfere. Dospele hemikalije u površinskim vodama mogu biti transformisane hemijski (npr. hidroliza, oksidacija), fotohemijski, odnosno mikrobiološki. Ova metoda opisuje laboratorijsku metodu ispitivanja za procenu abiotičke hidrolitičke transformacije hemikalija u vodenim sistemima pri vrednostima pH koje su uobičajeno karakteristične (pH 4-9) i bazira se na uputstvima1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.

Eksperimenti se izvode u cilju određivanja:

1) stepena hidrolize ispitivane supstance u funkciji pH i

2) prirode/načina i stepena obrazovanja i smanjenja produkata hidrolize kojima organizmi mogu biti izloženi.

Ovi eksperimenti mogu da budu obavezni za hemikalije koje se direktno primenjuju na površinske vode ili za hemikalije za koje postoji veliki stepen verovatnoće da će dospeti u životnu sredinu nekim od puteva unosa navedenim u ovom odeljku.

1.2. DEFINICIJE I MERNE JEDINICE

U svim ispitivanjima koriste se merne jedinice koje su obuhvaćene Međunarodnim sistemom jedinica (SI).

Ispitivana supstanca jeste bilo koja supstanca, odnosno polazna supstanca ili odgovarajući produkt hidrolize.

Produkti transformacije jesu sve supstance koje nastaju kao produkt u reakcijama biotičke ili abiotičke transformacije.

Produkti hidrolize jesu sve supstance koje nastaju kao produkti hidrolitičke transformacije ispitivane supstance.

Hidroliza jeste reakcija ispitivane supstance (u daljem tekstu: RH) sa vodom, sa zamenom H grupe sa OH grupom:

RH + HOH → ROH + HH [1]

Stopa kojom se koncentracija RH smanjuje u pojednostavljenom postupku predstavlja se formulama:

stopa = k[H2O][RH], za reakcije drugog reda ili

stopa = k[RH], za reakcije prvog reda,

u zavisnosti od koraka kojim se određuje stopa.

S obzirom na to da je voda prisutna u znatno većoj količini u odnosu na ispitivanu supstancu, ovaj tip reakcije se uobičajeno opisuje kao reakcija pseudo-prvog reda u kojoj je zabeležena konstanta data odnosom:

kobs = k[H2O] [2]

i može biti određena izrazomIV:

pri čemu:

t jeste vreme;

C0, Ct jesu koncentracije RH u vremenu 0 i t.

Jedinica mere ove konstante jeste (vreme)-1.

Poluvreme reakcije jeste vreme potrebno za reakciju 50% RH koje se određuje formulom:

Vreme poluživota (t0,5) jeste vreme potrebno za 50% hidrolizu ispitivane supstance kada se hidroliza može opisati kinetikom prvog reda. Ova vrednost je nezavisna od koncentracije.

Vreme nestajanja 50 (u daljem tekstu: DT50) jeste vremenski period u okviru kojeg se koncentracija ispitivane supstance smanji za 50%. Razlikuje se od parametra t0,5 kada se hidroliza ne može opisati kao kinetika prvog reda.

Procena k na različitim temperaturama

Kada su poznate konstante stepena hidrolize za dve temperature, konstante stepena za druge temperature mogu se izračunati Arheniusovom jednačinom:

ili

Grafički prikaz odnosa lnk prema 1/T daje pravu sa nagibom − E/R, pri čemu:

K jeste konstanta stepena hidrolize, merena na različitim temperaturama;

E jeste energija aktivacije (kJ/mol);

T jeste apsolutna temperatura (T);

R jeste gasna konstanta (8.314 J/mol.K).

Energija aktivacije izračunava se regresionom analizom jednačinom:

pri čemu je T2> T1.

____________
IV Ukoliko se na grafičkom prikazu log-transformisanih podataka u funkciji vremena ne uočava linearna povezanost (u skladu sa konstantom prvog reda), upotreba jednačine [3] nije adekvatna za određivanje konstante stepena hidrolize ispitivane supstance.

1.3. PRIMENA METODE

Metoda se primenjuje za hemijske supstance (obeležene ili neobeležene) za koje postoji dovoljno precizna i osetljiva analitička metoda. Metoda može da se primeni i za supstance koje nisu ili su u manjoj meri isparljive ukoliko su rastvorljive u vodi. Metodu ne primenjivati za hemikalije koje su u vodenim rastvorima lako isparljive (npr. fumiganti, organski rastvarači) i koje ne mogu da obrazuju stabilne rastvore u ispitivanim uslovima propisanim za ovu metodu. Ova metoda nije prikladna za supstance slabo rastvorljive u vodi.

1.4. PRINCIP METODE

Sterilni vodeni rastvori pufera različitih pH vrednosti (pH 4, 7 i 9) u kojima je rastvorena ispitivana supstanca inkubiraju se u mraku u kontrolisanim laboratorijskim uslovima (na konstantnoj temperaturi). Nakon odgovarajućeg vremena, puferski rastvori se analiziraju na ispitivanu supstancu i na produkte hidrolize. Ukoliko se ispituju obeležene supstance (npr. C14), može se lakše uspostaviti maseni bilans.

Ova metoda ispitivanja izvodi se kao etapni pristup koji je dat u Delu drugom ove metode. Izbor naredne etape ispitivanja određen je rezultatima prethodne etape.

1.5. PODACI O ISPITIVANOJ SUPSTANCI

Neobeležene ili obeležene supstance mogu se koristiti za merenje stepena hidrolize. Prednost za proučavanje puteva hidrolize i za uspostavljanje masenog balansa daje se obeleženim supstancama. U specijalnim slučajevima obeležavanje supstanci nije neophodno. Preporučuje se obeležavanje supstanci sa C14, ali se mogu upotrebljavati i drugi izotopi kao što su C13, N15, H3. Koliko je god moguće, potrebno je obeležiti najstabilniji deo molekula. Na primer, ukoliko ispitivana supstanca sadrži jedan prsten, obeležavanje ovog prstena je obavezno; ukoliko supstanca sadrži dva ili više prstena, potrebno je izvesti dodatne eksperimente da bi se procenila sudbina svakog pojedinačnog prstena koji je obeležen da bi se dobili podaci o obrazovanju produkata hidrolize. Procenat čistoće supstance da bude najmanje 95%.

Pre izvođenja ispitivanja, potrebno je o ispitivanoj supstancimati podatke:

- rastvorljivost u vodi (videti Metodu A.6. koja je data u ovom pravilniku);

- rastvorljivost u organskim rastvaračima;

- napon pare (videti Metodu A.4. koja je data u ovom pravilniku) i Henrijeva konstanta;

- podeoni koeficijent n-oktanol/voda (videti Metodu A.8. koja je data u ovom pravilniku);

- konstantna disocijacije pKa (videti u literaturi9);

- stepen direktne i indirektne fototransformacije u vodi, ukoliko je potrebno.

Treba da budu poznati i podaci o analitičkim metodama za kvantifikaciju ispitivane supstance i ukoliko je relevantno, podaci o metodama za identifikaciju i kvantifikaciju produkata hidrolize u vodenim rastvorima (videti odeljak 1.7.2. ove metode).

1.6. REFERENTNE SUPSTANCE

Referentne supstance, kada je moguće, koriste se za identifikaciju i kvantifikaciju produkata hidrolize primenom spektroskopskih i hromatografksih metoda ili neke druge dovoljno osetljive metode.

1.7. KRITERIJUMI KVALITETA

1.7.1. Efikasnost primenjene analitičke metode

Analiza puferskih rastvora ili njihovih ekstrakata neposredno nakon dodavanja ispitivane supstance u najmanje dva ponavljanja daje prve indicije o efikasnosti analitičke metode i ujednačenosti primene izabranog postupka za ispitivanu supstancu. Efikasnost za dalje faze eksperimenta određuje se na osnovu razlike mase (kada se koristi obeleženi materijal). Procenat efiskasnosti iznosi od 90% do 110% za obeležene i neobeležene hemikalije7. U slučaju da postoje tehničke poteškoće da se zadovolji ovaj kriterijum, efikasnost od 70% je prihvatljiva za neobeležene hemikalije, uz dodatno objašnjenje.

1.7.2. Ponovljivost i osetljivost analitičke metode

Ponovljivost analitičke metode kojom se kvantifikuje ispitivana supstanca i kasnije produkti hidrolize može se proveriti analizom puferskog rastvora (ili njihovih ekstrakata) u dva ponavljanja nakon što se obrazuju produkti hidrolize u dovoljnim količinama za kvantifikaciju.

Analitička metoda treba da je dovoljno osetljiva za kvantifikaciju do najviše 10% od početne koncentracije supstance. Ukoliko je relevantno, analitička metoda treba da bude dovoljno osetljiva i za kvantifikaciju bilo kojih produkata hidrolize koji predstavljaju 10% ili više (u bilo kom vremenu u periodu ispitivanja) od primenjene koncentracije, do 25% ili manje od najviše koncentracije.

1.7.3. Intervali poverenja za kinetičke podatke o hidrolizi

Intervali poverenja se izračunavaju za sve koeficijente regresione prave, konstante, vreme poluživota i bilo koje druge kinetičke parametre (npr. DT50).

1.8. OPIS METODE

1.8.1. Oprema i instrumenti

Eksperimenti se izvode u staklenim posudama (npr. epruvetama, tikvicama) u mraku i u sterilnim uslovima, ukoliko je neophodno, osim ukoliko preliminarni podaci (kao što je podeoni koeficijent n-oktanol/voda) ukazuju na to da supstanca prijanja za staklene površine. U tim slučajevima, može se razmatrati upotreba drugih materijala (kao što je teflon). Problem prijanjanja (adhezije) na staklo može se rešiti i:

- određivanjem mase ispitivane supstance i produkata hidrolize koji su sorbovani na zidove posude;

- upotrebom ultrazvučnih kupatila;

- spiranjem sa zidova posude sa rastvaračem pri svakom uzimanju uzoraka za analizu;

- korišćenjem formulisanih proizvoda;

- upotrebom dodatnih rastvarača za uvođenje ispitivane supstance u sistem, dodatni rastvarač ne sme da utiče na hidrolizu supstance.

Vodena kupatila sa mešalicom ili inkubatori sa termoregulacijom potrebni su za inkubaciju rastvora različitih koncentracija ispitivane supstance.

Potrebna je standardna laboratorijska oprema koja sadrži:

- pH-metar;

- instrumente za analitička merenja kao što su GC, HPLC, TLC uključujući i odgovarajuće sisteme za detekciju supstanci obeleženih ili neobeleženih radioizotopima ili metoda inverznog razblaženja izotopa;

- instrumente za identifikaciju (npr. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR, itd.);

- tečni scintilatorski brojač;

- separacione levkove za tečno-tečnu ekstrakciju;

- opremu za koncentrovanje rastvora i ekstrakata (npr. rotirajući evaporator);

- opremu za održavanje temperature (npr. vodeno kupatilo).

Hemijski reagensi uključuju:

- organske rastvarače, analitičke čistoće, kao što je heksan, dihlorometan, itd;

- tečnost za scintilatorski brojač;

- puferski rastvori (videti odeljak 1.8.3. ove metode).

Sve staklene posude, redestilovana voda i puferski rastvori koji se koriste sterilni su.

1.8.2. Uvođenje ispitivane supstance

Ispitivana supstanca se uvodi u puferski sistem u obliku vodenog rastvora (videti Deo četvrti ove metode). Upotreba malih količina rastvora koji se dobro mešaju sa vodom (kao što je acetonitril, aceton, etanol) dozvoljena je za uvođenje i distribuciju ispitivane supstance, ali količina ne treba da bude veća od 1% v/v. U slučaju da se razmatra upotreba veće količine rastvarača (npr. kod slabo rastvorljivih supstanci), ovo se može dozvoliti samo ako se dokaže da rastvarač nema uticaj na hidrolizu ispitivane supstance.

Za rutinsku upotrebu ne preporučuju seformulisani proizvodi, jer se ne može isključiti mogućnost da sastojci formulacije utiču na proces hidrolize. Za slabo rastvorljive supstance ili za supstance koje prijanjaju na staklene površine (videti odeljak 1.8.1. ove metode) upotreba formulisanih proizvoda može da bude odgovarajuća alternativa.

Ispituje se samo jedna koncentracija ispitivane supstance. Koncentracija ne sme da prelazi 0,01M ili polovinu koncentracije zasićenog rastvora.

1.8.3. Puferski rastvori

Ova metoda ispitivanja izvodi se pri vrednostima pH od 4, 7 i 9. Za potrebe ovog ispitivanja, puferski rastvori se pripremaju sa hemikalijama analitičke čistoće i redestilovanom vodom. Neki od puferskih sistema koji se koriste dati su u Delu trećem ove metode. Puferski sistem može da utiče na hidrolizu i ukoliko se uoče promene koristi se drugi puferski sistem.

Vrednosti pH svakog puferskog rastvora proveravati sa kalibrisanim pH-metrom sa preciznošću najmanje 0,1 u definisanim temperaturnim uslovima.

1.8.4. Uslovi ispitivanja

1.8.4.1. Temperatura

Ispitivanja hidrolize izvoditi na konstantnoj temperaturi. Radi ekstrapolacije rezultata, neophodno je održavati temperaturu sa minimalnim variranjem ± 0,5° C.

Preliminarno ispitivanje (Etapa 1) izvodi se na temperaturi od 50° C ukoliko se ne raspolaže podacima o načinu hidrolize supstance. Naredne etape kinetičkih ispitivanja izvode se na najmanje tri različite temperature (uključujući i ispitivanje na temperaturi od 50° C) osim ako je preliminarnim ispitivanjem (Etapa 1) dokazano da supstanca ne podleže hidrolizi. Preporučeni temperaturni opseg je 10° C do 70° C (poželjno je da se najmanje jedno ispitivanje izvede na temperaturi manjoj od 25° C) koji obuhvata ne samo temperaturu od 25° C za koju se podnosi izveštaj o ispitivanju, već i većinu vrednosti temperatura zabeleženih u prirodnim uslovima.

1.8.4.2. Osvetljenje i kiseonik

Za ispitivanje hidrolize potrebno je izabrati odgovarajuću metodu za minimiziranje fotolitičkih efekata. Preduzimaju se odgovarajuće mere za sprečavanje oksidacije (npr. uduvavanjem helijuma, azota ili argona 5 minuta pre pripreme rastvora).

1.8.4.3. Trajanje ispitivanja

Preliminarno ispitivanje (Etapa 1) traje 5 dana. Naredne etape ispitivanja traju sve dok se 90% ispitivane supstance ne hidrolizuje ili 30 dana, zavisno od toga koji uslov se pre ispuni.

1.8.5. Izvođenje ispitivanja

1.8.5.1. Preliminarno ispitivanje (Etapa 1)

Preliminarno ispitivanje se izvodi na temperaturi od 50° C ± 0,5° C pri vrednostima pH od 4, 7 i 9. Ukoliko ispitivana supstanca hidrolizuje manje od 10% u toku perioda od 5 dana, (t0,5 25°C > 1 godine) za tu supstancu se smatra da ne podleže hidrolizi i nije potrebno dalje ispitivanje. Ako je za supstancu dokazano da podleže hidrolizi na ambijentalnoj temperaturiV nije neophodno preliminarno ispitivanje. Analitička metoda je potrebno da bude dovoljno precizna i osetljiva da se može detektovati 10% redukcije početne koncentracije ispitivane supstance.

______________
V Ovi podaci mogu da potiču od drugih izvora kao što su: podaci o hidrolizi strukturno sličnih jedinjenja iz literature ili drugih preliminarnih, semi-kvantitativnih ispitivanja hidrolize sa ispitivanom supstancom u fazama razvijanja metode.

1.8.5.2. Hidroliza nestabilnih supstanci (Etapa 2)

Sledeća etapa ispitivanja izvodi se pri pH vrednostima pri kojima je data ispitivana supstanca nestabilna, a što je dokazano preliminarnim ispitivanjem. Puferski rastvori ispitivane supstance temperiraju se na izabranoj temperaturi. Za ispitivanje kinetike prvog reda, svaki rastvor ispitivane supstance analizira se u određenim vremenskim intervalima što omogućava dobijanje najmanje šest pravilno raspoređenih vrednosti u opsegu od 10% do 90% hidrolize ispitivane supstance. Po jedan uzorak supstance uzima se za merenje u šest vremenskih intervala (ukoliko je ispitivanje postavljeno u najmanje dva ponavljanja u odvojenim posudama) i izuzima iz ispitivanja (dobija se set podataka od najmanje dvanaest vrednosti). Nije adekvatno postavljanje ispitivanja samo sa jedinstvenim uzorkom iz koga će se uzimati pojedinačne alikvote za merenja u vremenskim intervalima, jer ne omogućava analizu varijabilnosti podataka i može da dovede do kontaminacije rastvora ispitivane supstance. Ispitivanja kojima se utvrđuje da su eksperimentalni uslovi sterilni izvode se na kraju završnih etapa, odnosno nakon hidrolize 90% ispitivane supstance ili nakon 30 dana. Ako se ne uočava razgradnja (transformacija) supstance, nije neophodno izvoditi ova ispitivanja.

1.8.5.3. Identifikacija produkata hidrolize (Etapa 3)

Sve važnije produkte hidrolize, odnosno one produkte koji predstavljaju najmanje 10% primenjene doze ispitivane supstance identifikovati odgovarajućim analitičkim metodama.

1.8.5.4. Dodatna ispitivanja

Za ispitivanje supstanci koji ne podležu hidrolizi mogu biti neophodna dodatna ispitivanja koja se izvode pri različitim vrednostima pH od 4, 7 i 9.

Na primer, kod proučavanja fizioloških procesa može biti potrebno izvoditi ispitivanje u kiseloj sredini (npr. pH 1,2) pri temperaturnim uslovima koji su fiziološki relevantni (37° C).

2. PODACI

Količina ispitivane supstance i produkata hidrolize izražava se u procentima u odnosu na primenjenu početnu koncentraciju ispitivane supstance, i kada je prikladno, u mg/l za svaki vremenski interval merenja i pri svim pH vrednostima i temperaturama. Kada se u ispitivanju koriste obeležene supstance maseni balans se izražava u procentima u odnosu na primenjenu početnu koncentraciju.

Rezultati ispitivanja predstavljaju se grafički: log-transformisani podaci za koncentraciju ispitivane supstance u funkciji vremena. Treba identifikovati sve važnije produkte hidrolize, odnosno produkte koji predstavljaju najmanje 10% primenjene doze ispitivane supstance. Podatke za koncentraciju produkata hidrolize transformisati u log-transformisane podatke (identično kao i za ispitivanu supstancu) da bi se uočio stepen obrazovanja i smanjenja produkata hidrolize.

2.1. OBRADA PODATAKA

Preciznije izračunavanje vrednosti poluživota ili vrednosti DT50 postiže se primenom odgovarajućih kinetičkih modela. Vrednosti poluživota, odnosno vrednosti DT50 (uključujući i intervale poverenja) prikazuju se za svaku pH vrednost i temperaturu sa opisom korišćenog modela, stepenom kinetike i koeficijenta korelacije (r2). Ove računice mogu se primeniti za produkte hidrolize.

Kada se ispitivanja izvode na različitim temperaturama, konstante hidrolize pseudo-prvog reda (kobs) opisati u funkciji temperature. Izračunavanja se zasnivaju na raščlanjivanju vrednosti kobs na vrednosti konstante za hidrolizu u kiseloj, neutralnoj i baznoj sredini (kH, kneutral i kOH) i Arheniusovoj jednačini:

pri čemu:

Ai i Bi jesu vrednosti konstante za odsečak i konstante za nagib regresione prave dobijene regresionom analizom vrednosti ln ki u funkciji recipročnih vrednosti za apsolutnu temperaturu izraženih u Kelvinima (T).

Preko Arheniusove jednačine koja izražava vezu između konstanti za hidrolizu u kiseloj, neutralnoj i baznoj sredini, mogu se izračunati vrednosti konstante kinetike pseudo-prvog reda, a samim tim i vrednosti poluživota za različite temperature za koje nije moguće direktno eksperimentalno određivanje konstanti.

