Nastanak eritema i eshare |
|
Nema eritema | 0 |
Veoma slab eritem (jedva vidljiv) | 1 |
Dobro definisan eritem | 2 |
Srednje izražen do jak eritem | 3 |
Jak eritem (crvenilo) uz nastanak eshare koja sprečava ocenu eritema | 4 |
Maksimalna ocena: 4 |
|
Nastanak edema |
|
Nema edema | 0 |
Veoma slab edem (jedva vidljiv) | 1 |
Slab edem (jasno ograničen) | 2 |
Srednje izražen edem (uzdignut približno 1 mm) | 3 |
Jak edem (uzdignut iznad 1 mm i proširen i na površinu koja nije bila izložena supstanci) | 4 |
Maksimalna ocena: 4 |
|
U slučaju nejasnih nalaza potrebno je obaviti histopatološka ispitivanja.
STRATEGIJA ISPITIVANJA IRITACIJE I KOROZIVNOG OŠTEĆENJA KOŽE KORAK PO KORAK
U interesu naučne zasnovanosti i zbog dobrobiti životinja važno je izbegavati nepotrebno korišćenje životinja ili ispitivanja koja će kod životinja verovatno izazvati jak odgovor. Pre in vivo ispitivanja iritacije/korozivnog oštećenja potrebno je proceniti sve postojeće podatke koji se odnose na potencijal ispitivane supstance da izazove iritaciju /korozivno oštećenje. Ispitivanje na laboratorijskim životinjama može da se izbegne ako postoji dovoljno podataka i dokaza za klasifikaciju određene supstance u odnosu na potencijal da izazove iritaciju/korozivno oštećenje. Na osnovu analize kvaliteta podataka i strategije ispitivanja korak po korak smanjiće se potreba za in vivo ispitivanjima, naročito ako se sumnja na mogućnost da će ispitivana supstanca izazvati intenzivne reakcije na koži.
Analiza kvaliteta podataka koristi se za procenu postojećih podataka o iritaciji/korozivnom oštećenju kože koje izaziva ispitivana supstanca i da bi se utvrdilo da li se osim in vivo studija na koži, izvode i dodatna ispitivanja koja bi doprinela da se bolje opiše ovaj potencijal ispitivane supstance. Kada se pokaže potreba za dodatnim ispitivanjima, za prikupljanje novih, relevantnih eksperimentalnih podatka preporučuje se primena strategije ispitivanja korak po korak. Za supstance koje prethodno nisu ispitivane, takođe je potrebno primeniti strategiju ispitivanja korak po korak za određivanje njenih efekata na koži. Strategiju ispitivanja opisanu u ovom Delu razvili su članovi radne grupe OECD1, a ista je kasnija potvrđena i proširena u sklopu Globalno harmonizovanog sistema za klasifikaciju hemijskih supstanci u odnosu na efekte po zdravlje ljudi i na životnu sredinu, na 28-om zajedničkom Simpozijumu hemijske komisije i radne grupe za hemiju, u novembru 1998. godine2.
Iako strategija ispitivanja korak po korak nije sastavni deo metode ispitivanja B.4. koja je data u ovom Delu, ona odražava preporučeni pristup za određivanje svojstava supstanci na osnovu iritativnih/korozivnih efekata na koži. Ova metoda ispitivanja predstavlja, sa aspekta etike i prakse, najbolji pristup za in vivo ispitivanja iritacije/korozivnog oštećenja na koži. Metoda ispitivanja služi kao uputstvo za izvođenje in vivo ispitivanja i zbraja faktore koje je potrebno sagledati pre početka ispitivanja na životinjama. Strategija takođe daje preporuku za procenu postojećih podataka o ispitivanoj supstanci, kao i način na koji je potrebno prikupiti nove podatke za supstance za koje su potrebna dodatna ispitivanja ili za supstance za koje nikakva ispitivanja nisu prethodno sprovedena. Pod određenim okolnostima, preporučuje se i izvođenje validiranih i prihvaćenih in vitro ili ex vivo ispitivanja iritativnih/korozivnih efekata na koži.
2. OPIS STRATEGIJE ISPITIVANJA I PROCENE
Pre početka ispitivanja, kao deo strategije ispitivanja korak po korak (videti Sliku), procenjuju se svi dostupni podaci kako bi se odredila potreba za in vivo ispitivanjima na koži. Iako je značajne podatke moguće dobiti procenom jednog parametara (npr. visoki pH), za donošenje konačne odluke o ispitivanjima moraju se razmotriti i svi drugi dostupni podaci, kao što su štetni efekti ispitivane supstance ili njenih analoga. Na kraju je potrebno izneti i objašnjenje za donetu odluku. Akcenat je na postojećim podacima o ispitivanoj supstanci dobijenim iz nalaza kod ljudi i ispitivanja na životinjama, i na ishodu in vitro ili ex vivo ispitivanja. Gde god je moguće treba izbegavati in vivo studije korozivnih supstanci za koje se unapred zna da su štetne. Faktori koji se uzimaju u obzir u strategiji ispitivanja uključuju:
Procenu postojećih podataka studija dobijenih na osnovu nalaza kod ljudi i podataka iz ispitivanja na životinjama (korak 1). Prvo se razmatraju postojeći podaci na osnovu nalaza kod ljudi npr. kliničke studije, studije nakon profesionalne izloženosti, prikazi slučaja; odnosno iz studija na životinjama npr. podaci iz ispitivanja sa jednom ili ponovljenim dozama, budući da se dobijaju podaci koji su direktno povezani sa efektima na koži. Nije potrebno ispitivati in vivo supstance za koje se pouzdano zna da izazivaju iritaciju/korozivno oštećenje kože, kao i one za koje postoje dokazi da nemaju takve efekte.
Analizu odnosa strukture i aktivnosti (u daljem tekstu: SAR) (korak 2). Razmatraju se rezultati ispitivanja strukturno sličnih supstanci, ako takve postoje. Kada dovoljno dostupnih podataka o strukturno sličnim supstancama/smešama tih supstanci ukazuju na njihov potencijal za iritaciju/korozivni efekat, može se pretpostaviti da će ispitivana supstanca u sličnim studijama dati slične nalaze. U takvim slučajevima, supstancu nije potrebno dodatno ispitivati. Negativni rezultati, odnosno podaci koji ukazuju na izostanak ovakvih efekata, iz studije na strukturno sličnim supstancama ili smešama takvih supstanci, ne predstavljaju dovoljno čvrst dokaz o neškodljivosti supstance koja je u postupku analize. Validirani i prihvaćeni SAR pristup koristi se kako bi se identifikovao potencijal za iritativni i korozivni efekat ispitivane supstance.
Fizička i hemijska svojstva i hemijsku reaktivnost (korak 3). Supstance koje imaju ekstremne pH vrednosti kao ≤ 2,0 i ≥ 11,5 mogu imati izražene lokalne efekte. Ako je ekstremni pH osnova za ocenjivanje potencijala supstance da izazove korozivno oštećenje kože, mora se razmotriti i njena kiselo-bazna rezerva (ili puferski kapacitet)3, 4. Ako puferski kapacitet ukazuje na to da supstanca ne izaziva korozivno oštećenje kože, neophodno je obaviti dodatna ispitivanja kako bi se potvrdila ova pretpostavka, i to po mogućstvu primenom validiranih i prihvaćenih in vitro ili ex vivo ispitivanja (videti korake 5 i 6).
Dermalnu toksičnost (korak 4). Ako se pokazalo da je hemikalija veoma toksična nakon dermalne primene, ne preporučuje se in vivo ispitivanje iritacije/korozivnog oštećenja, budući da će količina ispitivane supstance koja se uobičajeno primenjuje premašiti onu veoma toksičnu dozu, i dovesti do uginuća ili izrazite patnje životinja. Nisu potrebna dodatna ispitivanja ako prethodno izvedena ispitivanja na albino kunićima primenom doze od 2.000 mg/kg TM ili veće nisu pokazala nikakve štetne efekte na koži. Kod procene akutne dermalne toksičnosti potrebno je imati na umu nekoliko stvari: na primer, beleške o lezijama na koži mogu biti nepotpune. Ispitivanja i opažanja mogu biti obavljena na drugoj vrsti, a ne na kunićima, a druge životinjske vrste mogu bitno da se razlikuju po osetljivosti odgovora. Oblik u kojem je ispitivana supstanca primenjena na kožu možda nije odgovarajući za određivanje iritacije/korozivnog oštećenja kože (npr. razblaživanje supstance kod ispitivanja dermalne toksičnosti5). U slučajevima kada su obavljena dobro osmišljena ispitivanja dermalne toksičnosti na koži kunića, negativni nalazi mogu da se smatraju dovoljno čvrstim dokazom da ispitivana supstanca ne izaziva iritaciju/korozivno oštećenje kože.
Rezultate in vitro ili ex vivo ispitivanja (koraci 5 i 6). Ispitivanje na životinjama nije potrebno vršiti za supstance koje su pokazale korozivno ili jako iritativno svojstvo u in vitro ili ex vivo ispitivanjima6, 7 koja su validirana i prihvaćena upravo za procenu ovih specifičnih efekata, već se može pretpostaviti da će ove supstance dovesti do sličnih efekata i in vivo.
In vivo ispitivanja na kunićima (koraci 7 i 8). Ako se nakon procene kvaliteta postojećih podataka ipak donese odluka da se izvodi in vivo ispitivanje, inicijalno ispitivanje treba započeti samo na jednoj životinji. Ako na toj životinji supstanca izazove korozivno oštećenje kože, obustavljaju se dalja ispitivanja. Ako ne dođe do korozivnog oštećenja kože u inicijalnom ispitivanju, potrebno je da se iritativni ili negativni nalaz dodatno potvrdi na još dve eksperimentalne životinje i to za vreme izlaganja u trajanju od četiri sata. Ako se uoči efekat iritacije u inicijalnom ispitivanju, može da se obavi ispitivanje kojim se potvrđuje i to korak po korak, ili istovremenim izlaganjem dve dodatne životinje.
1. OECD, (1996) Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
2. OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
3. Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Liebsch M., (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, p. 709-720.
4. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H., (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxicology In vitro, 2(1), p. 19-26.
5. Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In vitro Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6, Chapter 31, p. 411-436.
6. Testing Method B.40.
7. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology In vitro 12, p. 483-524.
ISPITIVANJE I STRATEGIJA PROCENE ZA IRITACIJU/KOROZIVNO OŠTEĆENJE KOŽE
| Aktivnost | Nalaz | Zaključak |
1 | Postojeći podaci dobijeni na osnovu ispitivanja kod ljudi životinja koji pokazuju efekte na koži ili sluzokoži | Korozija | Supstanca je korozivna. |
| Dalja ispitivanja nisu potrebna. | ||
|
| ||
Iritacija | Supstanca je iritativna. | ||
| Dalja ispitivanja nisu potrebna. | ||
|
| ||
Nema korozije iritacije | Supstanca nije iritativna korozivna. | ||
↓ |
| Dalja ispitivanja nisu potrebna. | |
| Nema dostupnih podataka ili su dostupni podaci neadekvatni |
|
|
| ↓ |
|
|
2 | Izvršiti SAR procenu za iritaciju korozivno oštećenja kože | Predviđa se teško | Supstanca je korozivna. |
Dalja ispitivanja nisu potrebna. | |||
Predviđa se iritacija | Supstanca je iritativna. | ||
| ↓ | Dalja ispitivanja nisu potrebna. | |
| Nije moguće predvideti, ili su predviđanja negativna i nejasna |
|
|
| ↓ |
|
|
3 | Odrediti pH (po potrebi, razmotriti puferski kapacitet) | pH ≤ 2 ili ≥ 11,5 (sa visokim puferskim kapacitetom, po potrebi) | Pretpostavlja se da je supstanca korozivna. Dalja ispitivanja nisu potrebna. |
| ↓ | ||
| 2 < pH < 11,5 ili pH ≤ 2,0 ili ≥ 11,5 sa malim bez puferskog kapaciteta, po potrebi |
|
|
| ↓ |
|
|
4 | Proceniti podatke koji se odnose na sistemsku toksičnost putem primene na kožu(1) | Veoma toksično | Dalja ispitivanja nisu potrebna. |
|
| ||
Nema korozivnog oštećenja iritacije pri ispitivanju granične doze od 2000 mg/kg TM ili veće, kod kunića | Smatra se da supstanca nije iritativna korozivna. | ||
| ↓ | Dalja ispitivanja nisu potrebna. | |
| Podaci dostupni ili se smatraju neadekvatnim za izvođenje zaključaka |
|
|
| ↓ |
|
|
5 | Izvršiti validirana i prihvaćena in vitro ili ex vivo ispitivanja korozivnog oštećenja kože | Korozivno za kožu | Pretpostavlja se korozivno oštećenje in vivo ispitivanjima. |
| ↓ |
| Dalja ispitivanja nisu potrebna. |
| Supstanca ne dovodi do korozivnog oštećenja |
|
|
| ↓ |
|
|
6 | Izvršiti validirana i prihvaćena in vitro ili ex vivo ispitivanja iritacije kože | Iritativno za kožu |
Pretpostavlja se iritacija in vivo ispitivanjima. Pretpostavlja se korozivno oštećenje in vivo ispitivanjima. |
| ↓ |
| |
| Validirane in vitro ili ex vivo metode ispitivanja | ||
| ↓ |
|
|
7 | Izvršiti inicijalno in vivo ispitivanje na jednom kuniću | Teško oštećenje kože | Supstanca je korozivna |
| ↓ |
|
|
| Nema teških oštećenja |
|
|
| ↓ |
|
|
8 | Obaviti na jednoj ili dve dodatne životinje ispitivanje kojim se potvrđuje | Korozivno ili iritativno | Supstanca je korozivna ili iritativna. |
|
| Dalja ispitivanja nisu potrebna. | |
| Nije korozivno ili iritativno | Supstanca nije korozivna ili iritativna. | |
|
|
| Dalja ispitivanja nisu potrebna. |
_______________
(1) može se razmotriti pre koraka 2 i 3.
B.5. AKUTNA TOKSIČNOST: IRITACIJA/TEŠKO OŠTEĆENJE OKA
Ova metoda potpuno odgovara metodi OECD: TG 405 (2002).
U pripremi ažurirane verzije ove metode ispitivanja posebna pažnja posvećena je mogućim poboljšanjima u odnosu na dobrobit životinja, kao i na procenu svih postojećih podataka o ispitivanoj supstanci, sa ciljem da se izbegnu nepotrebna ispitivanja na životinjama. Metoda ispitivanja zasniva se na preporuci da se pre in vivo ispitivanja akutnog iritativnog/korozivnog oštećenje oka obavi analiza kvaliteta postojećih podataka1. Kada nema dovoljno podataka, moguće je dobiti ih primenom ispitivanja korak po korak2, 3. Strategija ispitivanja uključuje i obavljanje validiranih i prihvaćenih in vitro ili ex vivo ispitivanja koja su opisana u Delu trećem ove metode. Pre izvođenja in vivo ispitivanja oka preporučuje se korišćenje in vivo ispitivanja iritacije/korozivnog oštećenja kože koja mogu da predvide iritaciju oka.
U interesu naučne zasnovanosti i dobrobiti životinja jeste da se in vivo studije započinju nakon procene svih dostupnih podataka koji su relevantni za procenu potencijala supstance da izazove iritaciju/teško oštećenje oka. Takvi podaci proizlaze iz prethodno dobijenih nalaza kod ljudi odnosno sprovedenih ispitivanja na laboratorijskim životinjama, iz dokaza o iritaciji /korozivnom oštećenju jedne ili više strukturno sličnih supstanci ili smeša takvih supstanci, ali i iz podataka koji ukazuju na jaku kiselost ili baznost ispitivane supstance4, 5, ili iz prethodno već validiranih i prihvaćenih in vitro ili ex vivo ispitivanja iritacije/korozivnog oštećenja kože6, 6a. Studije mogu da budu sprovedene ranije ili da nastanu kao rezultat analize kvaliteta postojećih podataka.
Za neke supstance analiza može da ukaže na potrebu za in vivo ispitivanjima potencijala supstance za iritaciju/teškog oštećenja oka. U svim takvim slučajevima, pre in vivo ispitivanja efekata na oku, preporučuje se in vivo ispitivanje efekata na koži u skladu sa metodom ispitivanja B.4. koja je data u ovom Delu7. Primena analize kvaliteta postojećih podataka i studije ispitivanja korak po korak smanjuje potrebu za in vivo ispitivanjima iritacije/teškog oštećenja oka za supstance za koje postoje dovoljno podataka iz drugih studija. Ako potencijal supstance da izazove iritaciju/teško oštećenje oka ne može da se odredi korišćenjem metode ispitivanja korak po korak čak ni nakon ispitivanja iritacije/korozivnog oštećenja kože, pristupa se in vivo ispitivanju iritacije/teškog oštećenja oka.
U Delu trećem ove metode opisana je strategija ispitivanja korak po korak koja uključuje i obavljanje validiranih i prihvaćenih in vitro ili ex vivo ispitivanja iritacije/korozivnog oštećenja. Strategiju su razvili, kao jedinstveno prihvaćenu i preporučenu, članovi radne grupe OECD8, a ista je prihvaćena i uvrštena u preporučene strategije ispitivanja od strane Globalno harmonizovanog sistema za klasifikaciju (u daljem tekstu: GHS)9. Ova strategija se preporučuje pre bilo kakvih in vivo ispitivanja. Za nove supstance, ispitivanje korak po korak je preporučeni pristup za dobijanje naučno zasnovanih podataka o njihovim iritativnim/korozivnim efektima. Za supstance koje su već obuhvaćene ispitivanjima, ista strategija treba da se primeni za upotpunjavanje podataka o iritativnim/korozivnim efektima na oko i kožu. Primenu drugačije strategije ispitivanja ili postupka, ili odluku da se ne primeni ova usvojeno ispitivanje korak po korak, potrebno je objasniti i obrazložiti.
Iritacija oka jeste nastanak promena u oku do kojih dolazi nakon primene ispitivane supstance na spoljašnju površinu oka, koje su potpuno reverzibilne u periodu od 21 dana nakon primene.
Teško oštećenje oka jeste oštećenje tkiva oka ili ozbiljno pogoršanje vida nakon primene ispitivane supstance na spoljašnju površinu oka, koje nije potpuno reverzibilno u periodu od 21 dana nakon primene.
Supstanca koja se ispituje primenjuje se u jednoj dozi u jedno oko eksperimentalne životinje. Netretirano oko služi kao kontrola. Stepen iritacije/teškog oštećenja oka procenjuje se ocenjivanjem lezija konjuktive, rožnjače i dužice, u prethodno određenim vremenskim intervalima. Da bi se obezbedila kompletna procena efekata opisuju se i druge promene na oku i sistemski štetni efekti. Ispitivanje treba da traje dovoljno dugo da se proceni reverzibilnost ili ireverzivbilnost efekata.
Životinje koje u bilo kom delu ispitivanja pokazuju stalne znakove patnje odnosno bola lišavaju se života na human način, a supstanca se procenjuje u skladu sa tim. Kriterijumi za donošenje odluke o lišavanju života na human način životinja koje su na samrti i pokazuju znake izrazite patnje, opisani su u literaturi10.
1.4.1. Priprema za in vivo ispitivanje
1.4.1.1. Izbor životinja
Preporučuje se korišćenje zdravih mladih jedinki albino kunića. Ukoliko se koristi druga životinjska vrsta, navode se razlozi za to korišćenje.
1.4.1.2. Priprema životinja
Kod svake eksperimentalne životinje koja je prethodno odabrana za ispitivanje pregledaju se oba oka 24 sata pre početka ispitivanja. Životinje kod kojih je uočena iritacija oka, nedostatak ili već postojeća povreda rožnjače ne koriste se za ispitivanje.
1.4.1.3. Uslovi smeštaja i ishrana
Životinje se smeštaju u odgovarajući smeštaj za pojedinačno i odvojeno držanje. Temperatura smeštajnog prostora u kome se drže kunići treba da se održava na 20°C (± 3°C). Relativna vlažnost vazduha treba da bude najmanje 30% i da ne prelazi 70% (osim u slučajevima kada se prostorija sa životinjama čisti). Idealna vlažnost je između 50% i 60%. Osvetljenje mora da bude veštačko i to u intervalima od 12 sati svetla i 12 sati mraka. Životinje se hrane uobičajenom hranom za laboratorijske životinje, sa slobodnim pristupom vodi za piće.
1.4.2. Postupak ispitivanja
1.4.2.1. Primena ispitivane supstance
Ispitivana supstanca primenjuje se u konjuktivalnu kesu jednog oka svake životinje nakon što se lagano povuče donji kapak očne jabučice. Kapci se zatim nežno spoje na otprilike jednu sekundu da bi se sprečio gubitak supstance. Drugo oko, koje nije tretirano supstancom, služi za kontrolu.
1.4.2.2. Ispiranje
Oči životinja najmanje 24 sata od primene ne smeju da se ispiraju, osim ako se primenjuje čvrsta supstanca (videti odeljak 1.4.2.3.2. ove metode) i u slučaju neposrednog korozivnog ili iritativnog efekta. Nakon 24 sata od primene, ukoliko se proceni da je potrebno, oko može da se ispere.
Ne preporučuje se korišćenje propratne grupe životinja za istraživanje uticaja koji se javljaju nakon ispiranja, osim ukoliko je naučno opravdano. Ako je potrebno koristiti propratnu grupu životinja, uzimaju se dva kunića. Uslovi ispiranja pažljivo se dokumentuju, npr. vreme ispiranja, sastav i temperatura tečnosti za ispiranje; trajanje, intenzitet i brzina primene.
1.4.2.3. Dozni nivoi
1.4.2.3.1. Ispitivanje tečnosti
Za ispitivanje tečnosti koristi se doza ispitivane supstance u zapremini od 0,1 mL. Za ukapavanje supstance direktno u oko ne smeju se koristiti sprejevi sa pumpicom. Tečni sprej se istiskuje i sakuplja u bočice pre ukapavanja 0,1 mL u oko.
1.4.2.3.2. Ispitivanje čvrstih supstanci
Kada se ispituje čvrsta supstanca, pasta, supstance u obliku čestica zapremina koja se koristi je 0,1 mL ili je to masa koja nije veća od 100 mg. Ispitivana supstanca mora da bude usitnjena u fini prah. Količina čvrste supstance meri se nakon što je pažljivo sabijena i stavljena u posudu za merenje. Ako se kod prvog posmatranja koje je se obavlja jedan sat nakon nanošenja čvrste ispitivane supstance uoči da ona nije odstranjena iz oka životinje pomoću fizioloških mehanizama, oko može se ispere fiziološkim rastvorom ili destilovanom vodom.
1.4.2.3.3. Ispitivanje aerosola
Preporučuje se prikupljanje svih sprejeva sa pumpicom i aerosola pre nanošenja (ukapavanja) u oko. Izuzetak su supstance u aerosol bočicama pod pritiskom, koje se zbog isparavanja ne prikupljaju unapred. U tim slučajevima oko se drži otvoreno i ispitivana supstanca se nanosi u jednom potezu direktno u oko u trajanju oko jedne sekunde, sa udaljenosti od 10 cm. Ova udaljenost može da varira, u zavisnosti od pritiska spreja i njegovog sastava. Vodi se računa da pritisak u spreju ne ošteti oko. U nekim slučajevima, postoji potreba za procenom mogućnosti za "mehaničko" oštećenje oka koje su izazvale sile spreja.
Procena doze ispitivane supstance spreja može se utvrditi simuliranjem ispitivanja na sledeći način: supstanca se naprska po papiru za merenje kroz otvor veličine oka kunića. Povećanje mase papira približno je dozi koja je naprskana u oko. Kod isparljivih supstanci, doza se može utvrditi merenjem bočice pre i posle prskanja ispitivane supstance.
1.4.2.4. Inicijalno ispitivanje
(In vivo ispitivanje iritacije/teškog oštećenja oka na jednoj životinji)
Preporučuje se in vivo ispitivanje na jednoj životinji kao što je opisano u strategiji ispitivanja korak po korak (videti Deo treći ove metode).
Ako rezultati pokažu da supstanca izaziva teško oštećenje ili jaku iritaciju oka pri korišćenju propisane metode, ne sprovode se dalja ispitivanja na oku.
1.4.2.5. Lokalni anestetici
Lokalni anestetici mogu da se koriste zavisno od slučaja. Ako analize kvaliteta postojećih podataka ukazuju da supstanca može da izazove bol ili inicijalno ispitivanje pokaže prisustvo bolnih reakcija, pre nanošenja ispitivane supstance može da se upotrebi lokalni anestetik. Vrsta, koncentracija i doza lokalnog anestetika bira se pažljivo, da se spreče odstupanja u reakciji na ispitivanu supstancu zbog njegovog korišćenja. Kontrolno oko je takođe pod lokalnom anestezijom.
1.4.2.6. Ispitivanje kojim se potvrđuje
(In vivo ispitivanje iritacije oka na dodatnim životinjama)
Ako u inicijalnom ispitivanju nije uočeno teško oštećenje oka, iritacija ili negativan rezultat, ono se potvrđuje korišćenjem najviše dve dodatne životinje. Ukoliko se u inicijalnom ispitivanju uoči značajna iritacija koja ukazuje da može da se ponovi jak (ireverzibilan) efekat i u ispitivanju kojim se potvrđuje, preporučeno je da se ispitivanje kojim se potvrđuje izvodi postepeno, prvo na jednoj pa na drugoj životinji, pre nego da se ispitivanje izvodi na obe životinje istovremeno. Ako druga životinja pokaže znakove iritacije ili teškog oštećenja oka, ispitivanje se ne nastavlja. Dodatne životinje mogu da budu potrebne kada se utvrđuju znakovi slabe ili srednje teške iritacije.
1.4.2.7. Period posmatranja
Posmatranje mora da traje dovoljno dugo da bi se u potpunosti utvrdio značaj i reverzibilnost uočenih efekata. Eksperiment se obustavlja uvek kada životinja pokazuje neprekidne znakove bola ili patnje9. Da bi se utvrdila reverzibilnost efekata, životinje se posmatraju 21 dan nakon primene supstance. Ako se pre isteka 21-og dana uoči da su efekti reverzibilni, eksperiment se prekida.
1.4.2.7.1. Klinička posmatranja i ocenjivanje reakcija na oku
Pregled očiju obavlja se nakon 1 sata, 24 sata, 48 sati i 72 sata od primene supstance. Životinje se ne drže u ispitivanju nakon što se dobiju definitivni podaci. Životinje koje pokazuju neprekidne znakove jakog bola ili patnje lišavaju se života na human način bez odlaganja, a supstanca se procenjuje u skladu sa tim. Životinje koje se nakon primene ispitivane supstance lišavaju života na human način mogu imati sledeća oštećenja oka: perforirana rožnjača ili jaka ulceracija rožnjače koja obuhvata stafilom, krv u prednjoj komori oka, četvrti stepen zamućenja rožnjače koji traje 48 sati, nedostatak refleksa na svetlost (ocena 2 reakcije irisa koji traje 72 sat, ulceracija membrane konjuktive, nekroza konjuktive ili membrane sa trepavicama ili deskvamacija. Razlog za lišavanje života na human način jeste što su ove lezije (oštećenja) uglavnom trajne.
Životinje kod kojih se lezije oka ne razviju, mogu da se tretiraju tek nakon trećeg dana od primene. Životinje sa slabim do srednje teškim oštećenjima posmatraju se do uočavanja jasne lezije ili tokom 21 dan, nakon čega se ispitivanje prekida. Posmatranja se obavljaju 7 dana, 14 dana i 21 dan da bi se utvrdio obim oštećenja i njihova reverzibilnost ili ireverzibilnost.
Ocenjivanje reakcije na oku (konjuktiva, rožnjača i dužica) mora da bude zabeleženo kod svakog ispitivanja (videti Deo drugi ove metode). Sva druga oštećenja oka (panus, prebojenost) i druge promene moraju da se navedu.
Ispitivanje reakcija može da se vrši uz korišćenje binokularne lupe, ručne slit-lampe, biomikroskopa ili drugog odgovarajućeg pribora. Nakon beleženja rezultata posmatranja nakon 24 sata, oči dodatno mogu da budu pregledane flourescentnom lampom.
Ocenjivanje nalaza na oku po svojoj prirodi je subjektivno. Kako bi se podstaklo da ocenjivanje nalaza oka bude usklađeno među različitim laboratorijama, potrebno je da se osoblje laboratorija adekvatno obuči za ocenjivanje i tumačenje rezultata.
Ocena iritacije oka procenjuje se u skladu sa prirodom i težinom lezija i njihovom reverzibilnošću ili ireverzibilnošću. Pojedinačne ocene same za sebe ne ukazuju na iritativna svojstva hemikalije, budući da se procenjuju i ostali efekti. Pojedinačne ocene treba imati u vidu kao preporuku i značajne su samo ukoliko su podržane potpunim opisom i procenom svih uočenih efekata.
Izveštaj o ispitivanju sadrži podatke o:
1) Razlozima za in vivo ispitivanje:
- analiza procene kvaliteta postojećih podataka, uključujući i rezultate strategije ispitivanja korak po korak;
- opis relevantnih podataka dobijenih iz prethodnih ispitivanja;
- podaci dobijeni iz svakog koraka strategije ispitivanja;
- opis in vitro izvedenih ispitivanja uključujući detalje o postupku i rezultate dobijene za ispitivanu/referentnu supstancu;
- opis in vivo izvedene studije iritacije/teškog oštećenja oka, uključujući dobijene rezultate;
- analiza kvaliteta podataka za izvođenje in vivo studije.