2.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Većina reakcija hidrolize odigrava se po kinetici prvog reda, te je vreme poluživota nezavisno od koncentracije (videti jednačinu 4 u Delu drugom ove metode). Ovo dozvoljava ekstrapolaciju rezultata dobijenih u laboratorijskim eksperimentima određenih za koncentracije od 10-2M do 10-3 M na uslove u životnoj sredini (≤ 10-6).

Primere dobre korelacije između stepena hidrolize izmerenih u ispitivanjima u čistoj i u ambijentalnoj vodi za set hemikalije, uz uslov da se mere pH vrednost i temperatura, dali su Mabej i Mil1.

3. IZVEŠTAJ

Izveštaj o ispitivanju sadrži podatke o:

1. ispitivanoj supstanci:

- uobičajeni naziv, hemijski naziv, CAS broj, strukturna formula (sa naznačenom pozicijom molekula koji je obeležen radioizotopom) i relevantna fizička i hemijska svojstva (videti odeljak 1.5. ove metode);

- stepen čistoće supstance;

- stepen čistoće oznake i označene supstance, kao i molarna aktivnost (gde je prikladno);

- puferski rastvori;

- vreme i način pripreme;

- puferski rastvori i voda koji se koriste u ispitivanju;

- molarna koncentracija i pH vrednosti puferskih rastvora;

2. uslovima ispitivanja:

- datum izvođenja ispitivanja;

- količina ispitivane supstance;

- način uvođenja ispitivane supstance u rastvor pufera i vrsta rastvarača (kao i količina);

- zapremina puferskih rastvora koji se inkubiraju (puferski rastvor u koji je rastvorena ispitivana supstanca);

- opis sistema za inkubaciju;

- pH vrednost i temperatura;

- vreme uzimanja uzoraka za analizu;

- način ekstrakcije;

- metode za kvantifikaciju i identifikaciju ispitivane supstance i produkata hidrolize u puferskim rastvorima;

- broj ponavljanja;

3. Rezultatima:

- ponovljivost i osetljivost primenjenih analitičkih metoda;

- efikasnost (kriterijumi za validnost ispitivanja dati su u odeljku 1.7.1. ove metode);

- podaci za pojedinačna ponavljanja i njihove srednje vrednosti izraženi u tabelama;

- maseni balans u toku i na kraju ispitivanja (kad se koriste obeležene supstance);

- rezultati preliminarnog ispitivanja;

- tumačenje rezultata;

- svi originalni (sirovi) podaci i grafici.

Kada je određen stepen hidrolize u izveštaju o ispitivanju navode se:

- grafički prikaz koncentracija ispitivane supstance u funkciji vremena, kada je moguće i za produkte hidrolize za svaku pH vrednost i temperaturu;

- rezultati Arhenijusove jednačine za temperaturu 20° C/25° C sa pH vrednostima, konstante (x-1 ili dan-1), vreme poluživota ili DT50, temperature (°C) uključujući i intervale poverenja i koeficijente korelacije (p2);

- predloženi put hidrolize.

4. LITERATURA

1. OECD, (1981) Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 111, adopted 12 May 1981.

2. US-Environmental Protection Agency, (1982) 40 CFR 796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25 oC. Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.

3. Agriculture Canada, (1987) Environmental Chemistry and Fate Guidelines for registration of pesticides in Canada.

4. European Union (EU), (1995) Commission Directive 95/36/EC amending Council Directive 91/414/EEC Concerning the placing of plant protection products on the market. Annex V: Fate and Behaviour in the Environment.

5. Dutch Commission for Registration of Pesticides, (1991) Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.

6. BBA, (1980) Merkblatt No 55, Teil I und II: Prüfung des Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (October 1980).

7. SETAC, (1995) Procedures for Assessing the Environmental Fate and ECotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.

8. OECD, (2000) Guidance document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures, OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No 23.

9. OECD, (1993) Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.

10. Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P., (1997) ReCommended changes in pesticide fate study guidelines for improving input to Computer models. (Text version of oral presentation at the 14th Annual Meeting of the Society of Environmental ToxiCology and Chemistry, Dallas TX, November 1993).

11. Mabey, W. and Mill, T., (1978) Critical review of hydrolysis of organic Compounds in water under environmental Conditions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, p. 383-415.

Deo drugi

ŠEMA ETAPNOG ISPITIVANJA HIDROLIZE

Deo treći

PUFERSKI SISTEMI

Puferske smeše prema Klarku i Lubsu:

___________
VI Vrednosti pH date u ovoj tabeli izračunate su Sorensenovim standarnim jednačinama (1909). Odgovarajuće pH vrednosti su za 0,04 pH jedinica veće od vrednosti datih u tabeli.

Citratni puferi prema Kolthofu i Vlišhoveru:

_____________
VII Dodati mali kristal tinola ili slične supstance da se spreči rast plesni.

Boratne smeše prema Sorensenu:

Fosfatne smeše prema Sorensenu:

C.8. TOKSIČNOST ZA KIŠNE GLISTE: METODA ISPITIVANJA SA VEŠTAČKIM ZEMLJIŠTEM

Deo prvi

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

U ovoj laboratorijskoj metodi ispitivanja, ispitivana supstanca dodaje se u veštačko zemljište u koje se smeštaju kišne gliste. Nakon 14 dana (ili po izboru nakon 7 dana) ispituje se letalno dejstvo supstance na kišne gliste. Ovo ispitivanje predstavlja postupak kojim se u relativno kratkom roku može steći uvid u dejstvo hemikalija na kišne gliste, kod dermalnog i oralnog unosa supstance.

1.2. DEFINICIJA

LC50 jeste koncentracija supstance koja izaziva smrt 50% ispitivanih jedinki u toku unapred utvrđenog perioda izlaganja.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Referentna supstanca se koristi povremeno kao sredstvo kojim se pokazuje da nije došlo do značajnih promena osetljivosti test sistema.

Kao referentna supstanca preporučuje se hloracetamid analitičke čistoće.

1.4. PRINCIP METODE

Zemljište je promenljiv medijum, te se za ovu metodu koristi precizno definisano veštačko zemljište koje sadrži ilovaču. Odrasle jedinke kišnih glista vrste Eisenia foetida (videti belešku u Delu drugom ove metode) drže se u definisanom veštačkom zemljištu tretiranom različitim koncentracijama ispitivane supstance. Četrnaest dana (može i 7 dana) nakon početka ispitivanja, sadržaj posude iz svake esperimentalne grupe istrese se u plitku laboratorijsku kadicu i prebroje se preživele kišne gliste.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Metoda je osmišljena tako da je maksimalno ponovljiva, s obzirom na zemljišni supstrat i ispitivane organizme. Da bi ispitivanje bilo prihvaćeno, smrtnost u kontrolama ne sme premašiti 10% na kraju ispitivanja.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Materijal

1.6.1.1. Zemljišni supstrat

Kao osnovni ispitivani supstrat koristi se tačno definisano veštačko zemljište.

Osnovni supstrat (procenti na bazi suve mase) sadrži:

- 10% treseta (vrednosti pH što je moguće bliže 5,5 do 6,0, bez vidljivih ostataka biljaka, sitno mleven);

- 20% kaolinska glina sa, ako je moguće, više od 50% kaolina;

- oko 69% industrijskog kvarcnog peska (pretežno sitni pesak sa više od 50% čestica veličine 0,05 mm do 0,2 mm). Ako se supstanca ne može dovoljno dobro dispergovati u vodi, ostaviti 10 g po sanduku da bi se kasnije pomešalo sa ispitivanom supstancom;

- oko 1% kalcijum karbonata (CaCO3), sprašenog, hemijski čistog, dodaje se za korekciju pH vrednosti na 6,0 ± 0,5.

Ispitivani supstrat sadrži:

- osnovni supstrat,

- ispitivanu supstancu i

- dejonizovanu vodu.

Sadržaj vode iznosi oko 25% do 42% suve mase osnovnog supstrata. Sadržaj vode u supstratu određuje se sušenjem uzorka do stalne težine na temperaturi od 105° C. Ključni kriterijum je da veštačko zemljište bude ovlaženo do tačke u kojoj nema zadržavanja vode. Tokom mešanja se pazi da se dobije ravnomerna raspodela ispitivane supstance i supstrata. Opisuje se način na koji se ispitivana supstanca dodaje u supstrat.

Kontrolni supstrat sadrži:

- osnovni supstrat i

- vodu.

Ako se koristi aditiv, dodatna kontrola sadrži istu količinu aditiva.

1.6.1.2. Eksperimentalne posude

Staklena posuda zapremine oko 1 L (propisno pokrivena plastičnim poklopcem, sahatnim staklom ili plastičnom folijom sa otvorima za ventilaciju) napunjena ispitivanim i kontrolnim supstratom u količini ekvivalentnoj 500 g suve mase supstrata.

1.6.2. Uslovi u toku ispitivanja

Eksperimentalne posude držati u klima komorama na temperaturi od 20° C ± 2° C sa stalnim osvetljenjem. Intenzitet svetla da bude između 400 lux i 800 lux.

Ispitivanje traje 14 dana, ali se smrtnost procenjuje i 7 dana nakon početka ispitivanja.

1.6.3. Postupak metode ispitivanja

Ispitivane koncentracije

Koncentracije ispitivane supstance izražavaju se kao masa supstance po suvoj masi supstrata (mg/kg).

Preliminarna studije za utvrđivanje opsega koncentracija

Opseg koncentracija koje dovode do smrtnosti od 0% do 100% može se odrediti studijom za utvrđivanje opsega da bi se dobila informacija o opsegu koncentracija koje će se koristiti u definitivnom ispitivanju.

Supstanca se ispituje u sledećim koncentracijama: 1.000 mg; 100 mg; 10 mg; 1 mg i 0,1 mg supstance po kilogramu supstrata (suva masa).

Ako se radi konačno ispitivanje, po jedna ispitivana grupa od po 10 glista po koncentraciji i jedna grupa po kontroli, mogu biti dovoljne za studiju utvrđivanja opsega koncentracija.

Konačno ispitivanje

Rezultati studije za utvrđivanje opsega koncentracija koriste se za izbor najmanje 5 koncentracija u geometrijskom nizu sa faktorom ne većim od 1,8. Izabrane koncentracije obuhvataju opseg smrtnosti od 0% do 100%.

Ispitivanje serija koncentracija treba da omogući što precizniju procenu vrednosti LC50 i odgovarajućih intervala poverenja.

U definitivnom ispitivanju koriste se najmanje četiri ekperimentalne grupe od po 10 glista po koncentraciji i kontroli. Rezultati tretmana prikazuju se kao srednja vrednost iz 4 grupe sa standardnom devijacijom.

Kad dve uzastopne koncentracije, pri faktoru od 1,8 rezultiraju 0% i 100% smrtnošću, te dve vrednosti su dovoljne da pokažu opseg u kojem se nalazi LC50.

Mešavina osnovnog ispitivanog supstrata i ispitivane supstance

Ispitivani supstrat kad god je moguće priprema se izuzimajući vodu, bez i jednog dodatnog agensa. Neposredno pre početka ispitivanja, emulzija ili disperzija ispitivane supstance u dejoniziovanoj vodi ili drugom rastvaraču meša se sa osnovnim ispitivanim supstratom ili se ravnomerno rasprši po supstratu pomoću hromatografskog ili sličnog raspršivača za fino raspršivanje.

Ako nije rastvorljiva u vodi, ispitivana supstanca može se rastvoriti u najmanjoj mogućoj zapremini odgovarajućeg organskog rastvarača (npr. heksana, acetona ili hloroforma). Samo sredstva koja brzo isparavaju mogu se koristiti za rastvaranje, disperziju ili emulgovanje ispitivane supstance. Ispitivana supstanca se pre upotrebe provetrava. Količina vode koja ispari nadoknađuje se. Kontrola sadrži istu količinu svakog upotrebljenog dodatnog sredstva.

Ako ispitivana supstanca nije rastvorljiva ili se ne može dispergovati ili emulgovati u organskim rastvaračima, 10 g mešavine sitno samlevenog kvarcnog peska i količina ispitivane supstance potrebna za tretman 500 g suve mase veštačkog zemljišta pomeša se sa 490 g suve mase ispitivane supstance.

U svakoj grupi, u svaku posudu stavlja se vlažan ispitivani supstrat u količini ekvivalentnoj 500 g suve mase, a zatim se na površinu supstrata stavlja po 10 kišnih glista po posudi. Gliste su prethodno aklimatizovane u toku 24 sata u slično vlažnom, osnovnom suptratu, a zatim brzo isprane. Pre stavljanja u ispitivani supstrat, suvišna voda sa glista upije se filter papirom.

Eksperimentalne posude pokriju se perforiranim plastičnim poklopcima, sahatnim staklom ili folijom, da bi se sprečilo sušenje supstrata. Posude se drže 14 dana u uslovima propisanim metodom.

Smrtnost se procenjuje 14 (opciono 7) dana nakon početka. Supstrat se prospe u plitak stakleni sud od nerđajućeg čelika. Kišne gliste se pregledaju i odredi se broj preživelih glista. Kišne gliste smatraju se mrtvim ako ne odgovaraju na nežan mehanički nadražaj na prednjem kraju.

Kada se smrtnost procenjuje nakon 7 dana, posuda se ponovno napuni supstratom i preživele gliste se vrate na površinu istog ispitivanog supstrata.

1.6.4. Ispitivani organizmi

Ispitivani organizmi su odrasle jedinke Eisenia foetida (videti Deo drugi ove metode), stare najmanje dva meseca sa klitelumom, pune težine između 300 mg i 600 mg (za postupak uzgajanja videti Deo drugi ove metode).

2. PODACI

2.1. OBRADA I PROCENA REZULTATA

Koncentracija ispitivane supstance navodi se u odnosu na odgovarajuće procente mrtvih kišnih glista.

Kad su podaci dobri, vrednost LC50 sa intervalima poverenja (p = 0,05) može se odrediti pomoću standardnih metoda (videti u literaturi4). LC50 se izražava u mg ispitivane supstance po kilogramu ispitivanog supstrata (suva masa).

U slučajevima kada je nagib krive dozne zavisnosti previše strm da bi se mogla izračunati LC50, dovoljna je grafička procena te vrednosti.

Kad dve uzastopne koncentracije pri faktoru od 1,8 dovode samo do 0% i 100% smrtnosti, te dve vrednosti su dovoljne da pokažu opseg u kojem se nalazi LC50.

3. IZVEŠTAJ

Izveštaj o ispitivanju, ako je moguće, sadrži:

- izjavu da je ispitivanje izvedeno u skladu sa navedenim kriterijima kvaliteta;

- podatak koje je ispitivanje izvedeno (preliminarna studija za utvrđivanje opsega koncentracija ili definitivno ispitivanje);

- tačan opis uslova u toku ispitivanja ili izjavu da je ispitivanje bilo izvedeno u skladu sa postupkom (navodi se svako odstupanje);

- tačan opis načina na koji je ispitivana supstanca umešana u osnovni supstrat;

- podatke o ispitivanim organizmima (vrsta, starost, srednja vrednost i opseg težine, uslovi držanja i uzgajanja, snabdevač);

- podatak o metodi korišćenoj za određivanje LC50;

- rezultate ispitivanja, uključujući sve upotrebljene podatke;

- opis primećenih simptoma ili promena u ponašanju ispitivanih organizama;

- smrtnost u kontrolama;

- LC50 ili najvišu ispitivanu koncentraciju bez smrtnosti i najnižu ispitivanu koncentraciju sa smrtnošću od 100%, 14 dana (i po izboru 7 dana) od početka ispitivanja;

- grafički prikaz krive koncentracija/odgovor;

- rezultate dobijene sa referentnom supstancom (u vezi sa ovim ispitivanjem ili iz prethodnih ispitivanja kontrole kvaliteta).

4. LITERATURA

1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 207, Decision of the Council C(81)30 final.

2. Edwards, C. A. and Lofty, J. R., 1977, Biology of Earthworms, Chapman and Hall, London, p. 331.

3. Bouche. M. B., 1972, Lombriciens de France, ECOlogie et Systematique, Institut National de la Recherche Agronomique, p. 671.

4. Litchfield, J. T. andWilcoxon, F., A simplified method of evaluation dose effect experiments. I. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, p. 99.

5. Commission of the European Communities, Development of a standardised laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.

6. Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für land - und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag 'Toxizitätstest am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden', in: Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.

Deo drugi

UZGAJANJE I ČUVANJE GLISTA PRE ISPITIVANJA

Za uzgajanje životinja, 30 do 50 odraslih glista stavi se u sanduk za uzgajanje sa svežim supstratom iz koga se izvade nakon 14 dana. Gliste se mogu upotrebiti za uzgajanje daljih odgajivačkih grupa. Kišne gliste koje se izlegu iz kokona koriste se u ispitivanjima kad odrastu (u prepisanim uslovima nakon dva do tri meseca).

USLOVI DRŽANJA I UZGOJA

Uslovi za držanje i uzgoj životinja su:

Klima komora: temperatura 20° C ± 2° C, ako je moguće sa stalnim osvetljenjem (intenziteta 400 lux do 800 lux).

Sanduci za uzgoj: pogodni plitki sanduci zapremine od 10 L do 20 L.

Supstrat: Eisenia foetida može se uzgajati u ekskrementu različitih životinja. Kao supstrat se preporučuje mešavina treseta (50% zapremine) i kravlje ili konjske balege (50% zapremine). Supstrat ima vrednost pH oko 6 do 7 (reguliše se kalcijum karbonatom) i nisku jonsku provodljivost (manje od 6 mmhos ili 0,5% koncentracije soli). Supstrat treba da bude vlažan, ali ne previše mokar.

Uz opisani postupak mogu se uspešno koristiti i druge procedure.

Napomena: Postoje dva tipa glista Eisenia foetida koje su taksonomi razdvojili u dve vrste (Vouche, 1972). Morfološki su slične, ali jedna vrsta (Eisenia foetidafoetida) ima na segmentima tipične poprečne pruge ili prstenove, dok ih druga vrsta (Eisenia foetida andrei) nema, odnosno ima crvenkaste šare. Kad god je moguće, koristiti vrsti Eisenia foetida andrei. Ostale vrste mogu se koristiti ako je na raspolaganju potrebna metodologija.

C.9. BIORAZGRADNJA - ZAHN-WELLENS METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Cilj ove metode je procena mogućnosti potpune biorazgradljivosti dobro rastvorljivih, neisparljivih organskih supstanci na koje deluju mikroorganizmi u relativno visokim koncentracijama u ispitivanju u statičkim uslovima.

Prilikom tumačenja rezultata uzeti u obzir mogućnost fizičko-hemijske adsorpcije na suspendovane materije (videti odeljak 3.2. ove metode).

Za koncentracije ispitivane supstance uzimaju se koncentracije koje korespondiraju vrednostima za koncentraciju rastvorenog organskog ugljenika (u daljem tekstu: DOC) u opsegu od 50 mg/l do 400 mg/l ili vrednostima za hemijsku potrošnju kiseonika(u daljem tekstu: HPK) u opsegu od 100 mg/ldo 1.000 mg/l. Ispitivanje ovako relativno visokih koncentracija povećava analitičku pouzdanost. Jedinjenja sa toksičnim svojstvima mogu usporiti i inhibirati proces razgradnje.

U ovoj metodi, DOC ili HPK koristi se za procenu potpune biorazgradljivosti ispitivane supstance.

Uporedno izvođenje specifičnih analitičkih metoda može dati procenu primarne biorazgradljivosti supstanci (nestanak polazne supstance).

Metoda se može primeniti samo za organske supstance koje, pri koncentracijama koje se koriste u ispitivanju:

- jesu rastvorljive u vodi u uslovima definisanim ovom metodom;

- imaju neznatan napon pare u uslovima definisanim ovom metodom;

- ne deluju inhibitorno na bakterije;

- koje se adsorbuju se unutar sistema samo u ograničenoj meri;

- ne obrazuju penu.

Podaci o proporcionalnom udelu glavnih sastojaka ispitivane supstance korisni su pri tumačenju dobijenih rezultata, naročito u slučajevima gde su vrednosti dobijenih rezultata niske ili ekstremne.