2) Ispitivanoj supstanci:
- identifikacioni podaci (npr. CAS broj, poreklo, čistoća, poznate nečistoće, broj serije);
- fizičko stanje i fizička i hemijska svojstva (npr. pH, isparljivost, rastvorljivost, stabilnost, hemijska reakcija sa vodom);
- kod smeša: sastav i relativni procenti sastojaka;
- ako se koristi lokalni anestetik: identifikacija, čistoća, tip, doza, eventualna interakcija sa supstancom.
3) Vehikulumu:
- identifikacija, koncentracija (po potrebi), zapremina koja se koristi;
- opravdanost za izbor vehikuluma.
4) Eksperimentalnim životinjama:
- vrsta/soj, razlog za korišćenje druge vrste a ne albino kunića;
- starost svake životinje na početku studije;
- broj životinja oba pola u ispitivanju i kontrolnim grupama (po potrebi);
- telesna masa pojedinačnih životinja na početku i kraju ispitivanja;
- izvor životinja, uslovi smeštaja, ishrana itd.
5) Rezultatima:
- opis metode koja je korišćena za ocenjivanje reakcije pri svakom vremenu posmatranja (npr. ručna slit-lampa, biomikroskop, fluorescentno svetlo);
- tabelarni prikaz nalaza iritacije/teškog oštećenja za svaku životinju pri svakom vremenu posmatranja do uklanjanja životinje iz ispitivanja;
- opis stepena i prirode uočene iritacije ili teškog oštećenja;
- opis drugih uočenih lezija na oku (npr. vaskularizacija, formiranje panusa, prebojenost, adhezija);
- opis svih lokalnih efekata koji nisu na oku i sistematskih štetnih efekata, i histopatološki nalazi ukoliko ih ima.
- tumačenje rezultata.
Rezultati studije iritacije oka na laboratorijskim životinjama mogu se ekstrapolirati na ljude, i validni su u ograničenom stepenu. U mnogim slučajevima albino kunić pokazuje veću osetljivost na iritanse ili korozive oka od čoveka.
Tumačenje rezultata mora da bude precizno da bi se isključila iritacija koja je rezultat sekundarne infekcije.
1. Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410-429.
2. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N., (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, p. 159-164.
3. Worth A.P. and Fentem J.H., (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, p. 161-177
4. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H., (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicollogy In vitro, 2, p. 19-26.
5. Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, p. 227-231.
6. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology In vitro 12, p. 483-524.
6a. Testing Method B.40 Skin Corrosion.
7. Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion.
8. OECD, (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
9. OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
10. OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
Rožnjača
Zamućenost: stepen zamućenosti (očitava se nalaz sa mesta najveće gustine)*
______________
* Beleži se veličina površine zamućenja rožnjače.
Nema ulceracija ni zamućenja | 0 |
Rasute ili difuzne površine zamućenja (osim neznatnog gubitka normalnog sjaja); dužica jasno vidljiva | 1 |
Lako raspoznatljiva providna površina; dužica blago zamućena | 2 |
Nekrotična površina; detalji dužice nisu vidljivi; veličina zenica se jedva raspoznaje | 3 |
Zamućenje rožnjače; dužica se ne raspoznaje kroz zamućenje | 4 |
Mogući maksimum: 4 |
|
Dužica |
|
Normalna | 0 |
Izrazito duboka bora, kongestija, oticanje, umerena hiperemija oko rožnjače; ili nadraženost; dužica reaguje na svetlost (spora reakcija se smatra efektom) | 1 |
Krvarenje, obimna destrukcija, izostanak reakcije na svetlost | 2 |
Mogući maksimum: 2 |
|
Konjuktiva |
|
Crvenilo (odnosi se na palpebralni i bulbarni deo konjuktive; izuzev rožnjače i dužice) |
|
Normalna | 0 |
Hiperemija nekih kapilara | 1 |
Difuzno crvenilo (tamno crvena), pojedinačni kapilari nisu jasno vidljivi | 2 |
Difuzno crvenilo boje mesa | 3 |
Mogući maksimum: 3 |
|
Hemoza |
|
Oticanje (odnosi se na kapke odnosno treći kapak) |
|
Normalno | 0 |
Oticanje iznad normale | 1 |
Jasno oticanje, sa parcijalnim uvrtanjem kapaka | 2 |
Oticanje, sa kapcima zatvorenim na pola | 3 |
Oticanje, sa kapcima zatvorenim više od pola | 4 |
Mogući maksimum: 4 |
|
STRATEGIJA ISPITIVANJA IRITACIJE I TEŠKOG OŠTEĆENJA OKA KORAK PO KORAK
U interesu naučne zasnovanosti i zbog dobrobiti životinja, važno je izbegavati nepotrebno korišćenje životinja ili ispitivanja koja će kod životinja verovatno izazvati jak odgovor. Pre in vivo ispitivanja iritacije/teškog oštećenja oka, potrebno je proceniti sve postojeće podatke koji se odnose na potencijal ispitivane supstance da izazove iritaciju/teško oštećenje oka. Ako postoji dovoljno podataka i dokaza za klasifikaciju određene supstance u odnosu na potencijal da izazove iritaciju/teško oštećenje oka, može da se izbegne ispitivanje na laboratorijskim životinjama. Na osnovu analize kvaliteta podataka i strategije ispitivanja korak po korak smanjiće se potreba za in vivo ispitivanjima, naročito ako se sumnja na mogućnost da će ispitivana supstanca izazvati intenzivne reakcije.
Analiza kvaliteta postojećih podatka koristi se za procenu postojećih podataka o iritaciji/teškom oštećenju oka koje izaziva ispitivana supstanca kako bi se utvrdilo da li je osim in vivo ispitivanja na koži neophodno obaviti i dodatna ispitivanja koja doprinose da se bolje opiše ovaj potencijal ispitivane supstance. Kada se pokaže potreba za dodatnim ispitivanjima, za prikupljanje novih relevantnih eksperimentalnih podatka preporučuje se primena strategije ispitivanja korak po korak. Za supstance koje prethodno nisu ispitivane, takođe je potrebno primeniti strategiju ispitivanja korak po korak za određivanje njenih efekata na oku. Strategiju ispitivanja opisanu u ovom delu razvili su članovi radne grupe OECD1, a ista je kasnije potvrđena i proširena u sklopu Globalno harmonizovanog sistema za klasifikaciju hemijskih supstanci u odnosu na efekte po zdravlje ljudi i na životnu sredinu, na 28-om zajedničkom Simpozijumu hemijske komisije i radne grupe za hemiju, u novembru 1998. godine2.
Iako ova strategija ispitivanja korak po korak nije sastavni deo metode ispitivanja B.5. koja je data u ovom prilogu, ona odražava preporučeni pristup za određivanje svojstava supstanci na osnovu iritativnih/korozivnih efekata na oku. Sa aspekta etike i prakse metoda ispitivanja predstavlja najbolji pristup za in vivo ispitivanja iritacije/teškog oštećenja na oku. Metoda ispitivanja služi i kao uputstvo za izvođenje in vivo ispitivanja i zbraja faktore koje je potrebno sagledati pre početka ispitivanja na životinjama. Strategija takođe daje preporuku za procenu postojećih podataka o ispitivanoj supstanci kao i način na koji je potrebno prikupiti nove podatke za supstance za koje su potrebna dodatna ispitivanja ili za supstance za koje nisu prethodno sprovedena nikakva ispitivanja. Strategija kao prvo uključuje izvođenje validiranog i prihvaćenog in vitro ili ex vivo ispitivanja, a zatim metodu ispitivanja B.4. koja je data u ovom prilogu iritativnih/korozivnih efekata na koži pod specifičnim uslovima3, 4.
2. OPIS STRATEGIJE ISPITIVANJA KORAK PO KORAK
Pre početka ispitivanja u sklopu metode ispitivanja korak po korak (videti Sliku), potrebno je proceniti postojeće podatke kako bi se odredila potreba za in vivo ispitivanjima na oku. Iako je značajne podatke moguće dobiti procenom jednog parametara (npr. visoki pH), za donošenje konačne odluke o ispitivanjima moraju se razmotriti i svi drugi dostupni podaci, kao što su štetni efekti ispitivane supstance ili njenih analoga. Na kraju je potrebno izneti i objašnjenje za donetu odluku. Akcenat je na postojećim podacima o ispitivanoj supstanci dobijenim iz podataka na osnovu nalaza kod ljudi i ispitivanja na životinjama, i na ishodu in vitro ili ex vivo ispitivanja. In vivo studije korozivnih supstanci za koje se unapred zna da su štetne, treba izbegavati gde god je to moguće. Faktori koji se uzimaju u obzir u strategiji ispitivanja uključuju:
Procenu postojećih podataka dobijenih na osnovu nalaza kod ljudi i na ispitivanja kod životinja. (korak 1). Prvo se razmatraju postojeći podaci na osnovu nalaza kod ljudi, npr. kliničke studije, studije nakon profesionalne izloženosti, prikazi slučaja, odnosno podaci iz studija na oku životinja, budući da se dobijaju podaci koji su direktno vezani za efekte na oko. Procenjuju se dostupni podaci iz studija u kojima su vršena istraživanja iritacije/korozivnog oštećenja na osnovu nalaza kod ljudi odnosno ispitivanja kod životinja. Supstance za koje je poznato da izazivaju jaku iritaciju/ korozivno oštećenje oka ne smeju se unositi u oko životinja, kao ni supstance sa istim efektom na koži, jer je to siguran pokazatelj da su iritativni/korozivni i za oko. Supstance za koje ima dovoljno dokaza da ne izazivaju iritaciju/teško oštećenje oka u prethodno izvedenim ispitivanjima, ne treba ispitivati u in vivo studijama oka.
Analizu odnosa strukture i aktivnosti (u daljem tekstu: SAR) (korak 2). Razmatraju se rezultati ispitivanja strukturno sličnih supstanci, ako su dostupni. Kada dovoljno dostupnih podataka o strukturno sličnim supstancama/smešama tih supstanci ukazuju na njihov potencijal za iritaciju/korozivni efekat na oku, može se pretpostaviti da će ispitivana supstanca dati slične nalaze. U takvim slučajevima supstancu nije potrebno dodatno ispitivati. Negativni rezultati, odnosno podaci koji ukazuju na izostanak ovakvih efekata iz studije na strukturno sličnim supstancama ili smešama takvih supstanci, ne predstavljaju dovoljno čvrst dokaz o neškodljivosti supstance koja je u postupku ispitivanja. Validirani i prihvaćeni SAR pristup koristi se za identifikaciju potencijala za iritativni i korozivni efekat ispitivane supstance na oku i koži.
Fizička i hemijska svojstva i hemijsku reaktivnost (korak 3). Supstance koje imaju ekstremne pH vrednosti kao ≤ 2,0 ili ≥ 11,5 mogu imati izražene lokalne efekte. Ako je ekstremni pH osnova za ocenjivanje potencijala supstance da izazove teško oštećenje oka, mora se razmotriti i njena kiselo-bazna rezerva (ili puferski kapacitet)5, 6. Ako puferski kapacitet ukazuje na to da supstanca ne izaziva teško oštećenje oka, neophodno je obaviti dodatna ispitivanja kako bi se potvrdila ova pretpostavka, i to ako je moguće primenom validiranih i prihvaćenih in vitro ili ex vivo ispitivanja (videti korake 5 i 6).
Razmatranje ostalih postojećih podataka (korak 4). U ovom koraku procenjuju se svi dostupni podaci o sistemskoj toksičnosti kod dermalnog puta primene. Akutna dermalna toksičnost ispitivane supstance takođe se razmatra. Ako se pokaže da je ispitivana supstanca veoma toksična ako se primeni na kožu, ne postoji potreba za ispitivanjem na oku, jer ako je veoma toksična nakon dermalnog puta primene, može se pretpostaviti da će izazvati jaku reakciju ako se nanese u oko. Taj podatak takođe može da bude razmotren u koraku 2 i 3.
Rezultate in vitro ili ex vivo ispitivanja (korak 5 i 6). Ispitivanje na životinjama nije potrebno vršiti za supstance koje su pokazale korozivno ili jako iritativno svojstvo u in vitro ili ex vivo ispitivanjima7, 8 koja su validirana i prihvaćena upravo za procenu iritacije/teškog oštećenja oka ili kože. Može se pretpostaviti da takve supstance pokazuju slične efekte in vivo. Ako ne postoje validirana i prihvaćena in vitro/ex vivo ispitivanja, korak 5 i 6 se preskaču i direktno se pristupa koraku 7.
In vivo procenu iritacije ili korozivnog oštećenja kože (korak 7). Kada nema dovoljno dokaza za izvođenje zaključne analize kvaliteta podataka o potencijalu supstance da izazove iritaciju/teško oštećenje oka na osnovu pomenutih studija, prvo se procenjuje in vivo potencijal iritacije/korozivnog oštećenja kože korišćenjem metode ispitivanja B.4. koja je data u ovom Prilogu 4 i Delu trećem datom uz tu metodu ispitivanja9. Ako se pokaže da supstanca izaziva korozivno oštećenje ili tešku iritaciju kože, a ne postoje drugi podaci koji dokazuju suprotno, pretpostavlja se da je supstanca korozivna/iritativna i za oko. U tom slučaju nema potrebe za izvođenjem in vivo ispitivanja na oku. Ako supstanca nije korozivna/iritativna za kožu, izvodi se in vivo ispitivanje na oku.
In vivo ispitivanje na kunićima (korak 8 i 9). In vivo ispitivanje na oku započinje inicijalnim ispitivanjem korišćenjem jedne životinje. Nije potrebno izvoditi dalje ispitivanje ako rezultati ispitivanja ukažu da je supstanca jak iritans ili koroziv za oko. Ako ispitivanje ne pokaže nikakve značajne reakcije, potrebno je, sa dve dodatne životinje, izvesti ispitivanje kojim se potvrđuje (confoirmatory test).
1. OECD, (1996) Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
2. OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
3. Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Liebsch M., (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, p. 709-720.
4. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H., (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxicology In vitro, 2(1), p. 19-26.
5. Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In vitro Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6, Chapter 31, p. 411-436.
6. Testing Method B.40.
7. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology In vitro 12, p. 483-524.
ISPITIVANJE I STRATEGIJA PROCENE ZA IRITACIJU/TEŠKO OŠTEĆENJE OKA
| Aktivnost | Nalaz | Zaključak |
1 | Postojeći podaci dobijeni na osnovu ispitivanja kod ljudi, životinja koji pokazuju efekte na očima | Teško oštećenje oka | Supstanca je korozivna za oko. |
|
| ||
Iritacija oka | Supstanca je iritativna za oko. | ||
|
| ||
Nema teškog oštećenja/iritacije oka | Supstanca nije iritativna/korozivna za oko. Dalja ispitivanja nisu potrebna. | ||
Postojeći podaci dobijeni na osnovu ispitivanja kod ljudi/životinja koji pokazuju korozivne efekte na koži | Korozivno oštećenje kože | Pretpostavlja se da je korozivna za oko. Dalja ispitivanja nisu potrebna. | |
Postojeći podaci dobijeni na osnovu ispitivanja kod ljudi/životinja koji pokazuju jake iritativne efekte na koži | Jaka iritacija kože | Pretpostavlja se da je iritativna za oko. Dalja ispitivanja nisu potrebna. | |
| ↓ |
|
|
| Nema dostupnih podataka, ili su dostupni podaci neadekvatni |
|
|
| ↓ |
|
|
2 | Izvršiti SAR procenu za iritaciju teško oštećenje oka | Predviđa se teško | Pretpostavlja se da je supstanca korozivna za oko. Dalja ispitivanja nisu potrebna. |
|
| ||
Predviđa se iritacija | Pretpostavlja se da je supstanca iritativna za oko. Dalja ispitivanja nisu potrebna. | ||
|
| ||
Izvršiti SAR procenu za korozivno oštećenje kože | Predviđa se korozivno oštećenje kože | Pretpostavlja se da je supstanca korozivna za oko. Dalja ispitivanja nisu potrebna. | |
| ↓ |
|
|
| Nije moguće predvideti ili su predviđanja negativna i nejasna |
|
|
| ↓ |
|
|
3 | Odrediti pH (po potrebi, razmotriti puferski) | pH ≤ 2 ili ≥ 11,5 (sa visokim puferskim kapacitetom, po potrebi) | Pretpostavlja se da je supstanca korozivna za oko. Dalja ispitivanja nisu potrebna. |
| ↓ |
|
|
| 2 < pH <11,5, ili pH ≤ 2,0 ili ≥ 11,5 sa malim bez puferskog kapaciteta, po potrebi |
|
|
| ↓ |
|
|
4 | Proceniti podatke koje se odnose na sistemsku toksičnost putem primene na kožu | Veoma toksično pri koncentracijama u kojima se ispituje na oku | Supstanca bi bila previše toksična za ispitivanje. Dalja ispitivanja nisu potrebna. |
| ↓ |
|
|
| Takvi podaci nisu dostupni ili supstanca nije veoma toksična |
|
|
5 | Izvršiti validirana i prihvaćena in vitro ili ex vivo ispitivanja teškog oštećenja oka | Korozivna reakcija | Pretpostavlja se da je supstanca korozivna za oko. Dalja ispitivanja nisu potrebna. |
| ↓ |
|
|
| Validirane in vitro ili ex vivo metode ispitivanja teškog oštećenja oka još nisu razvijene ili supstanca nema korozivni efekat |
|
|
| ↓ |
|
|
6 | Izvršiti validirana i prihvaćena in vitro ili ex vivo ispitivanja iritacije oka | Iritativna reakcija | Pretpostavlja se da je supstanca iritativna za oko. Dalja ispitivanja nisu potrebna. |
| ↓ |
|
|
| Validirane in vitro ili ex vivo metode ispitivanja iritacije oka još nisu razvijene ili supstanca nema iritativni efekat |
|
|
| ↓ |
|
|
7 | Eksperimentalno proceni potencijal in vitro iritacije korozivnog oštećenja kože | Korozivna ili jaka iritativna reakcija | Pretpostavlja se da je supstanca korozivna za oko. Dalja ispitivanja nisu potrebna. |
| ↓ |
|
|
| Supstanca ne dovodi do korozivnog oštećenja ili jake iritacije kože |
|
|
| ↓ |
|
|
8 | Izvršiti inicijalno in vivo ispitivanje oka na jednom kuniću | Teško oštećenje oka | Supstanca je korozivna za oko. |
| ↓ |
|
|
| Nema teških oštećenja ili nema reakcije |
|
|
| ↓ |
|
|
9 | Obaviti na jednoj ili dve dodatne životinje ispitivanje kojim se potvrđuje | Korozivno ili iritativno Nije korozivno ili iritativno | Supstanca je korozivna ili iritativna za oko. |
| Supstanca nije korozivna ili iritativna za oko. |
Napomene: Osetljivost i mogućnost ispitivanja kojim se određuje potencijal supstanci koje izazivaju senzibilizaciju kože kod ljudi, smatraju se važnim u sistemu klasifikacije na osnovu toksičnosti i važni su za javno zdravlje.
Ne postoji metoda ispitivanja koja na odgovarajući način identifikuje sve supstance koje izazivaju preosetljivost kože ljudi i koja je relevantna za sve supstance.
Činioci kao što su fizička svojstva supstance, uključujući njihovu sposobnost prodiranja u kožu, uzimaju se u obzir pri izboru odgovarajuće metode ispitivanja.
Razvijene su dve vrste metoda ispitivanja u kojima se koriste zamorci: metode ispitivanja sa adjuvansom u kojima se alergijska reakcija izaziva rastvaranjem ili suspendovanjem ispitivane supstance "Frojndovom kompletnom adjuvansu" (u daljem tekstu: FCA), i metode ispitivanja bez adjuvansa.
Metode ispitivanja sa adjuvansom su verovatno tačnije u predviđanju da supstanca kod ljudi izaziva senzibilizaciju kože, za razliku od metoda ispitivanja koje ne koriste FCA. Zbog ovoga se preporučuju metode ispitivanja sa adjuvansom.
Test maksimizacije na zamorcima (The Guinea-Pig Maximisation Test, u daljem tekstu: GMPT) je opšte prihvaćen test sa adjuvansom. Za otkrivanje potencijala izazivanja preosetljivosti neke supstance može se koristiti nekoliko različitih metoda ispitivanja, ali se preporučuje GMPT metoda ispitivanja sa adjuvansom.
U slučaju većine klasa hemikalija, eksperimentalne metode ispitivanja bez adjuvansa (prednost se daje Buehler testu) smatraju se manje osetljivim.
U određenim slučajevima postoji opravdan razlog za primenu Buehler testa u kome se ispitivana supstanca primenjuje topikalno, a ne u obliku intradermalne injekcije, kao što je slučaj u GMPT. Za korišćenje Buehler testa, potrebno je dati i naučno zasnovano obrazloženje.
GMPT i Buehler test dati su u ovoj metodi ispitivanja. Ostale metode ispitivanja koriste se ako su prethodno potvrđene i ako je njihovo korišćenje naučno opravdano.
Ako se u skrining testu dobije pozitivan rezultat, ispitivana supstanca se označava kao potencijalni uzročnik senzibilizacije. U tom slučaju ne nastavljaju se dalja ispitivanja na zamorcima. Ako se u skrining testu dobije negativan rezultat, ispitivanje na zamorcima se sprovodi koristeći postupke date u ovoj metodi.
Videti Opšti uvod.
Senzibilizacija kože (Alergijski kontaktni dermatitis) jeste imunološki posredovana, kožna reakcija na određenu supstancu. Kod ljudi odgovor može biti okarakterisan svrabom, crvenilom, otokom, papulama (bubuljicama), vezikulama (mehurićima), bulama (plikovima) ili njihovom kombinacijom. Kod drugih vrsta reakcije se mogu razlikovati, i mogu se javiti samo eritem ili edem.
Indukcija jeste eksperimentalno izlaganje jedinke ispitivanoj supstanci sa namerom izazivanja reakcije preosetljivosti.
Faza indukcije jeste vremenski period u trajanju od najmanje nedelju dana nakon indukcije tokom kojeg dolazi do razvoja reakcije preosetljivosti.
Provokacije jesu ponovljeno izlaganje ispitivanoj supstanci prethodno tretirane životinje nakon faze indukcije kako bi se odredilo da li jedinka razvija preosetljivost.
Osetljivost i pouzdanost eksperimentalne metode ispitivanja koja se koristi proverava se svakih šest meseci primenom supstanci za koje je poznato da imaju svojstvo blage do srednje senzibilizacije kože.
U dobro obavljenom ispitivanju, pozitivan odgovor od najmanje 30% kod metode ispitivanja sa adjuvansom ili 15% kod metode ispitivanja bez adjuvansa očekuje se za supstance koje izazivaju slabu do umerenu senzibilizaciju.
Preporučuju se sledeće supstance:
Tabela 1.
CAS broj | EINECS broj | EINECS nazivi | Uobičajeni nazivi |
101-86-0 | 202-983-3 | α-heksilcinamaldehid | α-heksilcinamaldehid |
149-30-4 | 205-736-8 | benzotiazol-2-tiol | kaptaks |
94-09-7 | 202-303-5 | benzokain | norkain |
Postoje okolnosti u kojima se mogu koristiti druge kontrolne supstance koje zadovoljavaju navedene kriterijume, ako se navede adekvatno opravdanje za njihovu upotrebu.
1.4. PRINCIP METODE ISPITIVANJA
Ispitivane životinje početno se izlažu ispitivanoj supstanci putem intradermalnih injekcija odnosno epidermalnom primenom (indukcija). Nakon perioda pauze u trajanju od 10 do 14 dana (nakon faze indukcije), tokom koga može doći do razvoja imunološkog odgovora, životinje se izlažu drugoj, ponovljenoj dozi. Stepen prouzrokovane reakcije na koži nakon provokacije kod eksperimentalnih životinja poredi se sa onom reakcijom kod životinja iz kontrolne grupe koje su bile podvrgnute lažnom tretmanu indukcije, i koje su bile podvrgnute provokaciji.
Ako je potrebno uklanjanje ispitivane supstance, ona se uklanja pomoću vode ili odgovarajućeg rastvarača tako da se ne utiče na nalaz na koži ili da se ne naruši integritet epidermisa.
1.5.1. Test maksimizacije na zamorcima (GMPT)
1.5.1.1. Priprema
Zdravi, mladi albino zamorci drže se radi privikavanja najmanje pet dana pre početka ispitivanja u eksperimentalnim uslovima. Pre ispitivanja, slučajnim odabirom životinja, formiraju se grupe za tretman. Uklanjanje dlake sa kože životinja vrši se šišanjem, brijanjem ili hemijskom depilacijom, u zavisnosti od primenjene metode ispitivanja. Pazi se da u proceduri ne dođe do oštećenja kože. Telesna masa životinja meri se pre početka ispitivanja i na kraju ispitivanja.
1.5.1.2. Uslovi ispitivanja
1.5.1.2.1. Eksperimentalne životinje
Koriste se uobičajene vrste albino zamoraca.
1.5.1.2.2. Broj i pol
Koriste se mužjaci ili ženke. Ako se koriste ženke, ispitivanje se vrši na ženkama koje nisu ranije rađale i koje nisu gravidne.
Minimum 10 životinja koristi se u tretiranoj grupi i najmanje 5 životinja u kontrolnoj grupi. Kada se koristi manje od 20 tretiranih i 10 kontrolnih zamoraca, i kada nije moguće zaključiti da li ispitivana supstanca dovodi do senzibilizacije, preporučuje se ispitivanje na dodatnim životinjama kako bi se dostigao ukupan broj od najmanje 20 tretiranih i 10 kontrolnih životinja.
1.5.1.2.3. Dozni nivoi
Koncentraciju ispitivane supstance koja se koristi za indukciju životinje treba dobro da podnose u smislu sistemskih efekata, i treba da bude najveća moguća doza koje će dovesti do slabe ili srednje izražene iritacije kože. Koncentracija koja se koristi za provokaciju treba da bude najveća moguća koja ne dovodi do iritacije kože. Odgovarajuće koncentracije najbolje je odrediti u pilot ispitivanju na dve ili tri životinje, ako drugi podaci nisu dostupni. U ovu svrhu, može se razmotriti i korišćenje FCA-tretiranih životinja.
1.5.1.3. Postupak
1.5.1.3.1. Indukcija
Dan 0 - tretirana grupa:
Tri para intradermalnih injekcija zapremine 0,1 mL daju se u području ramenog regiona koje je prethodno obrijano tako da se po jedna injekcija primeni sa svake strane tela.
Injekcija 1: 1:1 smeša (v/v) FCA/voda ili fiziološki rastvor.
Injekcija 2: ispitivana supstanca u određenoj koncentraciji u odgovarajućem vehikulumu.
Injekcija 3: ispitivana supstanca u određenoj koncentraciji pripremljena kao 1:1 smeša (v/v) FCA/voda ili fiziološki rastvor.
U injekciji 3 supstance rastvorljive u vodi rastvaraju se u vodenoj fazi pre mešanja sa FCA. Supstance rastvorljive u lipidnoj fazi ili potpuno nerastvorne suspenduju se u FCA pre mešanja sa vodenom fazom. Završna koncentracija ispitivane supstance mora biti jednaka onoj korišćenoj u injekciji 2.
Injekcije 1 i 2 daju se jedna pored druge blizu glave, dok se injekcija 3 daje u ivični deo ispitivane površine.
Dan 0 - kontrolna grupa:
Tri para intradermalnih injekcija zapremine 0,1 mL daju se u isto područje kao kod tretiranih životinja.
Injekcija 1: 1:1 smeša (v/v) FCA/voda ili fiziološki rastvor.
Injekcija 2: nerazređeno pomoćno sredstvo.
Injekcija 3: 50% m/v formulacija vehikuluma u 1:1 smeši (v/v) FCA/voda ili fiziološki rastvor.
Dan 5-7 - tretirane i kontrolne grupe:
Ako ispitivana supstanca nije iritans, nakon šišanja odnosno brijanja i to otprilike 24 sata pre topikalne primene, na površinu kože nanosi se 0,5 mL 10% natrijum lauril sulfata u vazelinu, kako bi se izazvala lokalna iritacija kože.
Dan 6-8 - tretirana grupa:
Sa tretiranog dela kože ponovo se uklanja dlaka. Na filter papir veličine 2 cm x 4 cm nanese se u debelom sloju ispitivana supstanca rastvorena u odgovarajućem vehikulumu i drži u kontaktu sa kožom uz pomoć okluzivnog zavoja narednih 48 sati. Izbor vehikuluma potrebno je obrazložiti. Čvrste supstance se pre primene usitne do praha i suspenduju u odgovarajućem vehikulumu. Tečnosti se mogu primeniti i nerazblažene.
Dan 6-8 - kontrolna grupa:
Sa površine kože koja se ponovno tretira uklanja se dlaka. Zatim se samo vehikulum, bez ispitivane supstance, nanosi na kožu uz pomoć okluzivnog zavoja i drži u kontaktu sa kožom narednih 48 sati.
1.5.1.3.2. Provokacija
Dan 20-22 - tretirane i kontrolne grupe:
Sa bokova životinja iz tretiranih i kontrolnih grupa uklanja se dlaka. Na jedan bok svake životinje nanosi se obloga dobro natopljena ispitivanom supstancom, a na drugi bok obloga natopljena vehikulumom. Obloge se drže u kontaktu sa kožom naredna 24 sata pomoću okluzivnog zavoja.