Podaci o toksičnosti ispitivane supstance na mikroorganizme poželjni su za tumačenje niskih dobijenih vrednosti i prilikom izbora odgovarajućih koncentracija za potrebe ispitivanja.

1.2. DEFINICIJE I MERNE JEDINICE

Stepen razgradnje koji se dostigne na kraju ispitivanja opisuje se kao biorazgradljivost u Zahn-Wellens ispitivanju:

pri čemu:

Dt jeste procenat biorazgradnje (%) u vremenu T;

CA jeste DOC (ili HPK) vrednost izmerena u ispitivanoj smeši 3 sata nakon početka ispitivanja (mg/l);

Ct jesu DOC ili HPK vrednosti izmerene u ispitivanoj smeši u vremenu t (mg/l);

CB jesu DOC ili HPK vrednosti izmerene u kontroli u vremenu t (mg/l);

CBA jesu DOC ili HPK vrednosti izmerene u kontroli, tri sata nakon početka ispitivanja (mg/l).

Stepen razgradnje izražava se u procentima bez decimala.

Procenat razgradnje jeste procenat smanjenja vrednosti DOC (ili HPK) za datu supstancu.

Razlika između vrednosti izmerene nakon tri sata i izračunate vrednosti, ili ako je moguće izmerene početne vrednosti, može dati koristan podatak o eliminaciji supstance (videti odeljak 3.2. ove metode).

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Korišćenje referentnih supstanci može biti od koristi kada se ispituju nove supstance. Još uvek se ne mogu preporučiti određene referentne supstance.

1.4. PRINCIP METODE

Aktivni mulj, neorganski nutrijenti i ispitivana supstanca u vodenom rastvoru kao jedini izvor ugljenika sjedinjuju se, stavljaju u staklenu posudu zapremine jedan do četiri litra sa mešalicom i aeratorom. Ova smeša se meša i aeriše na temperaturi od 20° C do 25° C pod difuznim osvetljenjem ili u mračnoj komori u toku 28 dana. Proces razgradnje prati se određivanjem vrednosti DOC (ili HPK) u filtratu smeše sa jednodnevnom ili odgovarajućom redovnom dinamikom. Odnos vrednosti DOC (ili HPK) izmerene nakon svakog vremenskog intervala i vrednosti DOC (ili HPK) izmerene tri sata nakon početka ispitivanja izražava se kao procenat biorazgradnje i služi kao mera stepena razgradnje u datom vremenu. Ova vrednost se grafički prikazuje u funkciji vremena kako bi se dobila kriva biološke razgradnje.

Kad se koristi specifična analitička metoda, mogu se meriti promene u koncentraciji polazne supstance do kojih dolazi usled biorazgradnje (primarna biorazgradljivost).

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Ponovljivost metode ispitivanja je dokazana interkalibracijskim ispitivanjima.

Osetljivost metode je u velikoj meri određena varijabilnošću rezultata slepe probe i u manjoj meri, preciznošću određivanja koncentracije rastvorenog organskog ugljenika i količini rastvorene ispitivane supstance

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Pripreme

1.6.1.1. Reagensi

Voda: voda za piće sa sadržajem organskog ugljenika < 5 mg/l. Zbirna koncentracija jona kalcijuma i magnezijuma ne sme biti veća od 2,7 mmol/l; u suprotnom, potrebno je napraviti odgovarajuće razblaživanje sa dejonizivanom ili destilovanom vodom.

Sumporna kiselina, analitičke čistoće: 50 g/l.

Rastvor natrijum-hidroksida, analitičke čistoće: 40 g/l.

Rastvor neorganskih nutrijenata (rastvoriti u 1 L dejonizovane vode):

- NH4Cl (amonijum-hlorid), analitičke čistoće: 38,5 g;

- NaH2PO4Í2H2O (natrijum dihidrogenfosfat), analitičke čistoće: 33,4 g;

- KH2PO4 (kalijum-hidrogenfosfat), analitičke čistoće: 8,5 g;

- K2HPO4 (dikalijum-hidrogenfosfat), analitičke čistoće: 21,75 g.

Smeša služi kao rastvor nutrijenata i kao puferski rastvor.

1.6.1.2. Oprema

Oprema za ispitivanje sadrži:

- staklene posude zapremine od 1 L do 4 L (npr. cilindrične posude);

- mešalicu sa staklenom ili metalnom lopaticom na odgovarajućoj osovini (lopatica se rotira na 5 cm do 10 cm iznad dna posude). Koristi se i magnetna mešalica sa magnetom za mešanje 7 cm do 10 cm;

- staklenu cevčicu sa unutrašnjim prečnikom 2 mm do 4 mm za aeraciju. Otvor cevčice da bude postavljen na oko 1 cm iznad dna posude;

- centrifugu (oko 3.550 g);

- pH-metar;

- oksimetar;

- filter papir;

- uređaj za membransku filtraciju;

- membranske filtere, promera pora 0,45 mm. Membranski filteri su pogodni ukoliko je onemogućeno oslobađanje ugljenika iz filter papira ili adsorbovanje ispitivane supstance u toku filtracije;

- analitičku opremu za određivanje sadržaja organskog ugljenika i hemijske potrošnje kiseonika.

1.6.1.3. Priprema inokuluma

Aktivni mulj iz postrojenja za biološku obradu ispira se (u više ponavljanja) centrifugiranjem ili taloženjem u vodi koja se koristi za potrebe ispitivanja.

Aktivni mulj je potrebno da bude u odgovarajućem stanju. Takav mulj se dobija iz postrojenja za obradu otpadnih voda koja ispravno rade. Da bi se dobilo što više različitih vrsta ili sojeva bakterija, poželjno je mešanje inokuluma iz različitih izvora (npr. iz različitih postrojenja za obradu, iz ekstrakata zemljišta, iz vode iz reka itd). Mešavina inokuluma dalje se tretira na navedeni način.

Za proveru aktivnosti aktivnog mulja videti odeljak "Funkcionalna kontrola" iz ove metode.

1.6.1.4. Priprema ispitivanih rastvora

U posudu dodati: 500 ml vode koja se koristi za potrebe ispitivanja, 2,5 ml/l rastvora neorganskih nutrijenata i aktivni mulj u količini koja korespondira 0,2 do 1,0 g suve materije/l u krajnjoj smeši. Dodati dovoljnu količinu osnovnog rastvora ispitivane supstance tako da se uspostavi vrednost DOC 50 mg/ldo 400 mg/l u krajnjoj smeši. Korespondirajuće vrednosti za HPK su 100 mg/l do 1.000 mg/l. Dopuniti posudu sa vodom koja se koristi za potrebe ispitivanja do zapremine 1 L ili 4 L (u zavisnosti od zapremine posude). Zapremina rastvora zavisi od broja uzoraka potrebnih za određivanje vrednosti DOC ili HPK, kao i zapremina uzoraka potrebnih za analitička merenja.

Zapremina od 2 L može se smatrati zadovoljavajućom. Za svaku koncentraciju ispitivane supstance paralelno se postavi minimum jedna kontrola, koja sadrži samo aktivni mulj i rastvor neorganskih nutrijenata u jednakoj zapremini vode kao u ostalim posudama.

1.6.2. Izvođenje ispitivanja

Rastvori ispitivane supstance mešaju se na magetnoj mešalici ili mešalici sa lopaticom pod difuznim osvetljenjem ili u mračnoj komori na temperaturi 20° C do 25° C. Aeracija se obavlja pomoću komprimovanog vazduha koji se prečišćava pomoću staklene vune i pomoću špric-boce ukoliko se ukaže potreba. Potrebno je onemogućiti taloženje mulja i pad koncentracija kiseonika ispod 2 mg/l.

Vrednost pH se proverava u jednakim vremenskim intervalima (npr. dnevno) i da se po potrebi podesi na pH vrednosti od 7 ili 8.

Gubici usled isparavanja nadoknađuju se dodavanjem potrebne količine dejonizovane ili destilovane vode neposredno pre svakog uzimanja uzoraka. Poželjno je pre početka ispitivanja označiti nivo tečnosti u posudi. Nove oznake nivoa tečnosti stavljaju se na posudu nakon svakog uzimanja uzoraka (bez aeracijskog suvog mešanja). Prvi uzorci se uvek uzimaju tri sata nakon početka ispitivanja da bi se odredilo da li se ispitivana supstanca adsorbuje na aktivni mulj.

Razgradnja ispitivane supstance prati se određivanjem vrednosti DOC koje se radi svakodnevno ili u određenim redovnim vremenskim intervalima. Uzorci iz eksperimentalnih posuda i kontrolnih posuda filtriraju se kroz pažljivo opran filter papir. Prvih 5 ml filtrata rastvora se odbacuje. Aktivni mulj koji je teško filtrirati može se prethodno ukloniti centrifugiranjem 10 minuta. Određivanje vrednosti DOC ili HPK radi se najmanje u dva ponavljanja. Ispitivanje se izvodi u trajanju do 28 dana.

Napomena: Filtrati koji ostaju zamućeni dalje se filtriraju kroz membranske filtere. Membranski filteri ne smeju otpuštati ili adsorbovati nijednu vrstu organskog materijala.

Kontrola aktivnog mulja

Uporedo sa svakom serijom koncentracija ispitivane supstance postavlja se paralelno ispitivanje da bi se proverila aktivnost aktivnog mulja. Za ovu namenu se dietilenglikol pokazao korisnim.

Adaptacija

Ukoliko se merenja obavljaju u relativno kratkim intervalima (npr. svakodnevno), adaptiranost se može jasno uočiti iz krive razgradnje (videti Sliku 2). Ispitivanje ne treba započeti neposredno pred vikend.

Ako adaptiranost nastupi na kraju perioda, ispitivanje se može produžiti sve dok se ne završi razgradnja.

Napomena: Ako je potrebno znati više o ponašanju adaptiranog mulja, isti aktivni mulj se još jednom tretira istom ispitivanom supstancom u skladu sa postupkom:

Isključiti mešalicu i aerator i ostaviti da se aktivni mulj istaloži. Odstraniti supernatant, napuniti posudu do 2 L zapremine sa vodom, mešati 15 minuta i ponovno ostaviti mulj da se istaloži. Nakon što se supernatant ponovno odstrani, istaloženi mulj se ponovo tretira istom ispitivanom supstancom u skladu sa odeljcima 1.6.1.4. i 1.6.2. ove metode. Aktivni mulj se može istaložiti i centrifugiranjem.

Adaptirani mulj može da se meša sa svežim muljem do koncentracije 0,2 g do 1 g suve težine/l.

Oprema za analitička merenja

Uzorci se filtriraju kroz pažljivo oprani filter papir (za pranje se koristi dejonizovana voda).

Filtrati koji ostaju zamućeni filtriraju se kroz membranske filtere promera 0,45 μm.

Vrednost DOC određuje se u dva ponavljanja u filtratima uzoraka (prvih 5 ml se odbacuje) pomoću TOC instrumenta. Ako se filtrat ne može analizirati istog dana, čuvati ga u frižideru do sledećeg dana. Ne preporučuje se čuvanje materijala duže vreme.

HPK se određuje u filtratima uzorka prema postupku opisanom u literaturi2.

2. PODACI I PROCENA

Vrednost DOC, odnosno HPK se određuje najmanje u dva ponavljanja u uzorcima u skladu sa smernicama datim u odeljku 1.6.2. Razgradnja u vremenu t izračunava se prema formuli (sa definicijama) datim u odeljku 1.2.

Stepen razgradnje koji se dostigne na kraju ispitivanja se opisuje kao "biorazgradljivost u Zahn-Wellens ispitivanju".

Napomena: Ako se potpuna razgradnja dostigne pre kraja ispitivanja i ako se ovaj rezultat potvrdi i u drugom navratu narednog dana, ispitivanje se može prekinuti.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ako je moguće, sadrži:

- početnu koncentraciju ispitivane supstance;

- sve ostale podatke i rezultate ispitivanja supstance, referentne supstance (ukoliko je korišćena) i slepe probe;

- koncentraciju ispitivane supstance nakon tri sata;

- biorazgradnju (kriva sa opisom);

- datum i mesto gde su uzeti organizmi koji su korišćeni u ispitivanju, nivo adaptiranosti aktivnog mulja, korišćene koncentracije, itd;

- naučno utemeljene razloge za eventualne promene u izvođenju ispitivanja.

3.2. TUMAČENJE REZULTATA

Postepeno smanjenje vrednosti DOC (HPK) koje se registruje u toku nekoliko dana ili sedmica jeste pokazatelj da je ispitivana supstanca biorazgradljiva.

Na ispitivanje može da utiče fizičko-hemijska adsorpcija. To je slučaj kada se u toku prva tri sata ispitivanja, registruje potpuno ili delimično smanjenje vrednosti DOC (HPK), a razlika u nivou tečnosti između ispitivane grupe i kontrolne grupe ostaje neznatna.

Potrebno je izvesti dodatna ispitivanja za razgraničavanje procesa biorazgradnje (ili parcijalne biorazgradnje) od procesa adsorpcije. Najpouzdaniji način da se to uradi je da se u postavci ispitivanja (najbolje respirometrijsko ispitivanje), kao inokulum upotrebe supernatant ili mulj.

Supstance su potencijalno biorazgradljive, ako se u ispitivanju registruje značajno smanjenje vrednosti DOC (HPK) koje nije posledica adsorpcije. Delimično smanjenje vrednosti DOC (HPK), koje nije posledica adsorpcije, ukazuje na to da je ispitivana supstanca biorazgradljiva u određenoj meri. Neznatno ili nulta vrednost smanjenja DOC (HPK) može biti posledica inhibitornog delovanja ispitivane supstance na mikroorganizme, što se primećuje po zamućenju supernatanta. U tom slučaju ispitivanje ponoviti sa nižim koncentracijama ispitivane supstance.

Precizniji rezultati dobijaju se upotrebom najpodesnije analitičke metode. Kada se u ispitivanju koristi obeležavanje izotopom C14, obrazovanje C14O2 potvrđuje da je došlo do biorazgradnje ispitivane supstance.

Kad su rezultati prikazani u smislu primarne biorazgradnje, ako je moguće, objasniti promenu hemijske strukture koja uzrokuje smanjenje količine polazne supstance.

Potvrda analitičke metode prikazuje se zajedno sa odgovorom dobijenim sa slepom probom (samo medijum, bez aktivnog mulja).

4. LITERATURA

1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Decision of the COuncil C(81) 30 final.

2. Annex V C.9 Degradation: Chemical Oxygen Demand, COmmission Directive 84/449/EEC, (OJ L 251,19.9.1984, p. 1).

Deo drugi

PRIMER PROCENE

Organsko jedinjenje: 4-etoksibenzoeva kiselina

Teorijska koncentracija: 600 mg/l

Teorijska DOC vrednost: 390 mg/l

Inokulum postrojenje za obradu otpadne vode iz domaćinstava

Koncentracija: 1 g/l suve materije

Adaptiranost: nije adaptiran

Ispitivanje: određivanje DOC vrednosti

Količina uzorka: 3 ml

Kontrolna supstanca: dietilenglikol

Toksičnost jedinjenja: Nema toksičnog efekta u koncentraciji ispod 1.000 mg/l

Primenjeno ispitivanje: test fermentacije

Slika 1: Primer krive biorazgradnje

Slika 2: Primer adaptacije aktivnog mulja

C.10. BIORAZGRADNJA - ISPITIVANJE SIMULACIJE AKTIVNOG MULJA

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

1.1.1. Opšte napomene

Metoda se primenjuje samo na organske supstance u koncentracijama koje se koriste u ispitivanju:

- rastvorljive u vodi za pripremu rastvora;

- imaju neznatan napon pare u uslovima definisanim ovom metodom;

- ne deluju inhibitorno na bakterije.

Podaci o procentualnom udelu glavnih sastojaka ispitivane supstance korisni su za tumačenje dobijenih rezultata, posebno u slučajevima gde su vrednosti dobijenih rezultata niske ili ekstremne.

Poželjno je imati podatke o toksičnosti ispitivane supstance za tumačenje niskih dobijenih vrednosti i prilikom izbora odgovarajućih koncentracija za potrebe ispitivanja.

1.1.2. Određivanje potpune biorazgradljivosti
(DOC/HPK analiza)

Cilj metode je određivanje potpune biološke razgradljivosti što je određeno uklanjanjem ispitivane supstance i njenih metabolita iz sistema koji simulira postrojenje sa aktivnim muljem, pri koncentraciji koja odgovara vrednosti > 12 mg DOC/l (ili približno 40 mg HPK/l). Optimalnom vrednošću smatra se 20 mg DOC/l (DOC jeste koncentracija rastvorenog organskog ugljenika, HPK jeste hemijska potrošnja kiseonika).

Potrebno je utvrditi sadržaj organskog ugljenika (ili HPK) ispitivanog materijala.

1.1.3. Određivanje primarne biorazgradljivosti
(specifična analiza)

Cilj ove metode je određivanje primarne biorazgradljivosti ispitivane supstance u sistemu koji simulira postrojenje sa aktivnim muljem, pri koncentraciji ispitivane supstance od približno 20 mg/l, pomoću specifične analitičke metode (niža ili viša koncentracija ispitivane supstance može se koristiti ukoliko je moguće primeniti izabranu analitičku metodu i ukoliko ispitivana supstanca u datim koncentracijama ne ispoljava toksično dejstvo). Ova analiza omogućava procenu primarne biorazgradljivosti ispitivane supstance (nestanak polazne hemijske supstance).

Cilj metode nije određivanje mineralizacije ispitivane supstance.

Potrebno je da bude dostupna odgovarajuća analitička metoda za odabranu ispitivanu supstancu.

1.2. DEFINICIJE I MERNE JEDINICE

1.2.1. DOC/HPK analiza

Stepen uklanjanja ispitivane supstance se izračunava formulom:

pri čemu:

DR jeste stepen uklanjanja ispitivane supstance izražen u procentima DOC (ili HPK) nakon unapred određenog retencionog perioda;

T jeste koncentracija ispitivane supstance u influentu izražena u mg DOC/l (ili u mg HPK/l);

E jeste koncentracija DOC (ili HPK) u efluentu izražena u mg DOC/l (ili u mg HPK/l);

Eo jeste koncentracija DOC (ili HPK) u efluentu u kontroli izražena u mg DOC/l (ili u mg HPK/l).

Razgradnja jeste procenat smanjenja DOC (ili HPK) ispitivane supstance nakon unapred određenog retencionog perioda

1.2.2. Specifična analiza

Procenat uklanjanja ispitivane supstance iz vodene faze (Rw) nakon unapred određenog vremena retencije izračunava se formulom:

pri čemu:

CI jeste koncentracija ispitivane supstance u influentu sistema (izražena u mg/l, određeno specifičnom analizom);

Co jeste koncentracija ispitivane supstance u efluentu sistema (izražena u mg/l, određeno specifičnom analizom).

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Referentne supstance za ovu metodu ispitivanja nisu određene.

1.4. PRINCIP METODE ISPITIVANJA

Za određivanje potpune biorazgradljivosti, uporedo se izvode dva ispitivanja u dva sistema (OECD potvrdno ispitivanje ili ispitivanje sa poroznim posudama). Ispitivana supstanca dodaje se influentu jednog sistema (sintetička otpadna voda ili komunalna otpadna voda), dok se u drugi sistem uvodi samo influent. Za određivanje primarne biorazgradnje specifičnom analizom u influentu i efluentu, koristi se samo jedan sistem.

DOC (ili HPK) koncentracije mere se u efluentu ili se koncentracija ispitivane supstance određuje specifičnim analizama.

DOC iz ispitivanog materijala se ne meri, već se samo navede.

Kad se određuju vrednosti DOC (ili HPK) smatra se da razlika između srednje vrednosti koncentracija u efluentu u kontroli i efluentu u tretmanu potiče od nerazgrađene ispitivane supstance

Kad se izvode specifične analize, meri se promena u koncentraciji polazne supstance (primarna biorazgradljivost).

Sistemi mogu da se postave kao sistemi spojenih jedinica, uz proceduru transinokulacije.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Početna koncentracija ispitivane supstance zavisi od vrste primenjene analize i njenih ograničenja.