1.5.1.3.3. Posmatranja i ocenjivanje: tretirane i kontrolne grupe
Približno 21 sat nakon uklanjanja obloga sa mesta provokacije, koža na tom mestu se, po potrebi, čisti i ponovo brija ili depilira.
Približno 3 sata kasnije (48 sati od početka provokacije) posmatraju se reakcije na koži i ocenjuju prema kriterijumima i ocenama datim u Delu drugom ove metode.
Približno 24 sata nakon prve ocene (nakon ukupno 72 sata) obavlja se i drugo posmatranje reakcija na koži i beleži se ocena.
Preporučuje se nasumično ocenjivanje životinja iz tretiranih i kontrolnih grupa.
Ako je potrebno pojasniti rezultate dobijene nakon prve provokacije, može se obaviti i druga provokacija, i to nakon približno nedelju dana, sa odgovarajućom novom kontrolnom grupom. Druga provokacija može se obaviti i na životinjama iz originalne kontrolne grupe. Sve reakcije na koži kao i neuobičajeni nalazi, uključujući sistemske reakcije, koji su posledica indukcije ili provokacije ispitivanom supstancom beleže se i ocenjuju prema Magnusson/Kligman skali (videti Deo drugi ove metode). Drugi postupci, kao što su histopatološka ispitivanja, merenja debljine kože i sl., mogu se obaviti kako bi se razjasnile nedovoljno jasne reakcije.
1.5.2. Buehler test
1.5.2.1. Priprema
Zdravi, mladi albino zamorci drže se radi privikavanja najmanje pet dana pre početka ispitivanja u eksperimentalnim uslovima. Pre ispitivanja, nasumičnim odabirom, životinje se razvrstavaju u grupe za tretman. Uklanjanje dlake sa kože životinja vrši se šišanjem, brijanjem ili hemijskom depilacijom, u zavisnosti od primenjene metode ispitivanja. Pazi se da ne dođe do oštećenja kože. Telesna masa životinja meri se pre početka ispitivanja i na kraju ispitivanja.
1.5.2.2. Uslovi ispitivanja
1.5.2.2.1. Eksperimentalne životinje
Koriste se već uobičajene vrste albino zamoraca.
1.5.2.2.2. Broj i pol
Koriste se mužjaci ili ženke. Ako se koriste ženke, ispitivanje se vrši na ženkama koje nisu ranije rađale i koje nisu gravidne.
Minimum 20 životinja koristi se u tretiranoj grupi i najmanje 10 životinja u kontrolnoj grupi.
1.5.2.2.3. Dozni nivoi
Koncentracija ispitivane supstance koja se koristi pri indukciji mora biti najveća moguća koja će prouzrokovati blagu, ali ne prekomernu iritaciju kože. Koncentracija koja se koristi za provokaciju mora biti najveća koncentracija koja ne izaziva iritaciju kože. Ako je potrebno, odgovarajuća koncentracija može se odrediti iz probnog ispitivanja na dve ili tri životinje.
U slučaju ispitivanih supstanci koje su rastvorljive u vodi, najbolje je koristiti vodu ili razblaženi nenadražujući surfaktant kao vehikulum. U slučaju drugih ispitivanih supstanci za indukciju preporučuje se korišćenje smeše 80% etanol/voda, a za provokaciju aceton.
1.5.2.3. Postupak
1.5.2.3.1. Indukcija
Dan 0 - tretirana grupa:
Sa jednog boka životinje šišanjem se uklanja dlaka. Sistem "patch" testa treba da bude pripremljen sa ispitivanom supstancom rastvorenom u odgovarajućem vehikulumu (izbor vehikuluma potrebno je obrazložiti; ispitivane supstance u tečnom stanju mogu se primeniti i nerazblažene).
"Patch" sistem sa ispitivanom supstancom primenjuje se na površinu kože uz pomoć okluzivnog zavoja i drži u kontaktu s kožom narednih 6 sati.
U ovoj vrsti ispitivanja koristi se okluzivni zavoj, a kao obloga može poslužiti okrugao ili kvadratni komadić pamučne gaze, površine 4 cm2 - 6 cm2. Kako bi se sprečilo da životinja skine oblogu, može se na mesto primene staviti odgovarajuća prepreka ili dodatni zavoj. U slučaju korišćenja dodatnog zavoja, možda će biti potrebno ponoviti tretman.
Dan 0 - kontrolna grupa:
Sa jednog boka životinje brija se koža. Na oblogu se nanosi samo vehikulum koje se potom pomoću zavoja drži u kontaktu sa kožom narednih 6 sati, kao i u slučaju životinja iz ispitivane grupe.
Dani 6-8 i 13-15 - tretirane i kontrolne grupe:
Na dane 6-8 i 13-15 primena ispitivane supstance obavlja se na istom mestu na boku životinje kao i na dan 0 (po potrebi, dlaka se ponovno uklanja).
1.5.2.3.2. Provokacija
Dani 27-29 - tretirane i kontrolne grupe:
Sa netretiranog boka životinja iz ispitivane i kontrolne grupe brijanjem se uklanja dlaka. Na tako pripremljen deo kože stavlja se okluzivni zavoj sa oblogom na koji je prethodno naneta odgovarajuća količina ispitivane supstance u najvećoj mogućoj koncentraciji koja neće izazvati iritaciju kože.
Kada je neophodno, okluzivni zavoj koji sadrži samo vehikulum takođe se nanosi na kožu netretiranog boka životinja iz ispitivane i kontrolne grupe. Obloge se drže u kontaktu s kožom narednih 6 sati.
1.5.2.3.3. Posmatranje i stepenovanje
Približno 21 sat nakon uklanjanja obloge sa mesta provokacije uklanja se dlaka sa kože na tom mestu.
Približno 3 sata kasnije (tj. približno 30 sati nakon provokacije) posmatraju se reakcije na koži i ocenjuju prema kriterijumima i ocenama datim u Delu drugom ove metode.
Otprilike 24 sata nakon prve ocene (približno 54 sata nakon provokacije) obavlja se i drugo posmatranje reakcija na koži, i beleže ocene.
Preporučuje se nasumično ocenjivanje životinja iz tretiranih i kontrolnih grupa.
Ako je potrebno dodatno pojasniti rezultate dobijene nakon prve provokacije, obavlja se i druga provokacija, i to nakon približno nedelju dana, sa odgovarajućom novom kontrolnom grupom.
Druga provokacija može se obaviti i na životinjama iz originalne kontrolne grupe.
Sve reakcije na koži kao i neuobičajeni nalazi, uključujući sistemske reakcije koje su posledica indukcije ili provokacije ispitivanom supstancom beleže se i ocenjuju prema Magnusson/Kligman skali (videti Deo drugi ove metode). Drugi postupci, kao što su histopatološka ispitivanja, merenja debljine kože i sl., mogu se obaviti kako bi se objasnile nedovoljno jasne reakcije.
2. PODACI (GPMT i Buehler test)
Podaci se prikazuju tabelarno. Za svaku životinju navode se uočene reakcije na koži pri svakom posmatranju.
3. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU (GPMT i Buehler test)
Ako se skrining ispitivanje obavlja pre ispitivanja na zamorcima, daje se opis obavljenog ispitivanja ili se poziva na preporuku (Mouse Ear Swelling Test, MEST) i iznose se detalji postupka zajedno sa rezultatima dobijenim u sklopu ispitivanja obavljenih sa ispitivanom i referentnom supstancom.
Pisanje izveštaja (GPMT i Buehler test)
Izveštaj o ispitivanju sadrži:
1. Podatke o eksperimentalnim životinjama:
- soj zamoraca;
- broj, starost i pol životinja;
- poreklo, uslove smeštaja, ishrane, itd.;
- telesnu masu pojedinačnih životinja na početku ispitivanja.
2. Podatke o uslovima ispitivanja:
- način pripreme kože;
- detaljan opis pripreme flastera i obloga;
- rezultate probnog ispitivanja sa zaključkom o koncentracijama koje će se koristiti za indukciju i provokaciju;
- detalje pripreme ispitivane supstance, njene primene na kožu i uklanjanja;
- obrazloženje za izbor vehikuluma;
- koncentracije ispitivane supstance i vehikuluma za indukciju i provokaciju, kao i ukupnu količinu primenjene ispitivane supstance u indukciji i provokaciji.
3. Rezultate:
- kratak pregled rezultata posljednjeg ispitivanja senzibilizacije i pouzdanosti (videti odeljak 1.3. ove metode) uključujući podatke o ispitivanoj supstanci, koncentraciji i vehikulumu;
- pojedinačno prikazane za svaku životinju uključujući i sistem ocenjivanja;
- opis vrste i stepena ozbiljnosti uočenih efekata na koži;
- sve histopatološke nalaze.
4. Tumačenje rezultata.
5. Zaključke.
Ova metoda ispitivanja potpuno odgovara metodi OECD: TG 406.
MAGNUSSON/KLIGMAN SKALA ZA OCENU REAKCIJA USLED PROVOKACIJE ISPITIVANOM SUPSTANCOM "PATCH" TESTOM
0 nema vidljivih promena
1 diskretan ili mestimičan (nehomogen) eritem
2 srednje izražen i raširen eritem
3 izražen eritem i otok
B.7. AKUTNA (ORALNA) TOKSIČNOST (28 DANA) - PONOVLJENE DOZE
Videti Opšti uvod.
Videti Opšti uvod.
1.3. PRINCIP METODE ISPITIVANJA
Ispitivana supstanca primenjuje se peroralno u rastućim dozama na nekoliko različitih grupa eksperimentalnih životinja. Na jednu grupu životinja primenjuje se jedna doza tokom 28 dana. Tokom primene ispitivane supstance životinje se posmatraju svakodnevno kako bi se zabeležili znakovi toksičnosti. Životinje koje uginu tokom ispitivanja podvrgavaju se postmortalnom pregledu, a na kraju eksperimenta i preživele životinje se žrtvuju i podvrgavaju postmortalnom pregledu.
Ova metoda ispitivanja stavlja veći naglasak na neurološke efekte i potrebu za pažljivim kliničkim posmatranjem životinja kako bi se prikupilo što više podataka. Metoda ispitivanja je razvijena kako bi omogućila identifikaciju hemikalija s neurotoksičnim potencijalom, koje zahtevaju dodatna ispitivanja ovog aspekta. Pored toga, metoda ispitivanja može ukazivati i na imunološke efekte ispitivane supstance kao i na toksičnost po reprodukciju.
1.4.1. Priprema
Zdrave mlade odrasle jedinke nasumično se grupišu u ispitivane i kontrolnu grupu. Kavezi treba da budu takvi da se mogući efekti smeštaja svedu na minimum. Životinje se obeležavaju i drže u kavezima najmanje pet dana pre početka ispitivanja kako bi se prilagodile na laboratorijske uslove.
Ispitivana supstanca dozira se ili putem hrane ili putem vode za piće ili direktno, sondom u želudac. Metoda oralne primene zavisi od cilja studije i od fizičko-hemijskih svojstava supstance.
Kada je potrebno ispitivana supstanca se rastvara ili suspenduje u odgovarajućem vehikulumu. Preporučuje se, kad god je moguće, primena vodenog rastvora/suspenzije, a tek zatim rastvora ili emulzije u ulju (npr. kukuruznom ulju) ili nekom drugom sredstvu. Ako se koristi vehikulum koje nije voda, kod tumačenja rezultata uzimaju se u obzir i potencijalni toksični efekti tog vehikuluma. Potrebno je odrediti i stabilnost ispitivane supstance u vehikulumu.
1.4.2. Uslovi ispitivanja
1.4.2.1. Eksperimentalne životinje
Preporučuje se korišćenje mladih, zdravih pacova i to sojeva koji se najčešće koriste u laboratorijskim eksperimentima. Moguće je koristiti i druge glodare. Ispitivanje se vrši na ženkama koje nisu ranije rađale i koje nisu gravidne. Doziranje je najbolje započeti odmah nakon prestanka sisanja, a u svakom slučaju pre nego što životinje navrše devet nedelja.
Na početku ispitivanja raspon telesnih masa pojedinačnih životinja ne treba da prelazi ± 20% od srednje vrednosti za svaki pol.
Kada se ispitivanje sa ponovljenim oralnim dozama obavlja kao prethodno za dugoročne studije, životinje istog soja i iz istog izvora trebalo bi koristiti u oba ispitivanja.
1.4.2.2. Broj i pol
Najmanje 10 životinja (pet ženki i pet mužjaka) koristi se za svaki dozni nivo. Ako se u toku eksperimenta planiraju privremena žrtvovanja, broj životinja u eksperimentu povećava se za broj koji se planira da se žrtvuje u toku ispitivanja.
Dodatno, prateća grupa od 10 životinja (po pet svakog pola) može se izlagati visokim dozama ispitivane supstance u periodu od 28 dana, kako bi se 14 dana nakon tretmana zabeležila reverzibilnost, postojanost ili odložena pojava toksičnih efekata. Potrebno je uključiti i grupu od 10 kontrolnih životinja (ponovo po pet životinja svakog pola).
1.4.2.3. Dozni nivoi
Koristite se najmanje tri tretirane grupe, zajedno sa istovremenom kontrolnom grupom. Osim što se životinjama u kontrolnim grupama ne daje ispitivana supstanca, postupanje sa životinjama mora biti identično kao sa životinjama iz tretiranih grupa. Ako je korišćen vehikulum, kontrolna grupa treba da dobije vehikulum u najvećoj korišćenoj zapremini.
Ako se procenom postojećih podataka, za ispitivanu supstancu u koncentraciji od 1.000 mg/kg TM/dan, ne očekuju nikakvi efekti, preporučuje se obavljanje ispitivanja granične doze. Ako ne postoje odgovarajući podaci za takvu procenu, može se sprovesti ispitivanje sa ciljem određivanja doza koje će se primeniti.
Doze ispitivane supstance biraju se uzimajući u obzir toksikološke ili toksikokinetičke podatke koji već postoje za ispitivanu supstancu ili strukturno slične supstance. Najveća doza bira se tako da izazove toksični efekat, ali ne i smrt ili tešku patnju životinja. Potom se redom biraju opadajuće koncentracije sa ciljem demonstriranja efekata vezanih za primenjenu dozu sve dok se ne dođe do doze bez štetnog efekta, tj. "no-observed-adverse-effects-level" (NOAEL). Doze se smanjuju progresivno za faktor dva do četiri puta, a dodatak četvrte ispitivane doze preporučuje se umesto korišćenja veoma velikih intervala (npr. većih od faktora 10) između doza.
Za supstance koje se doziraju putem hrane ili vode za piće, važno je prethodno proveriti da količina ispitivane supstance dodata u obrok ne utiče štetno na ishranu ili ravnotežu vode. Kada se ispitivana supstanca dodaje hrani, ona se primenjuje ili u konstantnoj koncentraciji (ppm) ili u konstantnoj dozi izraženoj u jedinicama po telesnoj masi životinje. U svakom slučaju potrebno je propisati odabrani način doziranja. Ako se supstanca primenjuje putem sonde u želudac, doziranje se obavlja približno u isto vreme svaki dan, i podešava se po potrebi kako bi se održao konstantan dozni nivo u odnosu na telesnu masu životinje.