1.6. OPIS METODE ISPITIVANJA

1.6.1. Priprema

1.6.1.1. Oprema

Potrebno je raspolagati sa par sistema istog tipa, osim kad se izvode specifične analize. Koriste se dva tipa sistema:

OECD potvrdno ispitivanje

Oprema (videti Deo drugi ove metode) se sastoji od spremnika (A) za sintetičke otpadne vode, pumpe za doziranje (B), aeratora (C), separatora (D), pumpe za recirkulaciju aktivnog mulja (E) i kolektora za tretirani efluent (F).

Posude (A) i (F) su od stakla ili pogodnog plastičnog materijala, zapremine najmanje 24 L. Pumpa za doziranje (B) obezbeđuje stalan dotok sintetičkih otpadnih voda u aerator. Koristi se bilo koji pogodni sistem ako su obezbeđeni konstantan dotok i koncentracija. Tokom normalnog rada sistema otvor separatora (D) je pozicioniran tako da aerator primi zapreminu od 3 ispitivane smeše. Perforirani difuzer vazduha (G) je postavljen u aerator (C) na sredini konusnog dna. Količina vazduha koja se uduvava u aerator prati se pomoću merača protoka.

Pumpa za recirkulaciju aktivnog mulja (E) postavljena je tako da se aktivni mulj iz separatora neprekidno recirkuliše u posudu za aeraciju (C).

"Porozna posuda"

Porozna posuda je napravljena od ploča poroznog polietilena (2 mm debljine, maksimalni promer pore je 95 mm), koje su oblikovane u cilindre prečnika 14 cm sa konusnom bazom pod uglom od 45° (Deo drugi Slike 1 i 2). Porozna posuda nalazi se u nepropusnoj posudi od odgovarajuće plastike, prečnika 15 cm, sa otvorom na visini od 17,2 cm na cilindričnom delu, koji određuje zapreminu (3 L) u loncu. Čvrsti potporni prsten, napravljen od odgovarajuće plastike, postavljen je oko vrha unutrašnje posude, tako da između unutrašnje i spoljašnje posude postoji prostor od 0,5 cm.

Porozna posuda se može postaviti u vodeno kupatilo. U osnovi unutrašnje posude su postavljeni difuzeri koji obezbeđuju dotok vazduha.

Posude (A) i (E) su od stakla ili odgovarajuće plastike, zapremine najmanje 24 L. Pumpa za recirkulaciju aktivnog mulja (B) omogućava stalni tok sintetičke otpadne vode u aerator. Koristi se bilo koji pogodan sistem ako su obezbeđeni stalan dotok i koncentracija.

Treba imati rezervne unutrašnje porozne posude ukoliko u toku rada sistema dođe do zapušenja. Zapušene posude potapaju se u rastvor hipohlorita, a zatim se temeljno isperu vodom iz česme.

1.6.1.2. Filtracija

Koristi se oprema za membransku filtraciju i membranski filteri promera 0,45 mm. Vodi se računa da se ugljenik ne oslobađa iz membranskih filtera i da se ispitivana supstanca ne adsorbuje u toku filtracije.

1.6.1.3. Otpadna voda

Koristiti se pogodna sintetička ili komunalna otpadna voda.

Primer sintetičke otpadne vode

U jednom litru vode iz česme rastvori se:

- 160 mg peptona,

- 10 mg mesnog ekstrakta,

- 30 mg uree,

- 7 mg NaCl,

- 4 mg CaCl2×2H2O,

- 2 mg MgSO4×7H2O i

- 28 mg K2HPO4.

Komunalna otpadna voda

Uzima se otpadna voda koja se preliva iz primarnog taložnika iz postrojenja koja dominantno prerađuju komunalne otpadne vode.

1.6.1.4. Osnovni rastvor ispitivane supstance

Osnovni rastvor ispitivane supstance, npr. 1%, priprema se pre izvođenja ispitivanja. Koncentracija ispitivane supstance se definiše, kako bi se dodala odgovarajuća zapremina osnovnog rastvora u otpadnu vodu ili direktno u sistem.

1.6.1.5. Inokulum

Napomena: Kad se koristi komunalna otpadna voda, ne koristi se inokulum sa niskom koncentracijom bakterija, ali može da se koristi aktivni mulj.

Mogu se koristiti razni inokulumi. U ovoj metodi data su tri primera pogodnih inokuluma: inokulum iz sekundarnog efluenta, kompozitni i inokulum aktivnog mulja.

Inokulum iz sekundarnog efluenta

Inokulum se uzima iz sekundarnog efluenta zadovoljavajućeg kvaliteta prikupljenog iz postrojenja za obradu dominantno komunalnih otpadnih voda. Tokom perioda od uzimanja efluenta do njegove upotrebe, efluent se čuva u aerobnim uslovima. Za pripremu inokuluma, uzorak efluenta se filtrira kroz grubi filter, a prvih 200 ml se baca. Filtrat se čuva u aerobnim uslovima do upotrebe. Inokulum se upotrebljava isti dan po uzimanju uzorka sekundarnog efluenta. Za inokulaciju se koristi najmanje 3 ml efluenta.

Kompozitni inokulum

Za pripremu kompozitnog inokuluma koriste se tri parcijalna inokuluma:

1) inokulum iz sekundarnog efluenta;

2) inokulum iz zemljišta:

- 100 g baštenskog zemljišta (plodnog, ne sterilnog) suspenduje se u 1.000 ml nehlorisane vode za piće. (Zemljište sa izuzetno velikim udelom gline, peska ili humusa nije pogodno.) Nakon mešanja, suspenzija se ostavi 30 minuta da se istaloži. Supernatant se filtrira kroz grubi filter papir, a prvih 200 ml se baca. Filtrat se aeriše odmah sve do upotrebe. Inokulum se upotrebljava isti dan po uzorkovanju;

3) inokulum iz površinske vode:

- deo za kompozitni inokulum uzima se iz mezo-saprobne površinske vode. Uzorci se filtriraju kroz grubi papir, a prvih 200 ml se baca. Filtrat se čuva u aerobnim uslovima sve do upotrebe. Inokulum upotrebiti isti dan po uzorkovanju.

Kompozitni inokulum se uzima iz mešavine tri parcijalna inokuluma tako što se jednake zapremine sjedine i dobro promešaju. Za inokulaciju se upotrebljava najmanje 3 ml.

Inokulum aktivnog mulja

Uzima se najviše 3 L aktivnog mulja (sadržaj suspendovanih materija do 2,5 g/l) uzetog iz aeracionog bazena postrojenja za obradu dominantno komunalnih otpadnih voda.

1.6.2. Postupak

Ispitivanje se izvodi na sobnoj temperaturi, koja se održava između 18° C i 25° C.

Ispitivanje se može izvesti i na nižim temperaturama (do 10° C). Ako se supstanca razgrađuje, ne nastavlja se ispitivanje. Ako se supstanca ne razgrađuje, ispitivanje se obavlja na stalnoj temperaturi između 18° C i 25° C.

1.6.2.1. Period stabilizacije: obrazovanje mulja / stabilizacija sistema

Period rasta/stabilizacije mulja je period u toku kojeg koncentracija suspendovanih materija aktivnog mulja kao i rad sistema dostiže stabilno stanje u uslovima definisanim ovom metodom.

Period stabilizacije jeste period koji traje od trenutka uvođenja ispitivane supstance u sistem do trenutka kad proces uklanjanja supstance dostigne plato, (relativno konstantnu vrednost). Ovaj period ne sme biti duži od šest sedmica.

Period evaluacije traje tri sedmice i to od trenutka kad uklanjanje ispitivane supstance dosegne relativno stalnu i najčešće visoku vrednost. Za one supstance koje se u prvih šest sedmica slabo ili uopšte biološki ne razgrade, za period evaluacije se uzimaju naredne tri sedmice.

Na početku se inokulum pomešan sa influentom uvodi u sisteme potrebne za jedno ispitivanje.

Zatim se uključuje aerator (u slučaju kad se koristi sistem OECD potvrdnog ispitivanja), a uključi se i pumpa za recirkulaciju (E) aktivnog mulja) i pumpa za doziranje (B).

Influent bez ispitivane supstance prolazi kroz aerator (C) brzinom 1 litar na sat ili 0,5 litara na sat, što omogućava retenciono vreme od 3 sata odnosno 6 sati.

Stepen aeracije namestiti tako da se onemogući taloženje sadržaja u posudi (C), dok je sadržaj rastvorenog kiseonika najmanje 2 mg/l.

Stvaranje pene onemogućiti odgovarajućim sredstvima, ali samo ukoliko ne deluju ihibitorno na aktivni mulj.

Mulj koji se nakupi pri vrhu aeratora (C) (u slučaju sistema OECD potvrdnog ispitivanja pri dnu separatora (D) i u sistemu za recirkulaciju) struganjem ili na neki drugi odgovarajući način vratiti u suspenziju najmanje jednom dnevno, svaki dan.

Ako se mulj ne taloži, povećati njegovu gustinu dodavanjem 2 ml 5% rastvora gvožđe-hlorida. Ovaj postupak se po potrebi ponavlja.

Efluent se prikuplja u posudi (E ili F) u toku 20 do 24 sata, a uzorak se uzima nakon temeljnog mešanja. Posudu (E ili F) pažljivo očistiti.

Da bi se nadgledala i kontrolisala efikasnost postupka, mere se hemijska potrošnja kiseonika (HPK) ili rastvoreni organski uglenik (DOC) u filtratu nakupljenog efluenta najmanje dva puta sedmično, kao i u filtratu influenta (koristeći membrane promera 0,45 mm, a prvih 20 ml filtrata se baca).

Kad se uspostavi približno ujednačena dnevna razgradnja, smanjenje DOC ili HPK treba da bude ujednačeno.

Sadržaj suve materije aktivnog mulja (g/l) u aeratoru određuje se dvaput sedmično. Sistemi mogu raditi na jedan od dva načina:

1) sadržaj suve materije u aktivnom mulju određuje se dvaput sedmično, pa ukoliko ga ima više od 2,5 g/l višak aktivnog mulja se odbacuje, ili

2) svakodnevno se ispušta 500 ml ispitivane smeše iz svake posude da se dobije srednje vreme retencije mulja od 6 dana.

Kada su izmereni i procenjeni parametri dva sistema dovoljno stabilni (efikasnost uklanjanja DOC ili HPK, mulj, koncentracija, taloženje mulja, zamućenost efluenta, itd), ispitivana supstanca može se dodati influentu koji ulazi u jedan od sistema, kako je opisano u odeljku 1.6.2.2. ove metode.

Alternativno, ispitivana supstanca se može dodati na početku perioda rasta mulja (videti odeljak 1.6.2.1. ove metode), naročito kad se mulj dodaje kao inokulum.

1.6.2.2. Procedura ispitivanja

U periodu stabilizacije održavaju se konstantni uslovi rada sistema. Odgovarajuća količina rastvora ispitivane supstance (oko 1%) dodaje se u influent koji ulazi u sistem, tako da se dobije željena koncentracija ispitivane supstance (10 mg do 20 mg DOC/l ili 40 mg HPK/l) u influentu. To se može postići svakodnevnim mešanjem osnovnog rastvora ispitivane supstance sa influentom ili pomoću sekundarne pumpe. Željena koncentracija može se postići postepeno. Ukoliko ispitivana supstanca ne ispoljava toksično dejstvo na aktivni mulj, može se testirati i viša koncentracija.

U sistemu koji služi kao kontrola uvodi se samo influent bez ispitivane supstance. Odgovarajuće zapremine efluenta uzimaju se za analizu i filtriraju kroz membranske filtere (0,45 mm). Prvih (otprilike) 20 ml filtrata se baca.

Filtrirani uzorci se analiziraju istog dana; u suprotnom se čuvaju pogodnom metodom, npr. korišćenjem 0,05 ml 1% rastvora žive-hlorida (HgCl2) na svakih 10 ml filtrata ili čuvanjem na temperaturi od 2° C do 4° C, najviše 24 sata ili na temperaturi nižoj od -18°C u toku dužeg vremena.

Period stabilizacije, uz dodatak ispitivane supstance, ne sme trajati duže od 6 sedmica i period evaluacije ne sme biti kraći od 3 sedmice, odnosno za izračunavanje konačnog rezultata imati oko 14 do 20 rezultata merenja.

Izvođenje sa spojenim sistemima

Spojeni sistemi rade tako da jednom dnevno između dva sistema dolazi do razmene 1,5 L ispitivane smeše (uključujući mulj) iz aeratora za aktivni mulj. U slučaju da ispitivana supstanca podleže adsorpciji, uzima se 1,5 L tečnog supernatanta iz taložnika jednog sistema i presipa u posude sa aktivnim muljem drugog sistema.

1.6.2.3. Analiza

U cilju praćenja svojstava supstance vrše se dve vrste analiza: DOC i HPK.

Koncentracije DOC određuju se u dva ponavljanja pomoću analizatora ugljenika, odnosno vrednosti HPK prema literaturi2.

Specifična analiza

Koncentracije ispitivane supstance određuju se odgovarajućim analitičkim postupkom. Ukoliko je moguće, odrediti i količinu supstance koja se adsorbuje na aktivni mulj.

2. PODACI I PROCENA

2.1. SPOJENI SISTEMI

Kad se koriste spojeni sistemi, dnevni stepen uklanjanja (u daljem tekstu: DR) izračunava se na način opisan u odeljku 1.2.1. ove metode. DR se formulom (2) koriguje na DRc zbog prenosa ispitivane supstance na opisani način za srednje vreme retencije od 3 sata ili formulom (3) za srednje vreme retencije od 6 sati.

Izračunava se srednja vrednost i standardne devijacije za seriju vrednosti DRc prema jednačini (4):

(4)

pri čemu:

SDRc jeste standardna devijacija za niz DRc vrednosti;

DRDRc = srednja vrednost DRc;

n jeste broj određivanja.

Ekstremne vrednosti u nizu vrednosti DRc odbacuju se odgovarajućim statističkim postupkom, npr. Nalimovim postupkom6, uz nivo verovatnoće od 95%, pa se srednja vrednost i standardna devijacija ponovo izračunavaju za skup podataka DRc bez ekstremnih vrednosti.

Konačan rezultat izračunava se prema jednačini (5):

(5)

pri čemu:

tn-1;αs jeste tabelarna vrednost t za n vrednost parova E i Eo i statistička pouzdanost P (P = 1- a) i time je P na 95%1.

Rezultat se izražava kao srednja vrednost sa 95% intervalima poverenja, standardnim devijacijama i brojem podataka u skupu podataka DRc bez ekstremnih vrednosti, te brojem ekstremnih podataka, npr:

DRc = 98,6 ± 2,3% uklonjenog DOC;

c jeste 4,65% uklonjenog DOC;

n jeste 18;

x jeste broj ekstremnih vrednosti.

2.2. ODVOJENI SISTEMI

Rad sistema se može proveriti pomoću sledećeg izraza:

Ove vrednosti za dnevno uklanjanje DOC ili HPK mogu se prikazati grafički da bi se uočilo postojanje nekog trenda, npr. aklimatizacije.

2.2.1. Određivanje HPK/DOC

Kako se izračunava DR dato je u odeljku 1.2.1. ove metode.

Izračuna se srednja vrednost za serije vrednosti DR. Uz to se računa i standardna devijacija prema sledećem izrazu:

(6)

pri čemu:

SDR jeste standardna devijacija serije DRi vrednosti,

DR jeste srednja vrednost DRi vrednosti,

n jeste broj određivanja.

Ekstremne vrednosti u nizu vrednosti DRc se odbacuju odgovarajućim statističkim postupkom, npr. Nalimovim postupkom6, uz nivo verovatnoće od 95%, pa se srednja vrednost i standardna devijacija ponovo izračunavaju za skup podataka DRc bez ekstremnih vrednosti.

Konačan rezultat se zatim izračuna prema formuli (7) kao:

(7)

pri čemu:

tn-1;α jeste tabelarna vrednost t za n vrednost parova E i Eo i statistička pouzdanost P (P = 1- a) čime je P postavljen na 95%1.

Rezultat se izražava kao srednja vrednost sa 95% intervalima poverenja, standardnim devijacijama i brojem podataka u skupu DR bez ekstremnih vrednosti, te brojem ekstremnih vrednosti, npr:

DR jeste (98,6 ± 2,3)% uklonjenog DOC;

c jeste (4,65)% uklonjenog DOC;

n jeste 18;

x jeste broj odstupajućih vrednosti.

2.2.2. Primena specifične analize

Kako se izračunava procenat uklanjanja ispitivane supstance iz vodene faze (Rw) dato je u odeljku 1.2.2. ove metode.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj, ako je moguće, sadrži:

- obrazac dat u Delu četvrtom ove metode, sa opisanim uslovima u ispitivanju;

- odabrani sistem (OECD potvrdno ispitivanje ili "porozna posuda");

- odabrani način rada, spojeni sistem ili neki drugi;

- vrstu otpadnih voda: sintetičke ili komunalne otpadne vode (u slučaju komunalne otpadne vode navesti datum i mesto uzorkovanja);

- vrstu inokuluma, sa datumom i mestom uzorkovanja;

- opis primenjenog analitičkog postupka, ukoliko su se obavljale specifične analize;

- grafički prikaz vrednosti uklanjanja HPK ili DOC u funkciji vremena, uključujući period stabilizacije i period evaluacije;

- efikasnost analitičke metode za određivanja sadržaja ispitivane supstance preko vrednosti HPK ili DOC za osnovni rastvor ispitivane supstance;

- ukoliko su rađene specifične analize, grafički prikaz vrednosti procenta uklanjanja ispitivane supstance iz vodene faze u funkciji vremena (period stabilizacije i period evaluacije);

- srednja vrednost i standardna devijacija uklanjanja DOC ili HPK ispitivane supstance izračunavaju se iz podataka za period evaluacije, odnosno kad postoji ravnomerno uklanjanje ispitivane supstance ili period ustaljenog rada jedinica sistema;

- grafički prikaz koncentracije aktivnog mulja u funkciji vremena;

- sve napomene u vezi sa aktivnim muljem (odbacivanje suviška mulja, pojave agregacije, FeCl3 itd);

- koncentracije ispitivane supstance korišćene u ispitivanju;

- svi rezultati u vezi sa aktivnim muljem;

- svi podaci i rezultati ispitivanja u vezi sa ispitivanom i referentnim supstancama, ako su korišćene;

- naučno opravdani razlozi za eventualne izmene postupka ispitivanja.

3.2. TUMAČENJE REZULTATA

Nizak stepen uklanjanja ispitivane supstance iz vodene faze može biti posledica inhibitornog delovanje ispitivane supstance na mikroorganizame aktivnog mulja. Ovo se, takođe, može dokazati opažanjem lize ćelija mikroorganizama i gubitka mulja, što daje zamućeni supernatant, kao i smanjenja efikasnosti rada postrojenja u uklanjanju HPK (ili DOC).

Ponekad može imati uticaja fizičko-hemijska adsorpcija. Razlike između biološkog delovanja na molekul i fizičko-hemijske adsorpcije se mogu otkriti analizom mulja nakon odgovarajuće desorpcije.

Dodatna ispitivanja su potrebna ukoliko se žele razlučiti procesi biološke razgradnje (ili delimične biološke razgradnje) od adsorpcije.

To se može uraditi na nekoliko načina, ali najbolje je koristiti supernatant za inokulum u bazičnom ispitivanju (najbolje respirometrijsko ispitivanje).

Ako se primeti visok stepen uklanjanja DOC ili HPK, onda je to posledica biorazgradnje. Pri nižem stepenu uklanjanja, proces biorazgradnje ne može se razlikovati od procesa eliminacije. Na primer, ako jedinjenje rastvorljivo u vodi pokazuje visok stepen adsorpcije od 98%, a dnevna stopa potrošnje mulja veća je za 10%, moguća je eliminacija do 40%; pri višku stope potrošnje mulja od 30%, eliminacija zbog adsorpcije na suvišak mulja i uklanjanja zajedno sa tim suviškom mulja može narasti i na 65%4.

Kad se izvode specifične analize, obratiti pažnju na odnos strukture supstance i vrste analiza koje se rade. U ovom slučaju, uočeni fenomen ne može se protumačiti kao mineralizacija supstance.