Kada se ispitivanje sa ponovljenom dozom obavlja kao prethodno za dugotrajne studije, potrebno je u oba ispitivanja koristiti sličnu ishranu.
1.4.2.4. Ispitivanje granične doze
Ako ispitivanje doze od 1.000 mg/kg TM/dan, ili ekvivalentne doze u slučaju primene putem vode za piće ili hrane (preračunato iz vrednosti za telesnu masu) ne dovodi ni do kakvih toksičnih efekata, i ako se toksični efekti ne očekuju iz podataka za strukturno slične supstance, nije potrebno obaviti kompletno ispitivanje sa sve tri doze. Ispitivanja granične doze primenjuje se u svim slučajevima, osim u onim gde predviđena izloženost ispitivanoj supstanci kod ljudi ne zahteva primenu veće doze.
1.4.2.5. Vreme posmatranja
Vreme posmatranja je 28 dana. Životinje iz prateće grupe koje su predviđene za naknadna posmatranja zadržavaju se još najmanje dodatnih 14 dana bez tretmana kako bi se uočila postojanost toksičnih efekata, odložena pojava efekata ili oporavak od istih.
1.4.3. Postupak
Životinje se doziraju sa ispitivanom supstancom svaki dan, sedam dana u nedelji, tokom perioda od 28 dana, a primena petodnevnog režima doziranja mora se dodatno obrazložiti. U slučaju doziranja putem sonde, ispitivana supstanca se primenjuje u jednoj dozi direktno u želudac, nakon intubiranja. Maksimalna zapremina tečnosti koji se može u jednom doziranju primeniti zavisi od veličine eksperimentalne životinje. Zapremina ne sme da pređe 1 mL/100 g TM životinje, izuzev u slučajevima kad se koriste vodeni rastvori i kada je dozvoljeno primeniti 2 mL/100 g TM životinje. Variranje zapremine ispitivane supstance potrebno je minimizirati prilagođavanjem koncentracije za svaku dozu, kako bi se obezbedila primena istih zapremina pri svim doznim nivoima.
1.4.3.1. Opšta posmatranja
Klinička posmatranja životinja obavljaju se najmanje jednom dnevno, ako je moguće u isto vreme svakog dana uzimajući u obzir očekivano vreme maksimalnog efekta nakon doziranja. Beleži se i zdravstveno stanje životinja. Najmanje dva puta dnevno vodi se beleška o smrtnosti ili životinjama na samrti. Životinje na samrti ili životinje koje trpe izrazitu patnju i bol uklanjaju se iz daljeg ispitivanja žrtvovanjem, i podvrgavaju se postmortalnom pregledu.
Jedanput pre inicijalnog izlaganja ispitivanoj supstanci (kako bi se omogućilo poređenje unutar grupe životinja), i najmanje jednom nedeljno nakon toga, obavljaju se detaljna klinička posmatranja svih životinja. Ova posmatranja najbolje je obaviti izvan kaveza u kome se životinja inače nalazi, i, ako je moguće, svaki put u isto vreme. Nalazi se pažljivo beleže i pomoću sistema ocenjivanja koji je definisala laboratorija koja vrši ispitivanja. Promene u uslovima ispitivanja treba da budu minimalne, a nalaze da beleže objektivni posmatrači koji nisu upućeni u detalje ispitivanja na životinjama. Beleže se promene na koži, krznu, očima, sluznici, kao i pojava sekreta/izlučevina i obeležja autonomne aktivnosti (npr. suzenje, piloerekcija, veličina zenice, neuobičajen način disanja). Potrebno je posmatrati i promene u hodu, držanju ili promene uzrokovane rukovanjem životinjama, kao i prisutnost toničko-kloničnih pokreta i stereotipnog ponašanja (npr. preterano čišćenje, hodanje u krug) ili bizarnog ponašanja (npr. samopovređivanje, hodanje unazad).
U četvrtoj nedelji izlaganja ispitivanoj supstanci utvrđuje se reagovanje životinja na spoljne nadražaje različite prirode (npr. auditorne, vizuelne, proprioceptivne), procenu jačine stiska, i motornu aktivnost. Detalji o preporučenim postupcima dati su u literaturi (videti Opšti uvod).
Funkcionalna posmatranja obavljena u četvrtoj nedelji izlaganja mogu se izbeći kad se ispitivanje obavlja kao prethodna studija subhroničnom (90-dnevnom) ispitivanju. U tom slučaju, funkcionalna posmatranja mogu biti deo ovog dugotrajnijeg ispitivanja. S druge strane, dostupnost podataka o funkcionalnim posmatranjima izvedenih iz ispitivanja sa ponavljanim dozama omogućava lakši izbor doza za naknadno subhronično ispitivanje.
Izuzetno, funkcionalna posmatranja se mogu izbeći kod onih grupa životinja koje pokazuju znakove toksičnosti u meri koja značajno ometa obavljanje funkcionalnog ispitivanja.
1.4.3.2. Telesna masa i potrošnja hrane/vode
Telesna masa svih životinja meri se najmanje jednom nedeljno. Potrošnja hrane i vode beleži se najmanje jednom nedeljno. Ako se ispitivana supstanca daje putem vode za piće, mora se voditi evidencija o potrošnji vode i to najmanje jedanput nedeljno.
1.4.3.3. Hematološka ispitivanja
Na kraju ispitivanja potrebno je uraditi sledeća hematološka ispitivanja: odrediti hematokrit, koncentraciju hemoglobina, broj eritrocita, broj ukupnih i diferenciranih leukocita, broj trombocita, kao i koagulabilnost.
Uzorci krvi uzimaju se sa određenog mesta neposredno pre ili za vreme žrtvovanja životinja, i čuvaju pod odgovarajućim uslovima.
1.4.3.4. Kliničko-biohemijska ispitivanja
Kliničko-biohemijska ispitivanja krvi obavljaju se sa ciljem ispitivanja toksičnih efekata u tkivima, posebno u jetri i bubrezima, i to na uzorcima krvi svih eksperimentalnih životinja neposredno pre ili za vreme njihovog žrtvovanja (osim onih koje su već pronađene mrtve ili koje su žrtvovane u međuvremenu). Pre uzimanja uzoraka krviXXXVIII preporučuje se uskraćivanje hrane životinjama preko noći. Ispitivanja u plazmi ili serumu uključuju i određivanje natrijuma, kalijuma, glukoze, ukupnog holesterola, uree, kreatinina, ukupnih proteina i albumina, i aktivnosti najmanje dva enzima kao indikatora hepatocelularnih efekata (kao što su: alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza, alkalna fosfataza, gama glutamil transpeptidaza i sorbitol dehidrogenaza). Mogu se obaviti i merenja aktivnosti drugih enzima (enzimi jetre ili nekog drugog porekla) kao i žučnih kiselina što može pod određenim okolnostima obezbediti korisne informacije.
Neobavezno, tokom poslednje nedelje ispitivanja, mogu se obaviti i sledeći pregledi urina sakupljenog u određenom vremenu: odrediti izgled, zapreminu, osmolalnost ili specifičnu gustinu, pH, proteine, glukozu i prisutnost krvi/krvnih ćelija u urinu.
Razmatra se mogućnost određivanja serumskih markera koji ukazuju na opšte oštećenje tkiva. Ako se sumnja da ispitivana supstanca deluje na metaboličke procese, obavljaju se i druga određivanja, kao što su određivanje koncentracije kalcijuma, fosfora, triglicerida, nivoa specifičnih hormona, methemoglobina, i aktivnost holinesteraze. Svi ovi parametri određuju se pri ispitivanju hemikalija iz određenih klasa, tj. u određenim slučajevima.
Preporučuje se fleksibilan pristup koji zavisi od vrste ispitivane životinje odnosno očekivanog efekta date supstance.
Ako ne postoje adekvatni podaci o kontrolnim vrednostima parametara iz prethodnih ispitivanja, razmatra se potreba za određivanjem hematoloških i kliničko-biohemijskih parametara i pre nego što se započne sa doziranjem ispitivane supstance.
_______________
XXXVIII Za određivanje brojnih parametara iz seruma i plazme, a najviše za određivanje glukoze, preporučuje se gladovanje preko noći. Glavni razlog tome je značajno veća varijacija vrednosti kao posledica uzimanja hrane koja bi mogla da maskira suptilne efekte i oteža tumačenje rezultata.
S druge strane, gladovanje preko noći može uticati na opšti metabolizam životinja i, posebno u slučaju davanja ispitivane supstance putem hrane, poremetiti dnevnu izloženost ispitivanoj supstanci. Ako se usvoji gladovanje preko noći, kliničko-biohemijska ispitivanja potrebno je obaviti nakon izvođenja funkcionalnih posmatranja u četvrtoj nedelji ispitivanja.
1.4.3.5. Postmortalni pregled
Sve životinje koje se koriste u ispitivanju podvrgavaju se detaljnom postmortalnom pregledu, koja uključuje pažljiv pregled spoljašnje površina tela, uključujući sve otvore, lobanju, grudnu i trbušnu duplju. Jetru, bubrege, nadbubrežne žlezde, testise, semenike, timus, slezenu, mozak i srce svih životinja potrebno je odvojiti od okolnog tkiva, i što je pre moguće, vlažne izmeriti odmah nakon sekcije kako bi se izbeglo sušenje.
Sledeće vrste tkiva čuvaju se u medijumu za fiksiranje radi naknadnog izvođenja histopatoloških pregleda: sva vidljivo oštećena tkiva, mozak (reprezentativne regije, uključujući veliki mozak, mali mozak i produženu moždinu), kičmena moždina, želudac, tanko i debelo crevo (uključujući Pajerove ploče), jetra, bubrezi, nadbubrežne žlezde, slezina, srce, timus, štitna žlezda, dušnik, pluća (ubrizgavanjem fiksatora pa potom uranjanjem u isti medijum), polne žlezde, pomoćni polni organi (npr. materica, prostata), mokraćna bešika, limfni čvorovi (po mogućnosti, jedan uzet sa puta unosa ispitivane supstance u organizam, i drugi, udaljen od njega kako bi se proučili sistemski efekti), periferni nerv (n. ischiadicus ili n. tibialis), po mogućstvu smešten uz sam mišić, i isečak kostne srži (ili svež aspirat kostne srži). Klinički i drugi nalazi mogu uputiti na potrebu za ispitivanjem i drugih tkiva. Čuvaju se i svi organi koji se na osnovu saznanja o svojstvima ispitivane supstance smatraju ciljnim.
1.4.3.6. Histopatološka ispitivanja
Kompletna histopatološka ispitivanja obavljaju se na sačuvanim organima i tkivima svih životinja iz kontrolne grupe, i grupe izložene visokoj dozi ispitivane supstance. Ako se primete promene kod životinja na koje je primenjena visoka doza ispitivane supstance, histopatološka ispitivanja se obavljaju i na životinjama iz svih ostalih grupa.
Ispituju se sve veće (makroskopski vidljive) lezije.
Ako je korišćena pomoćna grupa, histopatološkoj obradi se podvrgavaju tkiva i organi na kojima su se kod tretiranih životinja primetile neke promene.
Za svaku životinju vode se posebni podaci. Podaci se prikazuju tabelarno gde se za svaku ispitivanu grupu životinja navodi broj životinja na početku ispitivanja, broj životinja koje su uginule ili su žrtvovane iz humanih razloga za vreme ispitivanja (zajedno sa vremenom žrtvovanja), kao i broj životinja kod kojih su pronađeni znakovi toksičnosti. Daje se i detaljan opis uočenih znakova toksičnosti, vreme kada su primećeni, njihovo vreme trajanja i stepen izraženosti, kao i broj životinja kod kojih su primećene lezije zajedno sa opisom tipa lezija i procentom životinja kod kojih su pronađene.
Kada je moguće, svi rezultati se analiziraju pomoću odgovarajuće statističke metode, koju je najbolje odabrati još u vreme planiranja ispitivanja.
Izveštaj o ispitivanju sadrži:
1. Podatke o eksperimentalnim životinjama:
- vrstu/soj;
- broj, starost i pol životinja;
- poreklo životinja, uslove smeštaja, ishrane itd.;
- individualne telesne mase životinja na početku ispitivanja, kasnije u nedeljnim intervalima i na kraju ispitivanja.
2. Podatke o uslovima ispitivanja:
- obrazloženje za izbor pomoćnog sredstva, ako se ne radi o vodi;
- razloge za izbor doze/koncentracije ispitivane supstance;
- detalje o formulaciji ispitivane supstance, ishrani, postignutoj koncentraciji ispitivane supstance, stabilnosti i homogenosti pripremljene formulacije;
- detalje o načinu primene ispitivane supstance;
- ukoliko je primenljivo, preračunavanja koncentracije ispitivane supstance primenjene hranom ili putem vode (ppm) na dozu (mg/kg TM/dan);
- detalje o kvalitetu hrane i vode.
3. Rezultate:
- telesnu masu/promene u telesnoj masi;
- konzumiranje hrane i vode;
- podatke o zabeleženim toksičnim efektima prikazane po polu i primenjenoj dozi ispitivane supstance;
- podatke o prirodi, težini i trajanju kliničkih promena (da li su reverzibilne ili nisu);
- procenu senzorne aktivnosti, jačina stiska i motorne aktivnosti;
- rezultate hematoloških ispitivanja, sa relevantnim kontrolnim vrednostima;
- rezultate kliničko-biohemijskih ispitivanja sa relevantnim kontrolnim vrednostima;
- telesnu masu pre žrtvovanja i masu pojedinačnih organa;
- nalaze postmortalnog pregleda;
- detaljan opis svih histopatoloških nalaza;
- podatke o apsorpciji;
- statističku obradu rezultata, tamo gde je odgovarajuće.
4. Tumačenje rezultata.
5. Zaključke.
Ova metoda ispitivanja oralne toksičnosti potpuno odgovara metodi OECD: TG 407.
B.8. AKUTNA (INHALACIONA) TOKSIČNOST (28 DANA) - PONOVLJENE DOZE
Korisno je imati prethodne podatke o svojstvima ispitivane supstance kao što su: raspodela veličine čestica, pritisak pare, tačka topljenja, tačka ključanja, tačka paljenja i eksplozivnost (ako se radi o eksplozivnoj supstanci).
Videti Opšti uvod, Deo A.
Vidi Opšti uvod, Deo B.
Nisu propisane.
1.4. PRINCIP METODE ISPITIVANJA
Grupe eksperimentalnih životinja dnevno se izlažu rastućim koncentracijama ispitivane supstance tokom vremenskog perioda od 28 dana. Svaka grupa životinja izlaže se jednoj koncentraciji. Kada je neophodno, koristi se i vehikulum koji omogućava postizanje odgovarajuće koncentracije ispitivane supstance u atmosferi. Za vehikulum se određuje i dodatna kontrolna grupa. Životinje se posmatraju svaki dan tokom vremena izlaganja ispitivanoj supstanci kako bi se uočili znakovi toksičnosti. Životinje koje uginu za vreme eksperimenta podvrgavaju se postmortalnom pregledu, a po završetku eksperimenta i preživele životinje se žrtvuju i postmortalno pregledaju.