4. LITERATURA

1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 303 A, Decision of the Council C(81) 30 final.

2. Annex V C9 Degradation Test - Chemical Oxygen Demand, Commission Directive 84/449/EEC, (OJ L251, 19.9.1984, p. 1).31.5.2008 EN Official Journal of the European Union L 142/553

3. Painter, H. A., King, E. F., WRC Porous-Pot method for assessing biodegradability, Technical Report TR70,June 1978, Water Research Centre, United Kingdom.

4. Wierich, P., Gerike, P., The fate of soluble, recalcitrant, and adsorbing Compounds in activated sludgeplants, Ecotoxicology and Environmental Safety, vol. 5, No 2, June 1981, p. 161-171.

5. Council Directives 82/242/EEC and 82/243/EEC, (OJ, No L 109, 22.4.1982, p. 1), amending CouncilDirectives 73/404/EEC and 73/405/EEC on biodegradability of detergents, (OJ L 347, 17.12.1973, p.51).

6. Streuli, H., Fehlerhafte Interpretation und Anwendung von Ausreßertests, insbesondere bei Ringversuchenzur Oberprüfung analytisch-chemischer Untersuchungsmethoden, Fresenius-Zeitschrift fürAnalytische Chemie, 303 (1980), p. 406-408.

Deo drugi

Deo treći

Slika 1. Oprema koja se koristi za procenu biorazgradljivosti

Slika 2. Shema trolitarske porozne posude za aeraciju

unutrašnji dijametar posude

Deo četvrti

USLOVI U ISPITIVANJU SIMULACIJE AKTIVNOG MULJA

C.11. BIORAZGRADNJA - ISPITIVANJE INHIBICIJE RESPIRACIJE AKTIVNOG MULJA

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Ovom metodom procenjuje se efekat ispitivane supstance (pri različitim koncentracijama) na mikroorganizme merenjem brzine respiracije u unapred definisanim uslovima.

Cilj metode je da se omogući brz skrining test kojim se identifikuju supstance koje mogu da imaju negativan uticaj na postrojenja za aerobno mikrobiološko prečišćavanje otpadnih voda i da se predlože smernice za izbor koncentracija ispitivane supstance za potrebe ispitivanja biorazgradljivosti.

Preliminarna studija može da se radi pre definitivnog ispitivanja. Ova studija daje podatke o opsegu koncentracija koje se koriste u definitivnom ispitivanju.

U postupak ispitivanja uključene su dve kontrole bez ispitivane supstance: jedna koja se postavlja na početku i druga na kraju, tj. nakon postavke svih serija koncentracija ispitivane supstance. Svaka kultura aktivnog mulja treba da se proveri ispitivanjem sa referentnom supstancom.

Metoda se najlakše primenjuje na supstance koje, zbog svoje rastvorljivosti u vodi i niske isparljivosti, obrazuju stabilne vodene rastvore.

Za supstance koje su slabo rastvorljive u medijumu koji se koristi za potrebe ovog ispitivanja nije uvek moguće odrediti vrednost EC50.

Rezultati koji se zasnivaju na potrošnji kiseonika mogu dovesti do pogrešnih zaključaka u slučaju kad ispitivana supstanca može da zaustavi oksidativnu fosforilaciju.

Za izvođenje ispitivanja poželjno je imati sledeće podatke o ispitivanoj supstanci:

- rastvorljivost u vodi;

- napon pare;

- strukturna formula;

- stepen čistoće ispitivane supstance.

Preporuka: Aktivni mulj može da sadrži potencijalno patogene organizme, pa je pri radu sa aktivnim muljem potreban oprez.

1.2. DEFINICIJE I MERNE JEDINICE

Brzina respiracije jeste potrošnja kiseonika mikroorganizama aktivnog mulja, koja se izražava kao mg O2 po mg mulja po satu.

Za izračunavanje inhibitornog efekta ispitivane supstance pri određenoj koncentraciji, brzina respiracije izražava se kao procenat srednje vrednosti brzine respiracije u dve kontrole:

	1 -			x 100 = % inhibicije
		2Rc
		Rc1 + Rc2

pri čemu:

Rc jeste brzina potrošnje kiseonika pri datoj koncentraciji ispitivane supstance;

Rc1 jeste brzina potrošnje kiseonika u kontroli 1;

Rc2 jeste brzina potrošnje kiseonika u kontroli 2.

U ovoj metodi EC50 jeste koncentracija ispitivane supstance pri kojoj brzina respiracije iznosi 50% u odnosu na brzine respiracije u kontroli pod uslovima definisanim za ovu metodu.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Kao referentna supstanca preporučuje se 3,5-dihlorofenol, supstanca koja je poznata kao inhibitor respiracije. Za proveru osetljivosti odrediti EC50 vrednost za ovu supstancu za svaku kulturu aktivnog mulja.

1.4. PRINCIP METODE

Brzina respiracije aktivnog mulja pomešanog sa standardnom količinom sintetičke otpadne vode meri se nakon kontakta od 30 minuta, tri sata ili u oba vremena. Brzina respiracije istog aktivnog mulja meri se nakon izlaganja različitim koncentracijama ispitivane supstance u identičnim uslovima. Inhibitorni efekat ispitivane supstance pri određenoj koncentraciji izražava se kao procenat srednje vrednosti brzine respiracije u odnosu na dve kontrole. Vrednost EC50 izračunava se iz rezultata za seriju koncentracija ispitivane supstance.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Rezultati ispitivanja su validni ako:

- vrednosti brzine respiracije u kontroli se razlikuju manje od 15%;

- EC50 (30 minuta, odnosno 3 sata) za 3,5-dihlorofenol se nalazi unutar prihvaćenog opsega od 5 do 30 mg/l.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Reagensi

1.6.1.1. Ispitivani rastvori

Na početku ispitivanja pripreme se sveži rastvori ispitivane supstance iz osnovnog rastvora. Osnovni rastvor ispitivane supstance od 0,5 g/l je odgovarajući ukoliko se ispitivanja izvode prema uputstvima datim u ovoj metodi.

1.6.1.2. Rastvor referentne supstance

Rastvor 3,5-dihlorofenola može se pripremiti, tako što se, npr. rastvori 0,5 g 3,5-dihlorofenola u 10 ml 1M NaOH, dopuni do otprilike 30 ml sa destiliovanom vodom, doda uz mešanje 0,5M H2SO4 sve dok se dođe do precipitacije - potrebno oko 8 ml 0,5M H2SO4 - i na kraju dopuni do jednog L sa destilovanom vodom. Vrednost pH treba da bude između 7 i 8.

1.6.1.3. Sintetičke otpadne vode

Sintetička otpadna voda se priprema rastvaranjem sledećih količina supstanci u 1 L vode:

- 16 g peptona;

- 11 g mesnog ekstrakta;

- 3 g uree;

- 0,7 g NaCl;

- 0,4 g CaCl2Í2H2O;

- 0,2 g MgSO4Í7H2O;

- 2,8 g K2HPO4.

Napomena 1: Ova sintetička otpadna voda je 100 puta koncentrovanija od otpadne vode opisane u literaturi9, uz dodatak dikalijum hidrogen fosfata.

Napomena 2: Ako se pripremljeni medijum ne koristi odmah, čuva se u mraku na na temperaturi od 0° C do 4° C, ne duže od jedne sedmice u uslovima koji obezbeđuju njegovu stabilnost. Medijum se pre skladištenja može i sterilizovati, ili se pepton i mesni ekstrakt mogu dodati neposredno pre izvođenja ispitivanja. Pre upotrebe, medijum se temeljno promeša i prilagodi vrednost pH.

1.6.2. Oprema

Aparatura za merenje: precizna postavka ispitivanja nije od presudne važnosti. Treba da postoji dovoljan slobodan prostor pri vrhu posude (headspace) i sonda čvrsto da prijanja uz vrat posude za merenje.

Potrebna je uobičajena laboratorijska oprema, a naročito:

- aparatura za merenje;

- aerator;

- pH-elektroda i oprema za merenje;

- O2-elektroda.

1.6.3. Priprema inokuluma

Aktivni mulj iz postrojenja za obradu dominantno komunalnih otpadnih voda koristi se kao mikrobiološki inokulum za potrebe ovog ispitivanja.

Ukoliko je potrebno, po povratku u laboratoriju, grube čestice se mogu ukloniti kratkotrajnim taloženjem, npr. 15 minuta, a zatim se dekantuje gornji sloj sa sitnijim česticama i koristi se za potrebe ispitivanja. Mulj se može promešati mikserom u trajanju od nekoliko sekundi.

Postoji sumnja da je prisutan materijal koji deluje inhibitorno, te se aktivni mulj ispere vodom iz česme ili izotoničnim rastvorom. Nakon centrifugiranja, supernatant se dekantuje (ovaj postupak se ponavlja tri puta).

Mala količina mulja se izmeri i osuši. Iz ovog rezultata može se izračunati količina vlažnog mulja koji je suspendovan u vodi da bi se dobio aktivni mulj sa koncentracijom čvrstih suspendovanih materija u opsegu od 2 g/l do 4 g/l. Ovaj nivo odgovara koncentraciji između 0,8 g/l i 1,6 g/l u medijumu ukoliko se ispitivanje izvodi prema smernicama.

Ako se mulj ne može upotrebiti istog dana, dodaje se 50 ml sintetičke otpadne vode u svaki litar aktivnog mulja pripremljenog na prethodno opisan način. Zatim se aktivni mulj aeriše preko noći na temperaturi od 20° C ± 2° C i aeriše se sve do ispitivanja. Pre izvođenja ispitivanja, proverava se pH vrednost i ukoliko je potrebno, podešava na 6 do 8 pH jedinica. Koncentracija suspendovanih čvrstih čestica u tečnoj smeši određuje se na način opisan u prethodnom paragrafu.

Ukoliko se koristi ista kultura aktivnog mulja za ispitivanja narednih dana (maksimalno četiri dana), dodati na 50 ml sintetičke otpadne vode po litru aktivnog mulja na kraju dana.

1.6.4. Izvođenje ispitivanja

Trajanje/kontaktno vreme: 30 minuta, odnosno 3 sata (neprekidna aeracija)

Voda: voda za piće (dehlorisana po potrebi)

Snabdevanje vazduhom: čist vazduh bez masnoća, dotok 0,5 L/min do 1 L/min

Aparatura za merenje: boce sa ravnim dnom, poput boca za određivanje BPK

Oksimetar: odgovarajuća elektroda za kiseonik, sa pisačem

Rastvor nutrijenata: sintetička otpadna voda

Ispitivana supstanca: sveže pripremljen rastvor supstance na početku ispitivanja

Referentna supstanca: npr. 3,5-dihlorofenol (ispituju se najmanje tri koncentracije)

Kontrole: inokuliran uzorak bez ispitivane supstance

Temperatura: 20° C ± 2° C

Za ispitivanje supstance i referentne supstance, u trajanju od 3 sata, predlaže se sledeći postupak:

- koristi se nekoliko posuda (npr. jednolitarske posude);

- ispituje se najmanje pet koncentracija ispitivane supstance, u geometrijskoj seriji sa faktorom povećanja 3,2;

- u nultom vremenu (t0) 16 ml sintentičke otpadne vode rastvori se sa vodom do 300 ml, doda se 200 ml mikrobiološkog inokuluma i dobijena smeša (500 ml) se presipa u prvu posudu (prva kontrola, K1);

- posude se neprekidno aerišu da bi se obezbedila koncentracija rastvorenog kiseonika iznad 2,5 mg/l i da bi neposredno pre merenja brzine respiracije, koncentracija rastvorenog kiseonika bila 6,5 mg/l;

- u vremenu t15 (15 minuta je arbitrarni, ali pogodan interval) ponovi se opisani postupak, s tim da se u 16 ml sintetičke otpadne vode doda 100 ml osnovnog rastvora ispitivane supstance, dopuni sa vodom do 300 ml i potom doda mikrobiološki inokulum do konačne zapremine od 500 ml. Dobijena smeša se presipa u drugu posudu i aeriše na isti način. Postupak se ponavlja svakih 15 minuta sa različitim zapreminama osnovnog rastvora ispitivane supstance, kako bi se dobio set posuda koje sadrže različite koncentracije ispitivane supstance. Na kraju se priprema druga kontrola (K2);

- nakon tri sata beleži se pH vrednost, a dobro promešani sadržaj iz prve posude presipa se u uređaj za merenje brzine respiracije u toku najviše 10 minuta;

- merenje se ponavlja sa sadržajem svake posude u intervalima od 15 minuta, kako bi vreme kontakta u svakoj posudi iznosilo 3 sata;

- referentna supstanca se na isti način ispituje na svakoj šarži mikrobiološkog inokuluma;

- primenjuje se drugačiji režim (npr. više od jednog oksimetra) u slučaju da se merenja vrše nakon 30 minuta;

- ako se meri hemijska potrošnja kiseonika, neophodno je pripremiti dodatne posude koje sadrže ispitivanu supstancu, sintetičke otpadne vode i običnu vodu, ali ne i aktivni mulj. Potrošnja kiseonika meri se i beleži nakon aeracije, tj. kontaktnog vremena.

2. PODACI I PROCENA

Brzina respiracije izračunava se sa krive između otprilike 6,5 mg/l O2 i 2,5 mg/l O2 ili u toku desetominutnog perioda kad je brzina respiracije niska. Deo krive respiracije iz koje se meri brzina respiracije da bude linearan.

Ako se vrednosti brzina respiracije u dve kontrole razlikuju za više od 15% ili EC50 (30 minuta, odnosno tri sata) za referentnu supstancu nije u okviru prihvaćenog opsega (5 mg/l do 30 mg/l za 3,5-dihlorofenol), ispitivanje nije validno i potrebno ga je ponoviti.

Procenat inhibicije izračunava se za svaku koncentraciju ispitivane supstance (videti odeljak 1.2. ove metode). Vrednosti procenta inhibicije za svaku koncentraciju ispitivane supstance predstavljaju se grafički u funkciji koncentracija na logaritmaskom (ili log-probit) papiru i očitava se EC50 vrednost.

Intervali poverenja od 95% za EC50 vrednosti mogu se odrediti pomoću standardnih postupaka.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju sadrži podatke o:

1) Ispitivanoj supstanci:

- podaci o hemijskoj identifikaciji;

2) Sistemu:

- izvor;

- koncentracija;

- predobrada aktivnog mulja (ako je rađena);

3) Uslovima ispitivanja:

- pH smeše pre merenja respiracije;

- temperatura;

- trajanje ispitivanja;

- referentna supstanca i izračunata vrednost EC50;

- abiotička potrošnja kiseonika (ukoliko postoji);

4) Rezultatima:

- svi rezultati merenja;

- kriva inhibicije i postupak za izračunavanje EC50;

- EC50 i, ako je moguće, 95% intervali poverenja, EC20 i EC80;

- sva opažanja i moguća odstupanja od ove metode ispitivanja koja mogu da utiču na rezultat.

3.2. TUMAČENJE REZULTATA

EC50 vrednost se smatra samo pokazateljem potencijalnog negativnog delovanja ispitivane supstance na proces obrade otpadne vode aktivnim muljem ili na mikroorganizme iz otpadne vode, s obzirom na to da se složene interakcije koje se događaju u životnoj sredini ne mogu verno simulirati u laboratorijskim uslovima. Rezultati ispitivanja sa supstancom koja može imati inhibitorni efekat na proces oksidacije amonijaka mogu dati atipične krive inhibicije. Stoga se ovi rezultati i ovakve krive tumače sa oprezom.

4. LITERATURA

1. International Standard ISO 8192-1986.

2. Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11,1977, p. 165.

3. Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, p. 245.

4. ETAD (ECOlogical and Tox.icological Association of Dyestuffs Manufacturing Industries), Recommended Method No 103, also described by:

5. Robra, B., Wasserl Abwasser 117, 1976, p. 80.

6. Schefer, W., Textilveredlung 6,1977, p. 247.

7. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decision of the Council C(84) 30 final.

8. OECD, June 11, 1976, Technical Report, 'Proposed method for the determination of the biodegradability of surfactants used in synthetic detergents'.

C.12. BIORAZGRADNJA - MODIFIKOVANA SCAS METODA ISPITIVANJA

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Cilj ove metode je procena mogućnosti potpune biorazgradljivosti neisparljivih, organskih materija dobro rastvorljivih u vodi, ako su izložene relativno visokim koncentracijama mikroorganizama u toku dužeg vremenskog perioda. Životna aktivnost mikroorganizama održava se u toku tog perioda svakodnevnim dodavanjem taloga komunalne otpadne vode za prehranu. (Tokom vikenda, otpadna voda može se čuvati na temperaturi od 4° C. Može se koristiti i sintetička otpadna voda OECD potvrdnog ispitivanja.)

Prilikom tumačenja rezultata uzeti u obzir mogućnost fizičko-hemijske adsorpcije na suspendovane materije (videti odeljak 3.2. ove metode).

Zbog dugog vremena zadržavanja tečne faze (36 sati) i diskontinualnog dodavanja nutrijenata, metoda ne simulira uslove kakvi postoje u postrojenju za prečišćavanje otpadnih voda. Rezultati ispitivanja sa različitim supstancama pokazuju da ova metoda ima veliki potencijal biorazgradljivosti.

Uslovi u ovom ispitivanju izrazito su povoljni za izbor, odnosno adaptaciju mikroorganizama sposobnih da razgrade ispitivano jedinjenje. (Postupak se može koristiti i za proizvodnju aklimatizovanih inokuluma za korišćenje u drugim ispitivanjima.)

Pomoću ove metode, potpuna biorazgradljivost ispitivanih supstanci procenjuje se na osnovu izmerene koncentracije rastvorenog organskog ugljenika. DOC je bolje odrediti nakon zakiseljavanja i čišćenja nego ga izračunati kao razliku C ukupni - C anorganski.

Istovremeno korišćenje specifičnog analitičkog postupka može da omogući procenu primarne biorazgradljivosti supstanci (nestanak početne hemijske strukture).

Postupak se može primeniti samo na organske supstance koje su, u koncentraciji primenjenoj u ispitivanju:

- rastvorljive u vodi (najmanje 20 mg/lDOC);

- imaju zanemarljiv napon para;

- nemaju inhibitorni efekat na bakterije;

- ne adsorbuju se u značajnoj meri unutar test sistema;

- ne gube se stvaranjem pene iz test rastvora.

Potrebno je utvrditi sadržaj organskog ugljenika u ispitivanom materijalu.

Podaci o relativnom udelu glavnih sastojaka ispitivanog materijala korisni su pri tumačenju dobijenih rezultata, posebno u slučajevima kad su dobijene vrednosti niske ili granične.

Podaci o toksičnosti supstanci za mikroorganizme mogu biti korisni u tumačenju niskih vrednost i izboru odgovarajuće ispitivane koncentracije.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE MERE

CT jeste koncentracija ispitivane supstance izražena kao organski ugljenik prisutan u ili dodat talogu otpadne vode na početku perioda aeracije (mg/l).

Ct jeste koncentracija rastvorenog organskog ugljenika u tečnom supernatantu iz ispitivane grupe na kraju perioda aeracije (mg/l).

Cc jeste koncentracija rastvorenog organskog ugljenika u tečnom supernatantu iz kontrole na kraju perioda aeracije (mg/l).

U ovoj metodi biorazgradljivost jeste nestanak organskog ugljenika. Biorazgradljivot se može izraziti kao:

Procenat razgradnje one količine supstance koja se svakodnevno dodaje - Dda (degradation/daily addition) računa se prema formuli:

Procenat razgradnje one količine supstance koja je prisutna na početku svakog dana -Dssd (degradation/substance start of day) računa se prema formuli:

Pokazatelji i i (i + 1) odnose se na dan merenja.

Jednačina 2(a) preporučuje se ako DOC u izlaznoj vodi (efluentu) varira svakodnevno, dok se jednačina 2(b) može koristiti kad DOC izlazne vode ima relativno stalne vrednosti.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Referentne supstance mogu biti od koristi kada se ispituje nova supstanca. Za ovu metodu nije preporučena neka određena referentna supstanca.

Podaci o nekoliko jedinjenja procenjenih u međulaboratorijskom ispitivanju (ringtest) ponuđeni su (videti Deo drugi ove metode) u cilju povremene kalibracije postupka i da se omogući poređenje rezultata dobijenih nekim drugim postupkom.

1.4. NAČELO METODE ISPITIVANJA

Aktivni mulj iz postrojenja za obradu otpadnih voda stavlja se u jedinicu za polukontinualnu obradu aktivnog mulja (u daljem tekstu: SCAS). Dodaju se ispitivana supstanca i talog komunalne otpadne vode. Ova mešavina se aeriše u toku 23 sata. Aeracija se nakon toga prekida, mešavina se ostavlja da se istaloži mulj, a tečni suprenatant se ukloni.

Preostali talog se meša sa narednom količinom ispitivanog jedinjenja i otpadne vode u aeracionoj komori i postupak se ponavlja na isti način.

Biorazgradljivost se utvrđuje određivanjem količine rastvorenog organskog ugljenika u tečnom supernatantu. Ova vrednost se poredi sa vrednošću izmerenom u tečnoj fazi iz kontrole, u koju je dodat samo talog otpadne vode.

Kada se koristi specifični analitički postupak, mogu se meriti promene u koncentraciji izvornog molekula izazvane biorazgradnjom (primarna biorazgradnja).

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Ponovljivost metode koja se bazira na uklanjanju rastvorenog organskog ugljenika nije utvrđena (kad se uzme u obzir primarna biorazgradljivost, dobiju se precizni podaci za materijale koji se dobro razgrađuju).

Osetljivost postupka zavisi od varijabilnosti slepe probe i u manjoj meri od preciznosti određivanja rastvorenog organskog ugljenika i koncentraciji test jedinjenja u tečnoj fazi na početku svakog ciklusa.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Priprema

Potreban je dovoljan broj čistih jedinica za aeraciju, alternativno se može koristiti originalna SCAS test jedinica zapremine 1,5 L i cevi za dovod vazduha (Slika 1) za svaku test supstancu i kontrole. Komprimovani vazduh pročišćen kroz vatu koji se dovodi u test jedinice ne sme da sadrži organski ugljenik i prethodno da bude zasićen vodom da se smanje gubici isparavanjem.

Uzorak tečne mešavine, koja sadrži od 1 g do 4 g suspendovanih materija po litru, dobija se iz postrojenja za obradu aktivnog mulja koje obrađuje pretežno komunalnu otpadnu vodu. Za svaku aeracionu jedinicu potrebno je oko 150 mg tečne mešavine.

Osnovni rastvori ispitivane supstance pripremaju se u destilovanoj vodi. Najčešće je potrebna koncentracija od 400 mg/l kao organski ugljenik, što daje koncentraciju ispitivane supstance od 20 mg/l ugljenika na početku svakog ciklusa aeracije, ako ne dolazi do biološke razgradnje.

Mogu se koristiti i više koncentracije ako ne uzrokuju toksičan efekat na mikroorganizme.

U osnovnom rastvoru meri se sadržaj organskog ugljenika.

1.6.2. Uslovi ispitivanja

Ispitivanje se izvodi na temperaturi od 20° C do 25° C.

Koristi se visoka koncentracija aerobnih mikroorganizama (najviše 1 g/l do 4 g/l suspendovanih materija), a delotvoran period zadržavanja je 36 sati. Materijal koji sadrži ugljenik u najvećoj meri se oksiduje u hranljivoj podlozi od otpadnih voda, obično unutar osam sati nakon početka svakog ciklusa aeracije. Nakon toga, mulj diše endogeno za vreme preostalog perioda aeracije, u toku kojeg je ispitivano jedinjenje jedini raspoloživi supstrat, osim u slučaju da se i ono brzo razgrađuje. Ova svojstva, u kombinaciji sa dnevnom reinokulacijom kad se kao podloga koristi komunalna otpadna voda, obezbeđuju povoljne uslove za aklimatizaciju i za visoki stepen biološke razgradnje.

1.6.3. Postupak

Uzima se uzorak tečne mešavine iz uređaja laboratorijskog tipa ili pogodnog postrojenja za obradu aktivnog mulja iz pretežno komunalne otpadne vode i čuva u aerobnim uslovima do korišćenja u laboratoriji. Svaka aeraciona jedinica kao i kontrolna jedinica pune se sa po 150 mg tečne mešavine (ako se koristi originalna SCAS test jedinica, ta se zapremina množi sa 10) i započinje se sa aeracijom. Nakon 23 sata, aeracija se prekida i mulj se ostavlja 45 minuta da se istaloži. Naizmenično se otvaraju slavine svake posude i izvlači se po 100 mg tečnog supernatanta. Uzorak istaložene komunalne otpadne vode uzima se neposredno pre upotrebe, a 100 mg se dodaje mulju koji je preostao u svakoj aeracionoj jedinici. Ponovo se započinje sa aeracijom. U ovoj fazi ne dodaje se ispitivani materijal, a u jedinice se svakodnevno dodaje komunalna otpadna voda sve dok se nakon taloženja ne dobije supernatant u obliku bistre tečnosti. Za to je obično potrebno dve nedelje, a do kraja tog perioda rastvoreni organski ugljenik u tečnom supernatantu na kraju svakog aeracionog ciklusa približava se konstantnoj vrednosti.

Na kraju ovog perioda, pojedini istaloženi muljevi se pomešaju i u svaku jedinicu se doda po 50 mg ovako pripremljenog kompozita.

U kontrolne jedinice dodaje se po 95 mg istaložene otpadne vode i 5 mg vode, a u ispitivane jedinice 95 mg istaložene otpadne vode i 5 mg odgovarajućeg osnovnog rastvora ispitivanog jedinjenja (400 mg/l). Ponovo se započinje sa aeracijom koja traje 23 sata. Mulj se zatim ostavi 45 minuta da se slegne, izvuče se supernatant i analizira se sadržaj rastvorenog organskog ugljenika.

Opisani postupak ponavlja se svakodnevno u toku trajanja ispitivanja.

Pre taloženja, potrebno je očistiti čestice koje su se nakupile na zidovima jedinica iznad nivoa tečnosti. Za čišćenje svake jedinice koristiti posebnu strugalicu ili četku da se spreči međusobna kontaminacija.

U idealnom slučaju, rastvoreni organski ugljenik u tečnom supernatantu određuje se svakog dana, ali analize mogu biti i ređe. Tečnosti se pre analize filtriraju kroz isprane membranske filtere od 0,45 µm ili se centrifugiraju. Odgovarajući membranski filteri su oni koji ne otpuštaju ugljenik niti apsorbuju supstance u toku filtracije. Temperatura uzorka za vreme centrifugiranja ne sme biti veća od 40° C.

Dužina ispitivanja za jedinjenja koja se slabo ili uopšte biološki ne razgrađuju nije određena, ali na osnovu iskustva, treba da bude najmanje 12, a najviše 26 nedelja.

2. PODACI I PROCENA

Vrednosti rastvorenog organskog ugljenika u tečnom supernatantu ispitivanih i kontrolnih jedinica grafički se prikazuju u funkciji vremena.

Kad se postigne biološka razgradnja, nivo te razgradnje u ispitivanim jedinicama približava se nivou razgradnje u kontrolnim jedinicama. Kad se razlika između dva nivoa u tri uzastopna merenja ustali, broj daljih merenja treba da bude dovoljan da omogući statističku obradu podataka i izračunavanje procenata biološke razgradnje (Dda ili Dssd, videti odeljak 1.2. ove metode).

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ako je moguće, sadrži:

- sve podatke o vrsti otpadne vode, tipu upotrebljene jedinice i rezultatima koji se tiču ispitivane supstance, referentne supstance - ako je korišćena, i slepe probe;

- temperaturu;

- krivu uklanjanja sa opisom, način izračunavanja (videti odeljak 1.2. ove metode);

- datum i mesto gde su uzeti uzorci aktivnog mulja i otpadne vode, status adaptacije, koncentracija, itd;

- naučno utemeljene razloge za moguće izmene ispitivanja postupka;

- potpis i datum.

3.2. TUMAČENJE REZULTATA

Supstanca koja se ispituje ovom metodom nije biološki lako razgradljiva, te se do uklanjanja DOC izazvanog jedino biološkom razgradnjom dolazi postepeno u toku više dana ili nedelja, osim u slučaju kad naglo nastupi aklimatizacija na šta ukazuje nagli nestanak nakon nekoliko nedelja.

Fizičko-hemijska adsorpcija je nekada važna, što se vidi iz potpunog ili delimičnog uklanjanja dodatog DOC na početku ispitivanja. Ono što se dogodi nakon toga zavisi od faktora kao što je stepen adsorpcije i koncentracija suspendovanih materija u odbačenom efluentu. Obično se početno niska razlika između koncentracije DOC u kontrolnim i ispitivanim tečnim supernatantima postupno povećava i zatim se zadržava na novoj vrednosti do kraja ispitivanja, osim u slučaju aklimatizacije.

Ako se biorazgradljivost (ili delimična biorazgradljivost) želi razlikovati od adsorpcije, potrebno je sprovesti dodatna ispitivanja. Najbolje je za ovo koristiti tečni supernatant ili mulj kao inokulum u osnovnom eksperimentu (najbolje je uraditi respirometrijsko ispitivanje).

Kad se u ovom ispitivanju dobije visok stepen uklanjanja DOC bez adsorpcije, ispitivana supstanca se smatra potencijalno biorazgradljivom. Delimično neadsorptivno uklanjanje ukazuje na delimičnu biorazgradljivost ispitivane supstance.

Ako je uklanjanje DOC nisko ili do njega ne dolazi, uzrok može biti inhibitorno dejstvo ispitivane supstance na mikroorganizame. To se može otkriti lizom i gubitkom mulja, što daje zamućen supernatant. Ispitivanje ponoviti pomoću nižih koncentracija ispitivane supstance.

Upotreba posebnog analitičkog postupka ili ispitivane supstance obeležene izotopom ugljenika C14 može povećati osetljivost.

Ako se koriste ispitivana jedinjenja označena sa C14, pronalazak C14 potvrđuje da je došlo do biorazgradnje.

Kad se rezultati prikazuju na osnovu primarne biorazgradnje, dati objašnjenje o promeni hemijske strukture koja dovodi do gubitka odgovora izvorne ispitivane supstance.

Validacija analitičkog postupka daje se zajedno sa odgovorom dobijenim na ispitnoj podlozi koja je služila kao slepa proba.

4. LITERATURA

1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 A, Decision of the Council C(81) 30 final.

Deo drugi

SCAS METODA ISPITIVANJA: PRIMER REZULTATA

Deo treći

PRIMER OPREME ZA ISPITIVANJE

C.13. BIOKONCENTRACIJA: ISPITIVANJE NA RIBAMA U PROTOČNOM SISTEMU

Deo prvi

1. METODA ISPITIVANJA

Metoda se zasniva na Uputstvu za ispitivanje OECD 305 (1996).

1.1. UVOD

Ovom metodom ispitivanja određuje se potencijal biokoncentracije ispitivane supstance u ribama kada se one drže u protočnom sistemu. Iako je protočni sistem najpogodniji, ispitivanje se može izvesti i u polustatičnom sistemu pod uslovom da su zadovoljeni kriterijumi kvaliteta.

U metodi su date precizne instrukcije za izvođenje ispitivanja, ali se dozvoljavaju modifikacije postupka ispitivanja u zavisnosti od laboratorijskih uslova, odnosno svojstava ispitivane supstanci. Metoda je namenjena za ispitivanje stabilnih organskih supstanci sa vrednostima log Pow između 1,5 i 6,01, ali se mogu ispitivati i superlipofilne supstance (koje imaju vrednost log Pow > 6,0). Preliminarna procena faktora biokoncentracije (bioconcentration factor, u daljem tekstu: BCF), koji se ponekad označava sa KB, za takve superlipofilne supstance je veća od vrednosti faktora biokoncentracije u ravnotežnom do kojih se dolazi izvođenjem laboratorijskih ispitivanja. Preliminarne procene stanju (steady-state bioconcentration factor, u daljem tekstu: BCFSS) faktora biokoncentracije za organske supstance sa visokim vrednostima log Pow čak do 9,0 mogu se dobiti pomoću jednačine2. Parametri koji određuju biokoncentracioni potencijal uključuju konstantu brzine unosa (k1), konstantu brzine eliminacije (k2) i faktor biokoncentracije u ravnotežnom stanju BCFSS.

Ispitivanje sa obeleženim ispitivanim supstancama može olakšati analizu uzoraka vode i uzoraka tkiva ribe, ali može i pomoći u planiranju sledećih koraka - da li je potrebno identifikovati i kvantifikovati produkte razgradnje. Ukoliko se mere ukupni radioaktivni rezidijumi (npr. sagorevanjem ili rastvaranjem tkiva), BCF se odnosi na polaznu supstancu, preostale metabolite, kao i asimilirani ugljenik. Faktori biokoncentracije koji se baziraju na ukupnim radioaktivnim rezidijumima ne mogu se direktno porediti sa faktorima biokoncentracije koji su dobijeni specifičnim hemijskim analizama samo za polaznu supstancu.

Postupci čišćenja mogu se iskoristiti u ispitivanjima sa radioobeleženim supstancama da bi se odredila vrednost BCF za polaznu supstancu, a po potrebi se mogu okarakterisati i glavni metaboliti. Moguće je kombinovati studije proučavanja metabolizma riba i ispitivanja biokoncentracije putem analize i identifikacije rezidiuma u tkivima.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE MERE

Biokoncentracija/bioakumulacija jeste povećanje koncentracije ispitivane supstance u ili na organizmu (ili određenim tkivima) u odnosu na koncentraciju ispitivane supstance u odgovarajućem medijumu.

Faktor biokoncentracije (BCF ili KB) jeste odnos koncentracije ispitivane supstance u ili na ribi, ili određenim tkivima ribe (Cf se izražava u mg/g (ppm)) i koncentracije te supstance u okružujućem medijumu (Cw se izražava u μg/ml (ppm)), u bilo kom trenutku faze unosa tokom ispitivanja akumulacije supstance.

Faktor biokoncentracije u ravnotežnom stanju (BCFSS ili KB) se ne menja značajno u toku dužeg vremenskog perioda. Koncentracija ispitivane supstance u medijumu u toku ovog perioda je stalna.

Plato ili ravnotežno stanje se uočava kod grafičkog prikaza koncentracije ispitivane supstance u ribi (Cf) u funckiji vremena kao ravna linija paralelna sa x-osom. Ravnotežnim stanjem se smatra kada se rezultati tri uzastopna merenja koncentracije ispitivane supstance Cf u uzorcima uzetim u intervalima od najmanje dva dana međusobno razlikuju do ± 20% i kad ne postoje značajne razlike između tri perioda uzorkovanja. Kad se analiziraju združeni uzorci potrebno je uraditi najmanje četiri uzastopne analize. Za ispitivane supstance koje sporo usvajaju, pogodniji su intervali od sedam dana.

Faktor biokoncentracije koji se izračunava direktno preko vrednosti konstanti brzine unosa i eliminacije (k1/k2) jeste kinetički faktor biokoncentracije (u daljem tekstu: BCFK).

Koeficijent raspodele u sistemu n-oktanol/voda (Pow) jeste odnos vrednosti za rastvorljivost hemijske supstance u n-oktanolu i vrednosti za rastvorljivost u vodi u ravnotežnom stanju (Metoda A.8. koja je data u ovom pravilniku). Logaritam od Pow koristi se kao indikator biokoncentracionog potencijala hemijske supstance u akvatičnim organizmima.

Faza izloženosti ili unosa jeste vreme u toku kojeg je riba izložena ispitivanoj supstanci.

Konstanta brzine unosa (k1) jeste numerička vrednost kojom se definiše stepen porasta koncentracije ispitivane supstance u/na ribi (ili određenim tkivima ribe) kad je riba izložena datoj supstanci (k1 se izražava u dan-1).

Faza post-izloženosti ili faza eliminacije jeste period u kome dolazi do smanjenja (ili potpune eliminacije) ispitivane supstance iz jedinki (ribe) (ili određenog tkiva te ribe), a nastupa nakon premeštanja jedinki iz medijuma u čist medijum (tj. medijum koji ne sadrži ispitivanu supstancu).

Konstanta brzine eliminacije (k2) jeste numerička vrednost kojom se definiše stepen smanjenja koncentracije ispitivane supstance u jedinci (riba) (ili određenim tkivima te ribe) nakon transfera jedinki iz medijuma u čist medijum (k2 se izražava kao dan-1).

1.3. PRINCIP METODE ISPITIVANJA

Ispitivanje se sastoji iz dve faze: faze izloženosti (unosa) i faze post-izloženosti (eliminacije). Tokom faze unosa, pojedinačne grupe riba iste vrste izložene su ispitivanoj supstanci u najmanje dve koncentracije. Ribe se zatim prenose u čist medijum i nastupa faza eliminacije. Faza eliminacije je neophodna, osim ukoliko je unos ispitivane supstance u toku faze unosa bio neznatan (npr. BCF manji od 10). Koncentracija ispitivane supstance u ili na ribi (ili određenim tkivima ribe) se prati u toku obe faze ispitivanja. Uz dve koncentracije ispitivane supstance (dve ispitivane grupe), postavlja se i kontrola sa jedinkama riba u uslovima identičnim onima u ispitivanim grupama, osim što kod kontrole jedinke nisu izložene ispitivanoj supstanci. Na taj način se uočeni negativni efekti u ispitivanim grupama mogu pripisati isključivo delovanju ispitivane supstance.

Faza unosa traje 28 dana, osim u slučaju kad se ravnotežno stanje uspostavi ranije. Trajanje faze unosa i vreme do postizanja ravnotežnog stanja može se predvideti pomoću jednačine iz Dela trećeg ove metode. Nakon toga započinje faza eliminacije: jedinke riba se premeštaju u drugi čisti akvarijum sa istim medijumom, ali bez ispitivane supstance. Kad je moguće, BCF izračunati i kao BCFSS, tj. kao odnos koncentracije supstance u ribi (Cf) i njene koncentracije u vodi (Cw) pri uočenom ravnotežnom stanju i kao BCFK, tj. odnos vrednosti konstanti brzine unosa (k1) i eliminacije (k2), ukoliko se proces može opisati kao kinetika prvog reda. Ukoliko se proces ne može opisati kao kinetika prvog reda, upotrebiti složenije modele (videti Deo šesti ove metode).

Ako se ravnotežno stanje ne postigne u roku od 28 dana, faza unosa se produžava do trenutka uspostavljanja ravnoteže ili najviše do 60 dana, kada se započinje sa fazom eliminacije.

Vrednosti za konstantu brzine unosa, konstantu brzine eliminacije (gubitka) (ili više konstanti, kad su uključeni složeniji modeli), faktor biokoncentracije i gde je to moguće, intervali poverenja za svaki od ovih parametara izračunavaju se iz modela koji najbolje opisuje izmerene koncentracije ispitivane supstance u ribi i vodi.

BCF se izražava u funkciji ukupne sveže težine ribe. U posebnim slučajevima mogu se koristiti određena tkiva ili organi (npr. mišići, jetra) ako je riba dovoljno velika ili se može podeliti u jestive (fileti) i nejestive delove (unutrašnji organi). Za mnoge organske supstance postoji jasna veza između biokoncentracionog potencijala i lipofilnosti, te postoji i odgovarajući odnos između sadržaja lipida u jedinkama ribe i uočene biokoncentracije tih supstanci. Da se smanji ovaj izvor varijabilnosti rezultata ispitivanja za supstance sa izraženom lipofilnošću (odnosno sa log Pow> 3), biokoncentraciju izraziti u odnosu na ukupnu težinu jedinke i u odnosu na sadržaj lipida u organizmu.

Kad je moguće, sadržaj lipida odrediti na istom biološkom materijalu u kojem se meri koncentracija ispitivane supstance.