Nisu propisani.
1.6.1. Priprema
Životinje se drže u eksperimentalnim uslovima i hrane po definisanom eksperimentalnom režimu najmanje pet dana pre početka ispitivanja. Pre ispitivanja zdrave mlade jedinke nasumce se grupišu u prethodno definisan broj eksperimentalnih grupa. Kada je neophodno, dodaje se vehikulum koji omogućava postizanje odgovarajuće koncentracije ispitivane supstance u atmosferi. Odabrani vehikulum ne sme biti toksičan, što može da se potvrdi navodima postojeće literature.
1.6.2. Uslovi ispitivanja
1.6.2.1. Eksperimentalne životinje
Ako ne postoje kontraindikacije, preporučuje se korišćenje pacova i to sojeva koji se najčešće koriste u laboratorijskim ispitivanjima.
Na početku ispitivanja, raspon telesnih masa pojedinačnih životinja ne sme da pređe ± 20% od srednje vrednosti.
1.6.2.2. Broj i pol
Najmanje 10 glodara (pet ženki i pet mužjaka) koristi se za svaku ispitivanu koncentraciju. Ženke moraju biti takve da nisu ranije rađale i da nisu gravidne. Ako se u toku ispitivanja planiraju prevremena žrtvovanja, broj životinja u ispitivanju povećava se za broj koji je planiran za žrtvovanje u toku ispitivanja. Prateća grupa od deset životinja (po pet životinja svakog pola) može se izlagati visokim koncentracijama ispitivane supstance u periodu od 28 dana, kako bi se 14 dana nakon tretmana zabeležile reverzibilnost, postojanost ili vremenski odložena pojava toksičnih efekata. Ukoliko se obavlja ovo posmatranje, uključuje se pomoćna grupa od 10 kontrolnih životinja (po pet svakog pola).
1.6.2.3. Koncentracije
Koriste se najmanje tri koncentracije ispitivane supstance, zajedno sa odgovarajućim kontrolama (ako se koristi vehikulum, druga kontrola sadrži vehikulum u najvećoj datoj koncentraciji). Osim primene ispitivane supstance, sa životinjama u kontrolnim grupama postupa se na isti način kao sa životinjama iz ispitivanih grupa. Najveća koncentracija ispitivane supstance treba da izazove toksične efekte, ali bez ili sa minimalnim brojem uginulih životinja. Najniža koncentracija ne treba da izazove toksične efekte. Kada je moguće predvideti izloženost ispitivanoj supstanci kod ljudi, najniža koncentracija primenjena na životinje treba da bude malo viša od ove vrednosti. Idealno, srednja koncentracija ispitivane supstance treba da izazove minimalne toksične efekte. Ako se koristi nekoliko srednjih koncentracija, tada njihove vrednosti treba da budu pravilno razmaknute kako bi se postigla gradacija toksičnih efekata. U grupama kod kojih su primenjene niske ili srednje koncentracije ispitivane supstance, kao i u kontrolnim grupama, učestalost smrtnih slučajeva kod životinja treba da bude niska kako bi interpretacija rezultata imala smisla.
1.6.2.4. Dužina izlaganja
Trajanje izlaganja tokom jednog dana je šest sati. Drugi vremenski intervali mogu se definisati po potrebi.
1.6.2.5. Oprema
Životinje se podvrgavaju ispitivanju pomoću opreme kojom se može održavati konstantni protok vazduha sa najmanje 12 potpunih izmena u jednom satu, kako bi se obezbedila odgovarajuća koncentracija kiseonika i ravnomerno raspoređena atmosfera. Kada se koristi komora, njen dizajn mora da bude dovoljno prostran da minimizira skučenost životinja i omogući maksimalnu izloženost ispitivanoj supstanci udisanjem. Kao opšte pravilo koje obezbeđuje stabilnost atmosfere u komori koristi se mera prema kojoj "zapremina" životinja ne sme da bude veća od 5% ukupne zapremine komore. Koriste se različiti tipovi komora koji omogućavaju izloženost čitavog tela, samo glave ili samo oro-nazalnih otvora životinje, a ove posljednje dve komore minimiziraju izloženost ispitivanoj supstanci nekim drugim putem unosa.
1.6.2.6. Vreme posmatranja
Eksperimentalne životinje posmatraju se svaki dan kako bi se uočili znakovi toksičnosti i to tokom trajanja čitavog eksperimenta kao i za vreme oporavka. Važno je zabeležiti vreme pojave ili nestanka prvih znakova trovanja, kao i vreme uginuća.
1.6.3. Postupak
Životinje se svakodnevno izlažu ispitivanoj supstanci, ili pet do sedam dana u nedelji, u vremenskom periodu od 28 dana. Životinje iz pratećih grupa koje su predviđene za naknadna praćenja zadržavaju se dodatnih 14 dana bez tretmana kako bi se zabeležila postojanost toksičnih efekata ili oporavak.
Temperatura na kojoj se obavlja ispitivanje održava se na 22 °C ± 3 °C. Relativna vlažnost treba da bude između 30% i 70%, ali u nekim slučajevima (npr. kod ispitivanja aerosola) ovo nije izvodljivo. Održavanjem negativnog pritiska unutar komore (± 5 mm vode) sprečava se izlazak ispitivane supstance u okolinu. Za vreme izlaganja ispitivanoj supstanci životinjama se ne daje hrana i voda.
U toku ispitivanja koristi se odgovarajući dinamični sistem sa mogućnošću kontrole koncentracije ispitivane supstance. Za uspostavljanje odgovarajuće koncentracije ispitivane supstance, preporučuje se obavljanje probnog ispitivanja. Komora treba da bude dizajnirana na takav način da omogućava homogenu distribuciju vazduha za vreme trajanja eksperimenta. Sistem mora da omogući stabilne uslove i njihovo uspostavljanje u što kraćem vremenskom periodu.
Sprovode se merenja i prate sledeći parametri:
a) brzina protoka vazduha (kontinuirano);
b) koncentracije ispitivane supstance u zoni udisanja. Tokom dnevnih izlaganja, koncentracija ispitivane supstance ne sme da varira više od ± 15% od srednje vrednosti. Kod aerosola se teško postiže ovakva kontrola doziranja, pa se u tom slučaju tolerišu veće razlike u vrednostima. Za vreme trajanja kompletnog ispitivanja, dnevne koncentracije treba da budu što je moguće stabilnije. Za aerosole se obavlja i analiza veličine čestica (najmanje jedanput nedeljno u svakoj grupi životinja);
v) temperatura i vlažnost (kontinuirano, ako je moguće).
Opažanja se beleže sistematično za vreme i nakon izlaganja. Svaka životinja treba da ima poseban karton. Životinje se prate svaki dan, a znakovi trovanja beleže se redovno, uključujući vreme pojave, ozbiljnost i trajanje. Beleže se promene na koži i krznu, očima, sluznici, respiratornom, kardiovaskularnom, autonomnom i centralnom nervnom sistemu, kao i somatomotorna aktivnost i način ponašanja. Jednom nedeljno određuje se telesna masa životinja i prati potrošnja hrane. Životinje se redovno prate kako bi se izbegao gubitak zbog kanibalizma ili autolize tkiva. Na kraju ispitivanja obavlja se postmortalni pregled svih preživelih životinja iz osnovnih (ne pratećih) ispitivanih grupa. Životinje koje su izrazito slabe ili na samrti izdvajaju se iz grupe i žrtvuju na humani način, a potom se postmortalno pregledaju.
Sledeća ispitivanja sprovode se na kraju eksperimenta na svim životinjama, uključujući i one iz kontrolne grupe:
1) hematološka ispitivanja, uključujući hematokrit, koncentraciju hemoglobina, broj eritrocita, broj ukupnih i pojedinih loza leukocita, kao i koagulabilnost krvi;
2) kliničko-biohemijska ispitivanja krvi uključujući najmanje jedan parametar koji ukazuje na funkciju jetre i bubrega: alanin aminotransferaza (poznata i pod nazivom: glutamat piruvat transaminaza), aspartat aminotransferaza (poznata i pod nazivom: glutamat oksaloacetat transaminaza), azot uree, albumin, kreatinin, ukupni bilirubin i proteini u serumu.
Druga ispitivanja koja mogu biti potrebna za adekvatnu evaluaciju toksičnosti uključuju određivanje kalcijuma, fosfora, hlorida, natrijuma, kalijuma, glukoze (u uslovima gladovanja), lipida, hormona, acido-baznu ravnotežu methemoglobin i aktivnost holinesteraze.
Dodatne biohemijske analize obavljaju se po potrebi, kako bi se detaljnije proučili toksični efekti.
1.6.3.1. Postmortalni pregled
Sve eksperimentalne životinje detaljno se postmortalno pregledaju. Odmah nakon sekcije mere se, još vlažni, sledeći organi: jetra, bubrezi, nadbubrežne žlezde, pluća i testisi. Organi i tkiva (respiratorni trakt, jetra, bubrezi, slezina, testisi, nadbubrežne žlezde i srce, kao i drugi organi na kojima se primete promene u veličini) čuvaju se u odgovarajućem medijumu za dalja histopatološka ispitivanja. Pluća se vade netaknuta, mere i stavljaju u odgovarajući fiksator kako bi sačuvala sve strukture.
1.6.3.2. Histopatološka ispitivanja
U kontrolnim grupama i grupama izloženim visokim koncentracijama ispitivane supstance obavljaju se histološka ispitivanja izolovanih organa i tkiva. Organi i tkiva koji pokažu oštećenja koja se mogu pripisati visokim koncentracijama ispitivane supstance detaljno se ispituju i kod životinja koje su bile izložene nižim koncentracijama. Životinje iz pratećih grupa takođe je potrebno histološki obraditi sa posebnom pažnjom na organima i tkivima koja su pokazala promene i kod životinja iz drugih ispitivanih grupa.
Podaci se prikazuju tabelarno gde se za svaku ispitivanu grupu životinja navodi broj životinja na početku eksperimenta, kao i broj životinja kod kojih su pronađene promene.
Svi dobijeni rezultati analiziraju se pomoću odgovarajuće statističke metode. Koristi se bilo koja prihvaćena statistička metoda.
Izveštaj o ispitivanju sadrži:
1. Podatke o eksperimentalnim životinjama:
- vrstu, soj, poreklo, uslove čuvanja, ishrane, itd.
2. Podatke o uslovima ispitivanja:
- opis komore ili aparature uključujući dizajn, tip, dimenzije, izvor vazduha, sistem za raspršivanje aerosola, metode za kondicioniranje vazduha i način čuvanja životinja u komori. Opisuje se i aparaturu za merenje temperature, vlažnosti, koncentracije aerosola i određivanje raspodele veličine čestica.
3. Podatke o izlaganju ispitivanoj supstanci:
- ovi podaci prikazuju se tabelarno u vidu srednjih vrednosti sa odstupanjima (standardna devijacija), a ako je moguće sadrže i podatke o:
a) brzini protoka vazduha kroz otvore u aparaturi;
b) temperaturi i vlažnosti vazduha;
v) nominalnoj koncentraciji (ukupnom sadržaju ispitivane supstance koja se uvodi kroz otvore u aparaturi, podeljenom sa zapreminom vazduha);
g) prirodi vehikuluma, ako je korišćen;
d) tačnoj koncentraciji supstance u zoni udisanja;
đ) srednjem masenom aerodinamičkom dijametru (MMAD) i geometrijskoj standardnoj devijaciji (GSD).
4. Podatke o nalazima o toksičnim efektima predstavljenim u odnosu na pol životinja i koncentraciju ispitivane supstance.
5. Vreme uginuća u toku eksperimenta, tj. da li su životinje preživele eksperiment.
6. Opis toksičnih i ostalih efekata; koncentraciju bez efekta.
7. Vreme pojave abnormalnosti i njihov kasniji tok.
8. Podatke o ishrani i telesnoj masi.
9. Podatke o hematološkim ispitivanjima i nalazima.
10. Rezultate kliničko-biohemijskih ispitivanja.
11. Nalaze postmortalnog pregleda.
12. Detaljan opis svih histopatoloških nalaza.
13. Statističku obradu rezultata gde je moguće.
14. Raspravu o rezultatima.
15. Tumačenje rezultata.
Videti Opšti uvod, Deo G.
Videti Opšti uvod, Deo D.
B.9. AKUTNA (DERMALNA) TOKSIČNOST (28 DANA) - PONOVLJENE DOZE
Videti Opšti uvod, Deo A.
Videti Opšti uvod, Deo B.
Nisu propisane.
1.4. PRINCIP METODE ISPITIVANJA
Ispitivana supstanca primenjuje se svakodnevno na kožu životinja podeljenih u grupe u rastućim dozama. Na jednu grupu životinja primenjuje se jedna doza tokom perioda od 28 dana. Tokom primene ispitivane supstance životinje se svakodnevno posmatraju kako bi se beležili znakovi toksičnosti. Životinje koje uginu tokom ispitivanja postmortalno pregledaju se, a na kraju eksperimenta i preživele životinje se žrtvuju i postmortalno pregledaju.
Nisu propisani.
1.6.1. Priprema
Životinje se drže u eksperimentalnim uslovima i hrane po definisanom eksperimentalnom režimu najmanje pet dana pre početka ispitivanja. Pre ispitivanja, zdrave mlade životinje nasumce se dele u ispitivane i kontrolne grupe. Neposredno pre početka ispitivanja, životinjama se uklanja krzno sa dorzalnog dela tela. Krzno se može ukloniti i brijanjem, ali je u tom slučaju brijanje potrebno uraditi 24 sata pre ispitivanja. Šišanje i brijanje se ponavljaju jednom nedeljno. Kod uklanjanja krzna, pazi se da ne dođe do oštećenja kože. Za primenu ispitivane supstance čisti se najmanje 10% ukupne površine kože životinje. Kod procene površine i dimenzija kože koja se čisti uzima se u obzir i telesna masa životinje. Ako se ispituje čvrsta supstanca, koja se po potrebi može usitniti do praha, dobijeni prašak potrebno je dobro ovlažiti vodom ili nekim drugim vehikulumom kako bi se omogućio dobar kontakt sa kožom. Ako se koristi neki vehikulum, uzima se u obzir i njegov uticaj na prodiranje ispitivane supstance kroz kožu. Ispitivane supstance koje se već nalaze u tečnom obliku, najčešće se koriste nerazblažene. Ispitivana supstanca se primenjuje na kožu između pet do sedam dana nedeljno.