1.4. PODACI O ISPITIVANOJ SUPSTANCI

Pre izvođenja ispitivanja biokoncentracije, imati sledeće podatke o ispitivanoj supstanci:

- rastvorljivost u vodi;

- koeficijent raspodele u sistemu n-oktanol/voda, Pow (označava se i sa Kow, određuje se HPLC metodom opisanom u Metodi A.8);

- hidroliza;

- fototransformacija u vodi pod prirodnim ili veštačkim osvetljenjem i u uslovima osvetljenja koji su definisani ovom metodom3;

- površinski napon (odnosno za supstance gde se log Pow ne može odrediti);

- napon pare;

- brza biološka razgradljivost (ako je odgovarajuće).

Ostali potrebni podaci uključuju toksičnost ispitivane supstance za izabranu vrstu ribe koja se koristi u ispitivanju, ako je moguće asimptotska LC50 (odnosno nezavisna od vremena). Na raspolaganju imati odgovarajuću analitičku metodu poznate tačnosti, preciznosti i osetljivosti za kvantifikaciju ispitivane supstance u rastvorima i u biološkom materijalu, kao i podatke o pripremi i čuvanju uzorka. Potrebno je da bude poznat limit detekcije ispitivane supstance kako u vodi, tako i u ribljim tkivima. Ako se koristi ispitivana supstanca obeležena sa izotopom ugljenika C14, znati i procenat radioaktivnosti koji se pripisuje nečistoćama.

1.5. VALIDNOST ISPITIVANJA

Da bi se ispitivanje smatralo validnim potrebno je da budu ispunjeni uslovi:

- variranje temperature manje od ± 2° C;

- saturacija kiseonika veća od 60%;

- koncentracija ispitivane supstance u posudama (akvarijumima) održava se unutar ± 20% srednje vrednosti izmerene u toku faze unosa;

- smrtnost ili drugi štetni efekti/bolesti uočeni kod jedinki u kontroli i ispitivanim grupama da bude manja od 10% na kraju ispitivanja. Kad je ispitivanje produženo na nekoliko sedmica ili meseci, smrtnost ili drugi štetni efekti u kontroli i ispitivanim grupama treba da budu manji od 5% mesečno i da ne premašuju ukupno 30% u toku trajanja celog ispitivanja.

1.6. REFERENTNE SUPSTANCE

Ispitivanje referentnih supstanci za koje se raspolaže podacima o biokoncentracionom potencijalu može biti korisno za proveru procedure ispitivanja. Nisu preporučene određene referentne supstance.

1.7. OPIS METODE

1.7.1. Oprema

Svaki deo opreme je napravljen od inertnog materijala koji ne utiče štetno na jedinke koje se koriste u ispitivanju. Mogu se koristiti standardni pravougaoni ili cilindrični akvarijumi, napravljeni od hemijski internog materijala i odgovarajuće zapremine koji odgovara dinamici nasada. Upotrebu mekih plastičnih cevi svesti na najmanju moguću meru. Prednost se daje teflonu, nerđajućem čeliku, odnosno staklenim cevima. Iskustvo je pokazalo da za supstance sa visokim koeficijentima adsorpcije, kao što su sintetički piretroidi, koristiti silanizirano staklo. Oprema se, u ovom slučaju, nakon upotrebe baca.

1.7.2. Voda

Uobičajeno se koristi obična voda, koja se dobija iz nekontaminiranog izvora sa ujednačenim kvalitetom. Kvalitet vode za razblaživanje je takav da za vreme trajanja perioda aklimatizacije i perioda ispitivanja omogući preživljavanje odabrane vrste riba i da ne izaziva negativne promene u izgledu i ponašanju jedinki. U idealnom slučaju, pokazuje se da izabrana vrsta ribe može da preživi, raste i razmnožava se u vodi za razblaživanje (npr. u laboratorijskoj kulturi ili u toku ispitivanja toksičnosti). U opisu kvaliteta vode navesti pH vrednost, tvrdoću, ukupne suspendovane materije, ukupan organski ugljenik. Poželjno je navesti i sadržaj amonijaka, nitrita i alkalitet, a za morske vrste i salinitet. Parametri potrebni za optimalan rast i razvoj riba potpuno su poznati i u Delu drugom ove metode date su preporučene maksimalne koncentracije seta parametara za slatku i morsku vodu koja se koristi u ispitivanju.

Tokom trajanja ispitivanja, voda je ujednačenog kvaliteta. Vrednost pH je između 6,0 i 8,5 i u toku ispitivanja se održava unutar opsega od ± 0,5. Da bi se osiguralo da voda za razblaživanje neće uticati na rezultate ispitivanja (npr. kompleksiranjem ispitivane supstance) ili da neće štetno uticati na jedinke odabrane vrste riba, potrebno je periodično uzimati uzorke vode za analizu. Mere se koncentracije teških metala (npr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), glavnih anjona i katjona (npr. Cu, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticida (npr. ukupne organofosforne i ukupne organohlorne pesticide), ukupnog organskog ugljenika i suspendvanih materija, npr. na svaka tri meseca ako se zna da je voda za razblaživanje relativno ujednačenog kvaliteta. Ako se utvrdi da je kvalitet vode ujednačen u toku najmanje godinu dana, provera kvaliteta može biti ređa, a intervali duži (npr. svakih 6 meseci).

Sadržaj prirodnih materija kao i ukupni organski ugljenik (u daljem tekstu: TOC) u vodi za razblaživanje treba da bude što manji da bi se izbegla adsorpcija ispitivane supstance na organsku materiju što može smanjiti biodostupnost supstance4. Maksimalna prihvatljiva vrednost za suspendovane materije je 5 mg/l (suve materije, ne prolazi filter od 0,45 mm) i za ukupni organski ugljenik 2 mg/l (videti Deo drugi ove metode). Voda se, po potrebi, filtrira pre upotrebe. Ekskreti jedinki, kao i ostaci hrane doprinose ukupnom sadržaju organskog ugljenika, pa ih svesti na minimalnu meru. Tokom čitavog perioda ispitivanja, koncentracija organskog ugljenika u akvarijumu ne treba da bude veća od koncentracije organskog ugljenika koja potiče od ispitivane supstance. Koncentracija rastvarača, ukoliko se koristi u ispitivanju, ne sme da bude veća od 10 mg/l (± 20%).

1.7.3. Ispitivani rastvori

Osnovni rastvor ispitivane supstance priprema se u odgovarajućoj koncentraciji. Osnovni rastvor se priprema mešanjem ili mućkanjem ispitivane supstance u vodi za razblaživanje. Ne preporučuje se upotreba rastvarača ili disperzionih sredstava. Nekada je neophodna upotreba ovih sredstava radi dobijanja osnovnih rastvora ispitivane supstance željene koncentracije. Rastvarači koji se mogu koristiti su etanol, metanol, etilenglikol monometil eter, etilenglikol dimetil eter, dimetilformamid i trietilen glikol. Disperziona sredstva koja se mogu koristiti su Cremophor RH40, Tween 80, metilceluloza 0,01% i HCO-40. Mere opreza uzeti u obzir kad se koriste brzo biološki razgradljiva disperziona sredstva, jer mogu prouzrokovati probleme sa rastom bakterija u ispitivanju u protočnim uslovima. Ispitivana supstanca može se označiti radioaktivnim izotopom i treba da bude najvišeg stepena čistoće (ako je moguće > 98%).

Za ispitivanje u protočnim uslovima potreban je sistem sa dispenzorom i diluterom rastvora ispitivane supstance (npr. pumpa sa meračem, sistem za proporcionalno razblaživanje, sistem za zasićenje) da bi se u akvarijumima održavala konstantna koncentracija te supstance. Poželjno je da se najmanje pet puta u toku dana izmeni celokupna zapremina akvarijuma. Prednost se daje ispitivanju u protočnim uslovima, ali u slučajevima gde to nije moguće (npr. kad postoje štetni efekti na organizme koje se koriste u ispitivanju) može se izvoditi i ispitivanje u semi-statičkim uslovima, ako su zadovoljeni kriterijumi validnosti. Protok osnovnog rastvora ispitivane supstance i vode za razblaživanje proverava se 48 sati pre početka i zatim najmanje jedanput dnevno u toku ispitivanja. Ova provera uključuje određivanje protoka u svakom akvarijumu i protok ne sme da varira više od 20% u jednom akvarijumu, kao i između akvarijuma.

1.7.4. Izbor vrsta za potrebe ispitivanja

Kriterijumi za izbor vrste riba su da su lako dostupne, da se mogu dobiti u odgovarajućim veličinama i da se mogu na zadovoljavajući način uzgajati u laboratoriji. Drugi kriterijumi za izbor vrste uključuju njenu komercijalnu, rekreacionu i ekološku važnost, kao i mogućnost poređenja osetljivosti sa drugim vrstama, prethodnu uspešnu upotrebu u ispitivanjima, itd.

Preporučene vrste za potrebe ove metode navedene su Delu drugom ove metode. Mogu se koristiti i druge vrste, ali u tom slučaju modifikovati metodu ispitivanja kako bi se obezbedili pogodni uslovi. U izveštaju se daje objašnjenje za izbor vrste i metode ispitivanja.

1.7.5. Gajenje riba

Aklimatizacija matičnog jata riba traje najmanje dve sedmice u vodi pri temperaturnom režimu i režimu ishrane definisanim za samo ispitivanje.

Nakon perioda aklimatizacije od 48 sati, uočava se smrtnost i primenjuju sledeći kriterijumi:

- ako je smrtnost veća od 10% populacije u sedam dana, celo matično jato se odbacuje;

- ako je smrtnost između 5% i 10% populacije u sedam dana, matično jato se aklimatizuje još sedam dana;

- ako je smrtnost manja od 5% populacije u sedam dana, matično jato se prihvata;

- ako je smrtnost iznad 5% u narednih 5 dana, celo jato se odbacuje.

Treba voditi računa da jedinke ribe koje se koriste u ispitivanju nemaju vidljivih bolesti i abnormalnosti. Svaka obolela jedinka isključuje se iz ispitivanja. Jedinke se ne smeju lečiti dve sedmice pre početka ispitivanja, kao niti za vreme samog ispitivanja.

1.8. IZVOĐENJE ISPITIVANJA

1.8.1. Preliminarno ispitivanje

Poželjno je izvesti preliminarno ispitivanje kako bi se postavili optimalni uslovi za konačno ispitivanje, npr. izbor ispitivanih koncentracija supstance, trajanje faza unosa i eliminacije.

1.8.2. Uslovi izloženosti

1.8.2.1. Trajanje faze unosa

Trajanja faze unosa može se predvideti na osnovu iskustva (npr. iz prethodnog ispitivanja, ili rezultata ispitivanja sa supstancom sličnog potencijala za akumulaciju) ili određenih empirijskih odnosa na osnovu poznavanja ili rastvorljivosti u vodi ili koeficijenta raspodele u sistemun-oktanol/voda za ispitivanu supstancu (videti Deo četvrti ove metode).

Faza unosa traje 28 dana, osim u slučaju kad se može uočiti da se ravnotežno stanje uspostavilo i ranije. Ako se ravnotežno stanje ne dostigne do kraja 28. dana, fazu unosa produžiti do dostizanja ravnotežnog stanja ili do 60 dana, zavisno od toga koji uslov se pre ispuni.

1.8.2.2. Trajanje faze eliminacije

Polovina vremena koliko traje faza unosa jeste dovoljno dug period da nastupi zadovoljavajuće smanjenje sadržaja ispitivane supstance u organizmu jedinke od npr. 95% (za objašnjenje procene videti Deo četvrti ove metode). Ako je vreme da se postigne 95% smanjenja nepraktično dugo i premašuje npr. dvostruku dužinu trajanja normalnog trajanja faze unosa (tj. više od 56 dana) može se koristiti kraći period (odnosno dok koncentracija ispitivane supstance ne dostigne vrednost manje od 10% ravnotežne koncentracije). Za određivanje konstanti brzine eliminacije supstanci kod kojih su procesi unosa i eliminacije složeniji i ne predstavljaju kinetiku prvog reda, produžiti trajanje faze eliminacije. Taj period može biti određen vremenom u toku kojeg koncentracija ispitivane supstance u ribi ostaje iznad limita detekcije.

1.8.2.3. Broj jedinki riba

Broj jedinki riba za svaku ispitivanu koncentraciju treba da bude dovoljan da obezbedi najmanje četiri jedinke ribe po uzorkovanju. Za preciznija statistička određivanja, potrebno je imati na raspolaganju veći broj jedinki riba.

Ukoliko se u ispitivanju koriste odrasle jedinke riba, u izveštaju navesti da li se radi o mužjaku ili ženki ili se koriste jedinke oba pola. Ako se koriste jedinke oba pola, potvrditi da razlike u sadržaju lipida između mužjaka i ženki pre početka izlaganja ispitivanoj supstanci nisu značajne. Može biti neophodno da se objedine uzorci za sve jedinke muškog i za sve jedinke ženskog pola.

Za svako ispitivanje biraju se jedinke približno iste težine, tako da težina najmanjih primeraka nije manja od dve trećine težine najvećih primeraka. Sve jedinke treba da budu istog uzrasta i da potiču iz istog matičnog jata. Primećeno je da težina i uzrast jedinki riba imaju značajan uticaj na vrednost BCF1, pa se ovi podaci navode u izveštaju. Preporučuje se da se pre ispitivanja iz matičnog jata uzme nekoliko jedinki riba i izmeri njihova težina kako bi se procenila srednja težina jedinki matičnog jata.

1.8.2.4. Nasad

Velika količina vode u odnosu na težinu jedinki riba koristi se kako bi se smanjila redukcija vrednosti Cw prouzrokovana dodavanjem jedinki ribe na početku ispitivanja i da bi se izbeglo smanjenje koncentracije rastvorenog kiseonika. Važno je da režim nasada jedinki ribe odgovara vrsti ribe koja se koristi u ispitivanju. Preporučuje se režim nasada od 0,1 g do 1,0 g ribe (sveže mase) po litru vode na dan. Povećan unos se koristi ako se pokaže da se tražena koncentracija ispitivane supstance može održati unutar granica od ± 20% i da saturacija kiseonika ne pada ispod 60%.

U izboru odgovarajućeg režima unosa, uzima se u obzir prirodno stanište date vrste riba. Na primer, riba koja živi pri dnu može za istu zapreminu vode zahtevati veću površinu dna u akvarijumu u odnosu na pelagijske vrste.

1.8.2.5. Ishrana

Tokom perioda aklimatizacije i perioda trajanja ispitivanja, ribe se hrane odgovarajućom hranom poznatog sadržaja lipida i ukupnih belančevina, u količini dovoljnoj da ih održi zdravima i sa stalnom telesnom težinom. Ribe se hrane svaki dan u toku čitavog perioda aklimatizacije i u toku trajanja ispitivanja u količini od približno 1% do 2% telesne težine dnevno. Ovakav režim održava sadržaj lipida kod većine ribljih vrsta na relativno ujednačenom nivou u toku ispitivanja. Količina hrane se preračunava, npr. jednom sedmično, kako bi se održala ujednačena telesna težina i ujednačen sadržaj lipida. Za ovaj preračun, težina jedinki u svakom akvarijumu određuje se na osnovu težine jedinki ribe koje su prethodni put uzete za uzorkovanje iz tog akvarijumu. Ne meri se težina preostalih jedinki u akvarijumu.

Hrana koja nije pojedena i ekskrementi svakodnevno se ispuštaju iz akvarijuma nakon hranjenja (30 minuta do 1 sat). Akvarijumi se održavaju čistim, u što većoj mogućoj meri, u toku čitavog trajanja ispitivanja, tako da se koncentracija organske materije održava na što nižem nivou, s obzirom na to da prisustvo organskog ugljenika može ograničiti biodostupnost ispitivane supstance1.

Mnoge vrste riblje hrane napravljene su od ribljih prerađevina, te analizirati sadržaj te hrane na prisustvo ispitivane supstance. Bilo bi dobro analizirati pesticide i teške metale u hrani.

1.8.2.6. Svetlost i temperatura

Fotoperiod uobičajeno traje 12 do 16 sati, a temperatura (± 2° C) treba da odgovara vrsti riba koja se koristi u ispitivanju (videti Deo treći ove metode). Vrsta i svojstva osvetljenja treba da budu poznati. Potreban je oprez zbog moguće transformacije ispitivane supstance pod uticajem svetlosti pri datim uslovima osvetljenja definisanim za ovu metodu. Koristi se odgovarajuće osvetljenje i izbegava izlaganje ribe veštačkom svetlu. U nekim slučajevima poželjno je koristiti odgovarajući filter za blokiranje UV zračenja talasne dužine ispod 290 nm.

1.8.2.7. Koncentracije ispitivane supstance

Ispitivanje se odvija u protočnom sistemu i ispituju se najmanje dve koncentracije ispitivane supstance. Viša ili najviša koncentracija ispitivane supstance obično je 1% akutne asimptotske vrednosti LC50 te supstance i potrebno je da bude najmanje deset puta viša od limita detekcije primenjenog analitičkog postupka.

Najviša ispitivana koncentracija supstance može da se odredi deljenjem 96 h LC50 vrednosti za akutnu toksičnost sa odgovarajućom ACRVIII vrednošću (ACR nekih hemikalija se kreće u rasponu od 3 do 100). Ukoliko je moguće, u ispitivanju se koristi jedna ili više drugih koncentracija koje se od najviše ispitivane koncentracije razlikuju za faktor 10. Ako to nije moguće, zbog kriterijuma od 1% LC50 i limita detekcije analitičke metode, može da se upotrebi manji faktor ili se razmatra ispitivanje supstance koja je obeležena radioaktivnim izotopom ugljenika - C14. Nijedna koncentracija ne treba da bude jednaka maksimalnoj rastvorljivosti ispitivane supstance.

Kada se koristi rastvarač, njegova koncentracija ne treba da bude veća od 0,1 ml/l i treba da bude ista u svim tretmanima. Rastvarač zajedno sa ispitivanom supstancom doprinosi ukupnom sadržaju organskog ugljenika u medijumu i treba da bude poznat njegov udeo u ukupnom sadržaju organskog ugljenika. Upotrebu rastvarača treba svesti na najmanju moguću meru.

_____________
VIII Odnos akutne i hronične toksičnosti (acute/chronic toxicity ratio) je faktorkoji služi za procenu hronične toksičnosti neke hemikalije na osnovu podataka o njenoj akutnoj toksičnosti i obrnuto.

1.8.2.8. Kontrole

U ispitivanju je potrebno imati jednu kontrolnu grupu sa jedinkama ribe samo u čistom medijumu ili, ukoliko je relevantno, dodatnu kontrolnu grupu sa rastvaračem, po uslovom da je prethodno utvrđeno da dati rastvarač ne ispoljava efekat na jedinke. U suprotnom, postavljaju se obe kontrolne grupe.

1.8.3. Učestalost merenja kvaliteta vode

Tokom ispitivanja u svim akvarijumima meriti: rastvoreni kiseonik, TOC, pH vrednost i temperaturi akvarijumima. Ukupna tvrdoća i salinitet, ukoliko su relevantni, mere se u kontrolama i u jednom akvarijumu sa višom (ili najvišom) koncentracijom. Rastvoreni kiseonik i salinitet, ukoliko je relevantno, mere se najmanje tri puta: na početku, oko sredine i na kraju faze unosa i jednom sedmično u toku faze eliminacije. TOC se meri na početku ispitivanja (24 sata i 48 sati pre početka faze unosa) pre unosa ribe i najmanje jedanput sedmično u toku faza unosa i eliminacije. Temperatura se meri svakodnevno. Vrednost pH se meri na početku i na kraju svake faze, a tvrdoća jedanput u toku ispitivanja. Poželjno je neprekidno meriti temperaturu najmanje u jednom akvarijumu.

1.8.4. Uzorkovanje i analiziranje ribe i vode

1.8.4.1. Raspored uzorkovanja ribe i vode

Uzorak vode iz komora za ispitivanje, radi određivanja koncentracije ispitivane supstance, uzima se pre unosa ribe i u toku faza unosa i eliminacije. Voda se uzima kad i riba i to pre njenog hranjenja. Tokom faze unosa, mere se koncentracije ispitivane supstance da bi se potvrdilo da su zadovoljeni kriterijumi kvaliteta.

Jedinke riba uzorkuju se najmanje pet puta u toku faze unosa i najmanje četiri puta u toku faze eliminacije. U nekim slučajevima je teško izračunati dovoljno preciznu procenu BCF vrednosti na osnovu ovog broja uzoraka, naročito kad se radi o procesu unosa i eliminacije koji se ne ponaša po modelu kinetike prvog reda, pa uzorkovanje obavljati češće u toku obe faze (videti Deo peti ove metode). Dodatni uzorci čuvaju se i analiziraju samo ako se rezultati prvog kruga analiza pokažu neodgovarajućima za izračunavanje BCF sa željenom preciznošću.

Primer prihvatljivog rasporeda uzimanja uzoraka dat je u Delu četvrtom ove metode. Drugi rasporedi mogu se odrediti pomoću drugih pretpostavljenih vrednosti Kow za izračunavanje trajanja izloženosti u kome dolazi do 95% unosa.

Uzorkovanje se nastavlja u toku faze unosa sve dok se ne uspostavi ravnotežno stanje ili u toku 28 dana, zavisno od toga koji se uslov pre ispuni. Ako se ravnotežno stanje ne postigne u toku 28 dana, uzorkovanje se nastavlja sve do postizanja ravnotežnog stanja ili do 60 dana, zavisno od toga koji uslov se pre ispuni. Pre početka faze eliminacije, jedinke riba se prenose u akvarijume sa čistim medijumom.

1.8.4.2. Uzimanje i priprema uzoraka

Uzorci vode za analizu uzimaju se npr. ispuštanjem vode kroz inertne cevi postavljene na sredini akvarijuma. Filtracija ni centrifugiranje ne odvajaju uvek frakcije ispitivane supstance koje nisu biodostupne od frakcija koje jesu biodostupne (važi naročito za superlipofilne hemikalije odnosno one hemikalije čiji je log Pow > 5)1,5. Nije uvek potrebno raditi filtriranje ili centrifugiranje uzoraka. Umesto toga, potrebno je komore za ispitivanje držati što čistijim, a u toku faza unosa i faze eliminacije prati se sadržaj ukupnog organskog ugljenika.

Pri svakom uzorkovanju odgovarajući broj jedinki riba (obično najmanje četiri) uklanja se iz komore za ispitivanje. Uzorkovane jedinke brzo se ispiraju vodom, obrišu od suvišne tečnosti, trenutno ubijaju na najhumaniji način i izmere.

Poželjno je analizirati uzorke vode i jedinki riba odmah posle uzorkovanja, čime se izbegava razgradnja ili drugi načini gubitka i omogućava izračunavanje brzina unosa i eliminacije u toku ispitivanja. Brzom analizom se omogućava pravovremeno određivanje tačke postizanja ravnotežnog stanja.

Ako se analiza ne obavi odmah, uzorci se čuvaju na odgovarajući način. Pre početka ispitivanja potrebno je imati podatke o odgovarajućim načinima skladištenja za ispitivanu supstancu, npr. zamrzavanje, čuvanje na temperaturi od 4 °C, trajanje skladištenja, ekstrakcija, itd.

1.8.4.3. Kvalitet analitičkog postupka

Metoda ispitivanja zavisi od tačnosti, preciznosti i osetljivosti primenjene analitičke metode za datu ispitivanu supstancu, pa je neophodno ispitivanjem proveriti da li su preciznost i ponovljivost hemijske analize, kao i efikasnost analitičkog postupka za ispitivanu supstancu u vodi i ribi, zadovoljavajući za određeni analitički postupak. Analizira se i voda za razblaživanje na prisustvo date ispitivane supstanca.

Po potrebi se koriguju vrednosti Cw i Cf dobijene iz ispitivanja i to pomoću vrednosti efikasnosti analitičke tehnike i vrednosti fona u kontroli. Potrebno je pažljivo rukovati uzorcima ribe i vode tako da se u najvećoj mogućoj meri onemogući kontaminacija i gubici (na primer gubici koji mogu nastati usled adsorpcije na opremu za uzorkovanje).

1.8.4.4. Analiza uzoraka ribe

Ako se u ispitivanju koriste obeležene supstance, može se analizirati ukupni radio obeleženi materijal (odnosno polazna supstanca i njeni metaboliti), ili uzorci mogu biti prečišćeni tako da se polazna supstance može analizirati posebno. Glavni metaboliti mogu se okarakterisati u ravnotežnom stanju ili na kraju faze unosa, zavisno od toga koji uslov se pre ispuni. Ako je BCF u smislu ukupnih radioaktivnih rezidijuma ± 1.000%, savetuje se (za određene kategorije hemikalija, kao što su pesticidi čvrsto preporučuje) da se identifikuju i kvantifikuju produkti razgradnje koji čine ± 10% ukupnih rezidijuma u tkivu ribe u ravnotežnom stanju. Ako se identifikuju i kvantifikuju produkti razgradnje koji čine ± 10% ukupnih radioaktivnih rezidijuma u ribljem tkivu, preporučuje se i identifikacija i kvantifikacija produkata razgradnje u medijumu.

Koncentracija ispitivane supstance se meri u svakoj jedinki ribe koja je prethodno izmerena. Ako to nije moguće, koncentracija ispitivane supstance može se odrediti u objedinjenom uzorku, ali takvo određivanje smanjuje broj statističkih postupaka koji se mogu primeniti na date podatke. Ako se uzimaju u obzir specifični statistički postupak i statistička snaga, u ispitivanje se uključuje odgovarajući broj jedinki riba da bi se zadovoljili kriterijumi za željeni postupak analize objedinjenih uzoraka i za statistički značaj ispitivanja6, 7.

BCF se izražava u funkciji ukupne sveže mase, a za visoko lipofilne supstance i u funkciji sadržaja lipida. Sadržaj lipida u ribama određuje se pri svakom uzimanju uzoraka, ukoliko je to moguće. Za određivanje sadržaja lipida koriste se odgovarajuće metode (videti Deo četvrti8,2 ove metode). Kao standardna metoda preporučuje se tehnika ekstrakcije hloroform/metanol9. Različite metode daju različite vrednosti10, pa je važno detaljno opisati primenjenu metodu. Analiza sadržaja lipida po mogućnosti se sprovodi u istom ekstraktu u kojem se meri i koncentracija ispitivane supstance, s obzirom na to da je često potrebno lipide ukloniti iz ekstrakta da bi se ekstrakt mogao analizirati metodom hromatografije. Sadržaj lipida u ribi (u mg/kg mokre težine) na kraju ispitivanja ne sme da se razlikuje za više od ± 25% u odnosu na sadržaj na početku ispitivanja. Navodi se i procenat suve materije tkiva da bi se omogućila konverzija vrednosti koncentracije lipida u funkciji sveže mase u koncentraciju lipida u funkciji suve mase.

2. PODACI

2.1. OBRADA REZULTATA

Kriva unosa za ispitivanu supstancu dobija se grafičkim prikazom koncentracije ispitivane supstance u ili na ribi (ili određenim tkivima) u fazi unosa u funkciji vremena. Ako je kriva dostigla plato, odnosno ako je postala približno paralelna sa x-osom, BCFSS se izračunava formulom:

Kad se ne dostigne ravnotežno stanje, moguće je izračunati BCFSS koji je dovoljno precizan za procenu rizika iz ravnotežnog stanja kao 80% (1,6/k2) ili 95% (3,0/k2) ekvilibrijuma.

Određuje se i BCFK kao odnos k1/k2, dve konstante kinetike prvog reda. Konstanta brzine eliminacije (k2) obično se određuje iz krive eliminacije (odnosno grafičkog prikaza smanjenja koncentracije ispitivane supstance u ribi u funkciji vremena). Zatim se izračunava konstanta brzine unosa (k1) s obzirom na k2 i vrednost Cf koja se određuje iz krive unosa (videti Deo šesti ove metode). Najbolji postupak za određivanje vrednosti BCFK i konstantni k1 i k2 je upotrebom računara korišćenjem metoda za procenu nelinearnih parametara11. Koristi se i grafički metod za izračunavanje k1 i k2. Ako kriva eliminacije očigledno nije kriva kinetike prvog reda, upotrebljavaju se složeniji modeli (videti literaturu u Delu četvrtom ove metode) i traži savet statističara.

2.2. TUMAČENJE REZULTATA

Treba biti oprezan prilikom tumačenja rezultata ispitivanja kada se izmerene koncentracije ispitivane supstance nalaze blizu limita detekcije primenjene analitičke metode.

Jasno definisane krive unosa i eliminacije su indikatori dobrog kvaliteta podataka. Razlika između vrednosti konstanti unosa/eliminacije za dve primenjene koncentracije ispitivane supstance je manje od 20%. U izveštaju o ispitivanju navode se i objašnjavaju opažene značajne razlike u brzinama unosa/eliminacije za dve primenjene koncentracije ispitivane supstance. Uobičajeno, intervali poverenja za vrednosti BCF iz dobro osmišljenog i izvedenog ispitivanja iznose oko ± 20%.

3. IZVEŠTAJ

Izveštaj sadrži podatke o:

1. ispitivanoj supstanci:

- fizička priroda i ukoliko je relevantno, fizička i hemijska svojstva;

- podaci o hemijskoj identifikaciji (uključujući sadržaj organskog ugljenika, ukoliko je prikladno);

- ukoliko se ispituju obeležene supstance, tačan položaj radioaktivno obeleženih atoma i procenat radioaktivnosti povezan sa nečistoćama;

2. vrstama koje se koriste u ispitivanju:

- latinski naziv, soj, poreklo, prethodni tretmani (ukoliko ih je bilo), aklimatizacija, uzrast, veličina jedinki, itd.

3. uslovima ispitivanja:

- primenjeni uslovi ispitivanja (npr. protočni ili semi-statički);

- tip i svojstva primenjenog osvetljenja i trajanje fotoperioda;

- postavka ispitivanja (npr. broj i veličina akvarijuma, dinamika izmene medijuma u akvarijumima, broj ponavljanja, broj jedinki riba po ponavljanju, broj koncentracija ispitivane supstance, dužina trajanja faza unosa i eliminacije, učestalost uzimanja uzoraka ribe i vode);

- postupak pripreme osnovnih rastvora i učestalost izmene (ukoliko se koristi rastvarač za povećanje rastvorljivosti ispitivane supstance, navodi se koji rastvarač, njegova koncentracija i doprinos sadržaju ukupnom organskog ugljenika u medijumu);

- nominalne koncentracije ispitivane supstance, srednje vrednosti i standardne devijacije koncentracija izmerenih u akvarijumima i postupak kojim su određene;

- izvor vode za razblaživanje, opis svake prethodne obrade, rezultati bilo kog ispitivanja koji potvrđuje da jedinke ribe mogu da žive u toj vodi, kao i svojstva vode: pH vrednost, tvrdoća, temperatura, koncentracija rastvorenog kiseonika, rezidijumi hlora (ukoliko je mereno), ukupni organski ugljenik, suspendovane materije, salinitet mediuma (ukoliko je primereno) i rezultati svih merenja koja su urađena u toku ispitivanja;

- kvalitet vode u akvarijumima, pH vrednost, tvrdoća, TOC, temperatura i koncentracija rastvorenog kiseonika;

- detaljni podaci o hranjenju (npr, vrsta hrane, poreklo, sastav - ako je moguće, bar sadržaj lipida i proteina, količina hrane i učestalost hranjenja);

- podaci o obradi uzoraka ribe i vode, uključujući detalje o pripremi, čuvanju, ekstrakciji i analitičkim metodama (i preciznost) primenjenim na ispitivanoj supstanci i sadržaj lipida ukoliko je meren).

4. rezultatima:

- rezultati svakog preliminarnog ispitivanja;

- smrtnost u kontrolnim i u svim ispitivanim grupama, kao i svako uočeno abnormalno ponašanje;

- sadržaj lipida u jedinkama ribe (ukoliko je određivano u toku ispitivanja);

- krive (uključujući sve podatke merenja) koje pokazuju unos i eliminaciju ispitivane supstance iz ribe i vreme do uspostavljanja ravnotežnog stanja;

- Cf i Cw (sa standardnom devijacijom i intervalima poverenja, ukoliko je primereno) za sva uzorkovanja (Cf izražen u mg/g mokre težine (ppm) cele ribe ili određenih tkiva ribe, npr. lipida, i Cw u mg/g (ppm). Cw vrednosti za kontrolu (vrednost fona se takođe navodi);

- BCFSS, odnosno BCFK, ukoliko je primenljivo, 95% intervali poverenja za konstante brzina unosa i eliminacije (sve izražene u odnosu na celu ribu, i ukupni sadržaj lipida ukoliko je izmeren, ribe ili određenih tkiva ribe), intervala poverenja i standardne devijacije (ukoliko se raspolaže tim podacima) i postupci izračunavanja/analize podataka za svaku koncentraciju ispitivane supstance;

- ako su korišćene obeležene supstance i ukoliko je zahtevano, može se prikazati akumulacija svih detektovanih metabolita;

- sva neobična opažanja u toku ispitivanja, sva odstupanja od ovde opisanih postupaka i sve ostale relevantne informacije;

Rezultati ispod limita detekcije ne koriste se za izračunavanje konstanti brzina.

4. LITERATURA

1. Connell D.W. (1988) Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, p. 117-156.

2. Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993) Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, p. 29-390.

3. OECD, Paris (1996) Direct Phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.

4. Kristensen P. (1991) BioCOncentration in fish: Comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.

5. US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.

6. US FDA, (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.

7. US EPA (1974). Section 5, A(1) Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J.F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.

8. Compaan H. (1980) in 'The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation' Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, The Hague, The Netherlands.

9. Gardner et al, (1995) Limn. & Oceanogr. 30, p. 1099-1105.

10. Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, p. 1431-1436.

11. CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method-Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm.

12. ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988) Standard

Deo drugi

HEMIJSKA SVOJSTVA ODGOVARAJUĆE VODE ZA RAZBLAŽIVANJE

Deo treći

PREPORUČENE VRSTE RIBA ZA ISPITIVANJA

Različite estuarske i morske vrste riba koje se koriste u drugim zemljama su: Leiostomus xanthurus, Cyprinodon variegatus, Menidia beryllina, Cymatogaster aggregata, Parophrys vetulus, Leptocottus armatus, Gasterosteus aculeatus, Dicentracus labrax i Alburnus alburnus.

_____________
IX Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 252, p. 231

PRIKUPLJANJE

Navedene vrste riba lako se razmnožavaju i uzgajaju. U mnogim delovima sveta ove vrste riba mogu se nabaviti u toku cele godine. Kako su navedene vrste pogodne i za uzgajanje u laboratorijskim uslovima, zdravstveno stanje i poreklo jedinki koje se koriste za ispitivanje je, uz kontrolu prisustva parazita i bolesti, uvek poznato.

Deo četvrti

PREDVIĐANJE TRAJANJA FAZA UNOSA I ELIMINACIJE

1. PREDVIĐANJE TRAJANJA FAZE UNOSA

Pre izvođenja ispitivanja, procena k2 i procena vremena potrebnog da se uspostavi ravnotežno stanje može se dobiti iz empirijskih odnosa između vrednosti k2 i koeficijenta raspodele u sistemu n-oktanol/voda (Pow) ili k2 i rastvorljivosti u vodi ispitivane supstance (s).

Procena k2 (dan-1) može se dobiti, npr. iz sledeće empirijske jednačine1:

log10k2 = -0.414×log10(Pow)+1.47×(r2 = 0.95) (jednačina 1)

Za ostale jednačine videti u literaturi2.

Ako podeoni koeficijent (Pow) nije poznat, može se napraviti procena3 na osnovu poznavanja rastvorljivosti ispitivane supstance u vodi koristeći jednačinu:

log10Pow = 0.862×log10(s)+0.710×(r2 = 0.994) (jednačina 2)

pri čemu:

s jeste rastvorljivost (mol/l) : (n=36)

Ovi odnosi važe samo za supstance sa vrednostima log Pow između 2 i 6,54.

Vreme potrebno da se postigne određeni procenat ravnotežnog stanja može se dobiti iz opšte kinetičke jednačine koja opisuje unos i eliminaciju (kinetika prvog reda):

ili ako je vrednost Cw konstantna:

Kad se približava dostizanje ravnotežnog stanja (t®¥), jednačina 3 može se svesti5, 6 na:

ili

Onda se iz izraza k1/k2×Cw može odrediti koncentracija ispitivane supstance u ribi pri ravnotežnom stanju (Cf,s).

Jednačina 3 može se pretvoriti u:

Cf = Cf,s x (1 - e-k2t)

ili

Primenom jednačine 4, vreme da se dostigne određeni procenat ravnotežnog stanja može se predvideti kad se k2 prethodno odredi koristeći jednačine 1 ili 2.

Kao smernica, statistički optimalno trajanje faze unosa za dobijanje statistički prihvatljivih podataka (BCFK) jeste period potreban da kriva koja predstavlja log-transformisane podatke za koncentraciju ispitivane supstance u funkciji vremena dostigne srednju tačku, ili 1,6/k2, ili 80% ravnotežnog stanja, ali ne više od 3,0/k2 ili 95% ravnotežnog stanja7.

Vreme potrebno da se dostigne 80% ravnotežnog stanja je (jednačina 4):

0,80 = 1 - e - K2t80

ili

Slično tome, vreme potrebno za dostizanje 95% ravnotežnog stanja je:

Na primer, trajanje faze unosa (up) za ispitivanu supstancu sa log (Pow) = 4 bilo bi (primenom jednačina 1, 5 i 6):

log10k2 = -0,414.(4)+1,47

k2 = 0,652 dana-1

up (80%) = 1,6/0,652 odnosno 2,45 dana (59 sati)

ili

up (95%) = 3,0/0,652 odnosno 4,6 dana (110 sati)

Slično tome, za ispitivanu supstancu sa s = 10-5 mol/L (log (s) = -5,0), trajanje faze unosa bilo bi (primenom jednačina 1,2,5,6):

log10(Pow) = -0,862(-5,0)+0,710 = 5,02

log10k2 = -0,414.(4)+1,47

k2 = 0,246 dana-1

up (80%) = 1,6/0,246 odnosno 6,5 dana (156 sati)

ili

up (95%) = 3,0/0,246 odnosno 12,2 dana (293 sata)

Alternativno tome, izraz:

teq = 6,54 × 10-3 Pow + 55,31 (sati)

može se koristiti da se izračuna vreme potrebno za dostizanje efektivnog ravnotežnog stanja4.

2. PREDVIĐANJE TRAJANJA FAZE ELIMINACIJE

Predviđanje vremena potrebnog da se smanji koncentracija ispitivane supstance u organizmu koji se koristi u ovoj metodi do određenog procenta početne koncentracije može se dobiti iz opšte jednačine koja opisuje unos i eliminaciju (kinetika prvog reda)1, 8.

Za fazu eliminacije, pretpostavlja se da je vrednost Cw nula. Jednačina se može redukovati na:

ili

Cf = Cf,o × e - K2t

pri čemu

Cf,0 jeste koncentracija na početku perioda eliminacije.

Eliminacija od 50% postiže se u vremenu t50:

ili

Slično tome, 95% eliminacija postiže se pri:

Ako se koristi 80% unosa za prvi period (1,6/k2) i 95% gubitka u fazi eliminacije (3,0/k2), onda faza eliminacije traje približno dva puta duže od faze unosa.

Ove procene se zasnivaju na pretpostavci da se procesi unosa i eliminacije mogu opisati kao kinetika prvog reda. Ukoliko se ne ponašaju po modelu kinetike prvog reda, koriste se složeniji modeli1.

LITERATURA

1. Spacie A. and Hamelink J.L. (1982) Alternative models for describing the bioConcentration of organics in fish. Environ. ToxiCol. and Chem. 1, pp 309-320.

2. Kristensen P. (1991) BioConcentration in fish: Comparison of BCF's derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.

3. Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982) Partitioning of organic Compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp 4-10.

4. Hawker D.W. and Connell D.W. (1988) Influence of partition Coefficient of lipophilic Compounds on bioConcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp 701-707.

5. Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975) Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp 785-792.

6. Ernst W. (1985) Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4 pp 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd. N.Y.

7. Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff M.W. (1977) Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp 614-622.

8. Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980) ToxiCokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp 3-19.

Sledeći