1.6.2. Uslovi ispitivanja
1.6.2.1. Eksperimentalne životinje
Za ovakav tip ispitivanja najčešće se koriste odrasli pacovi, kunići ili zamorci. Ako se koriste druge vrste laboratorijskih životinja, daje se obrazloženje za ovo korišćenje.
Na početku eksperimenta raspon telesnih masa životinja ne sme da prelazi ± 20% od odgovarajuće srednje vrednosti.
1.6.2.2. Broj i pol
Najmanje 10 životinja (5 mužjaka i 5 ženki) sa zdravom kožom koriste se za svaku ispitivanu dozu. Ispitivanje se vrši na ženkama koje nisu ranije rađale i koje nisu gravidne. Ako se u toku eksperimenta planiraju prevremena žrtvovanja, broj životinja u eksperimentu povećava se za broj koji se planira žrtvovati u toku ispitivanja. Prateća grupa od 10 životinja (po pet svakog pola) može da se izloži visokim koncentracijama ispitivane supstance u periodu od 28 dana, kako bi se 14 dana nakon tretmana zabeležile reverzibilnost, postojanost ili odložena pojava toksičnih efekata. Ukoliko se obavlja ovo posmatranje, uključuje se pomoćna grupa od 10 kontrolnih životinja (po pet svakog pola).
1.6.2.3. Dozni nivoi
Koriste se najmanje tri doze ispitivane supstance, zajedno sa odgovarajućim kontrolama (ako se koristi vehikulum, druga kontrola se izlaže vehikulumu). Vreme izlaganja treba da bude najmanje šest sati dnevno. Ispitivana supstanca nanosi se na kožu u približno isto vreme svakog dana, a naneta doza se prilagođava (jedanput ili dva puta nedeljno) promenama telesne mase životinje. Osim primene ispitivane supstance, sa životinjama u kontrolnim grupama postupa se identično kao sa životinjama iz ispitivanih grupa. Ako se koristi vehikulum, kontrolna grupa životinja dozira se vehikulumom na isti način kao i ispitivana grupa kojoj je primenjena najveća doza. Najveća doza ispitivane supstance treba da izazove toksične efekte kod životinja, ali bez ili sa minimalnim brojem uginulih životinja. Najniža koncentracija ne treba da izazove toksične efekte.
Kada je moguće predvideti izloženost ispitivanoj supstanci kod ljudi, najniža koncentracija primenjena na životinje treba da bude malo viša od ove vrednosti. Idealno, srednja koncentracija ispitivane supstance treba da izazove minimalne toksične efekte. Ako se koristi nekoliko srednjih koncentracija, njihove vrednosti treba da budu pravilno raspoređene kako bi se postigla gradacija toksičnih efekata. U grupama kod kojih su primenjene niske ili srednje koncentracije ispitivane supstance, kao i u kontrolnim grupama, učestalost smrtnih slučajeva kod životinja treba da bude niska kako bi tumačenje rezultata imalo smisla.
Ako primena ispitivane supstance izaziva tešku iritaciju kože, doze treba smanjiti, što može uticati na smanjenje ili potpuni nestanak drugih toksičnih efekata kod visokih doza. Ako dođe do izrazitih oštećenja kože, preporučuje se okončavanje ispitivanja i početak novog ispitivanja sa nižim koncentracijama ispitivane supstance.
1.6.2.4. Ispitivanje granične doze
Ako prethodno ispitivanje sa dozom od 1.000 mg/kg ili većom dozom u slučajevima kada se predviđa izloženost ljudi većoj dozi ne rezultira toksičnim efektima, nastavak ispitivanja smatra se nepotrebnim.
1.6.2.5. Vreme posmatranja
Eksperimentalne životinje posmatraju se svakog dana kako bi se uočili znakovi toksičnosti. Beleži se vreme pojave ili nestanka prvih znakova toksičnosti, kao i vreme uginuća.
1.6.3. Postupak
Životinje se drže u zasebnim kavezima. U idealnim uslovima, životinje se tretiraju sedam dana u nedelji, tokom perioda od 28 dana. Životinje iz pratećih grupa koje su predviđene za naknadna praćenja zadržavaju se dodatnih 14 dana bez tretmana kako bi se zabeležila postojanost toksičnih efekata ili oporavak. Vreme izlaganja treba da bude najmanje šest sati dnevno.
Ispitivana supstanca primenjuje se ravnomerno preko čitave površine koja iznosi otprilike 10% od ukupne površine kože. U slučaju veoma toksičnih supstanci, izložena površina može biti i manja, ali je potrebno primenjeni sloj ravnomerno rasporediti u što je moguće tanjem sloju.
Tokom ispitivanja ispitivana supstanca se drži u kontaktu sa kožom pomoću porozne gaze i flastera koji ne izaziva iritaciju kože. Mesto primene dodatno se može prekriti kako bi se onemogućila ingestija ispitivane supstance. Ako je neophodno, životinji se stavljaju i dodatni štitnici kojima se sprečava direktan kontakt sa tretiranom kožom, ali se ne preporučuje kompletna imobilizacija životinje. Kao alternativa koristi se zaštitni okovratnik.
Nakon propisanog vremena izlaganja, višak ispitivane supstance uklanja se ispiranjem vodom ili pomoću nekog drugog sredstva za čišćenje kože.
Posmatranja se svakodnevno sistematično beleže. Beleže se znakovi toksičnosti, vreme njihove pojave, stepen i trajanje; promene na koži i krznu, očima, sluzokoži, respiratornom, kardiovaskularnom, autonomnom i centralnom nervnom sistemu, kao i somatomotorna aktivnost i način ponašanja. Jednom nedeljno određuje se telesna masa životinja i beleže opažanja vezana za potrošnju hrane. Redovno se prate životinje kako bi se izbegao njihov gubitak zbog kanibalizma ili autolize tkiva. Na kraju eksperimenta, postmortalno pregledaju se sve preživele životinje iz osnovnih (ne pratećih) ispitivanih grupa. Životinje koje su izrazito slabe ili na samrti izdvajaju se iz grupe i žrtvuju iz humanih razloga, a potom se postmortalno pregledaju.
Sprovode se sledeća ispitivanja na kraju eksperimenta na svim životinjama uključujući one iz kontrolne grupe:
1. hematološka ispitivanja, uključujući hematokrit, koncentraciju hemoglobina, broj eritrocita, broj ukupnih i pojedinih loza leukocita, kao i brzinu zgrušavanja krvi;
2. kliničko-biohemijska ispitivanja krvi, uključujući najmanje jedan parametar koji ukazuje na funkciju jetre i bubrega: alanin aminotransferaza (poznata i pod nazivom: glutamat piruvat transaminaza), aspartat aminotransferaza (poznata i pod nazivom: glutamat oksaloacetat transaminaza), azot uree, albumin, kreatinin, ukupni bilirubin i proteini u serumu;
3. druga ispitivanja koja mogu biti potrebna za adekvatnu evaluaciju toksičnosti uključujući određivanje kalcijuma, fosfora, hlorida, natrijuma, kalijuma, glukoze (u uslovima gladovanja), lipida, hormona, acido-baznu ravnotežu, methemoglobin i aktivnost holinesteraze;
4. dodatne biohemijske analize obavljaju se po potrebi, kako bi se detaljnije proučili toksični efekti.
1.6.4. Postmortalni pregled
Sve eksperimentalne životinje detaljno se postmortalno pregledaju. Sledeći organi mere se odmah nakon sekcije, još vlažni: jetra, bubrezi, nadbubrežne žlezde, pluća i testisi. Organi i tkiva (respiratorni trakt, jetra, bubrezi, slezina, testisi, nadbubrežne žlezde i srce, kao i drugi organi na kojima se primete promene u veličini) čuvaju se u odgovarajućem medijumu za dalja histopatološka ispitivanja. Pluća se vade netaknuta, mere i stavljaju u odgovarajući fiksator kako bi se sačuvale sve strukture.
1.6.5. Histopatološka ispitivanja
U kontrolnim grupama i grupama izloženim visokim koncentracijama ispitivane supstance prave se histološka ispitivanja izolovanih organa i tkiva. Organi i tkiva koji pokažu oštećenja koja se mogu pripisati visokim koncentracijama ispitivane supstance detaljno se ispituju i kod životinja koje su bile izložene nižim koncentracijama. Životinje iz pratećih grupa takođe je potrebno histološki obraditi sa posebnim pažnjom na organe i tkiva koja su pokazala promene i kod životinja iz drugih ispitivanih grupa.
Podaci se prikazuju tabelarno gde se za svaku ispitivanu grupu životinja navodi broj životinja na početku eksperimenta, kao i broj životinja kod kojih su pronađene promene.
Svi dobijeni rezultati analiziraju se odgovarajućom statističkom metodom. Koristi se bilo koja prihvaćena statistička metoda.
Izveštaj o ispitivanju sadrži:
1. Podatke o eksperimentalnim životinjama:
- vrstu, soj, poreklo, uslovi smeštaja, ishrana itd.
2. Podatke o uslovima ispitivanja (uključujući način primene, okluzivni ili ne-okluzivni).
3. Koncentracije ispitivane supstance u dozama (koncentracija vehikuluma, ako je korišćen).
4. Podatke o dozi bez štetnog efekta.
5. Podatke o toksičnim efektima, sortirane prema polu životinja i primenjenoj dozi ispitivane supstance.
6. Vreme smrti u toku eksperimenta, tj. da li su životinje preživele celi eksperiment.
7. Opis toksičnih ili drugih efekata.
8. Vreme opažanja bilo kakvih abnormalnosti, i njihov kasniji tok.
9. Podatke o ishrani i telesnoj masi.
10. Podatke o hematološkim ispitivanjima i nalazima.
11. Rezultate kliničko-biohemijskih ispitivanja.
12. Nalaze postmortalnog pregleda.
13. Detaljan opis svih histopatoloških nalaza.
14. Statističku obradu rezultata kada je moguće.
15. Raspravu o rezultatima.
16. Tumačenje rezultata.
Videti Opšti uvod, Deo G.
Videti Opšti uvod, Deo D.
B.10. MUTAGENOST - in vitro ISPITIVANJE HROMOZOMSKIH ABERACIJA KOD SISARA
Ova metoda ispitivanja potpuno odgovara metodi OECD: TG 473, In vitro ispitivanje hromozomskih aberacija (1997).
Svrha in vitro ispitivanja hromozomskih aberacija je utvrđivanje agenasa koji uzrokuju strukturnu hromozomsku aberaciju u kulturi ćelija sisara1, 2, 3. Postoje dve vrste strukturnih aberacija: hromozomska i hromatidna. Sa većinom hemijskih mutagena izazvane aberacije su na hromatidama, ali može doći i do aberacija na hromozomima. Povećanje polipoidnosti može da ukaže na to da hemikalija ima potencijal za izazivanje numeričkih aberacija. Ova metoda nije namenjena za merenje numeričkih aberacija i ne koristi se rutinski u te svrhe. Hromozomske mutacije i s njima povezani efekti uzrok su mnogih genetskih oboljenja kod ljudi. Postoje dokazi da hromozomske mutacije i s njima povezani efekti koji izazivaju promene u onkogenima i tumor-supresorskim genima somatskih ćelija imaju ulogu u izazivanju kancera kod ljudi i eksperimentalnih životinja.
In vitro ispitivanje hromozomskih aberacija može da koristi: kulture utvrđenih ćelijskih linija, ćelijskih vrsta ili u prvom redu ćelijskih kultura. Ćelije se biraju na osnovu sposobnosti rasta u kulturi, stabilnosti kariotipa, hromozomskog broja, hromozomske h raznolikosti i spontane frekvencije hromozomskih aberacija.
Ispitivanja koja se obavljaju in vitro zahtevaju upotrebu egzogenog izvora metaboličke aktivacije. Ovaj sistem metaboličke aktivacije ne može u celini da oponaša in vivo uslove sisara. Vodi se računa da se izbegavaju uslovi koji dovode do pozitivnih rezultata, a koji ne odražavaju suštinsku mutagenost i koji mogu da nastanu usled promena u pH, osmolalnosti ili usled visokog nivoa citotoksičnosti4, 5.
Ovo ispitivanje koristi se za traženje mogućih mutagena i karcinogena za sisare. Mnoge supstance koje su pozitivne u ovom ispitivanju, karcinogene su za sisare. Uzajamna zavisnost između ovog ispitivanja i karcinogenosti nije besprekorna. Uzajamna zavisnost zavisi od hemijske klase. Sve je više dokaza da postoje karcinogeni koji se ne otkrivaju ovim ispitivanjem jer deluju mehanizmima koji su drugačiji od neposrednog oštećenja DNK.
Videti Opšti uvod.
Aberacija tipa hromatida jeste strukturno oštećenje hromozoma izraženo kao prekidanje pojedinih hromatida ili prekidanje i ponovno spajanje između hromatida.
Aberacija tipa hromozoma jeste strukturno oštećenje hromozoma izraženo kao prekidanje pojedinih hromatida ili prekidanje i ponovno spajanje hromatida na identičnom mestu.
Endoreduplikacija jeste proces kod kojeg nakon S faze DNK replikacije jezgro ne ulazi u mitozu, već započinje druga S faza. Rezultat procesa su hromozomi sa 4, 8, 16 i više hromatida.
"Gap" (prekid) jeste ahromatska lezija manja od širine jedne hromatide i sa minimalnom iskrivljenošću hromatida.
Mitotski indeks jeste odnos broja ćelija u metafazi i ukupnog broja ćelija koje su posmatrane u populaciji ćelija; odnosno mitotski indeks jeste mera stepena proliferacije te ćelijske populacije.
Numerička aberacija jeste promena u broju hromozoma u odnosu na normalan broj karakterističan za korišćene ćelije.
Poliploidija jeste pojava kada ćelija sadrži više od haploidnog broja hromozoma (n), osim kada sadrži diploidni broj hromozoma (tj. 3n, 4n, itd.).
Strukturna aberacija jeste promena u strukturi hromozoma koja se može otkriti mikroskopskim pregledom u metafazi ćelijske deobe, a koja se zapaža u vidu delecija i fragmentacija, translokacija ili inverzija.
Ćelijske kulture izlažu se ispitivanoj supstanci uz metaboličku aktivaciju i bez nje. Nakon izlaganja ćelijskih kultura ispitivanoj supstanci, u prethodno određenim intervalima, ćelijske kulture se tretiraju supstancama koje prekidaju metafazu (npr. Colcemid® ili kolhicin); zatim se uzimaju, boje i mikroskopski se analiziraju ćelije u metafazi, odnosno ispituju se na prisutnost hromozomskih aberacija.
1.4.1. Preparati
1.4.1.1. Ćelije
Mogu se koristiti različite ćelijske linije, sojevi ili primarne ćelijske kulture, uključujući humane ćelije (npr. fibroblasti kineskog hrčka, humani ili drugi limfociti periferne krvi sisara).
1.4.1.2. Medijum (hranljive podloge) i uslovi kultivisanja
Za održavanje kultura koriste se odgovarajuće hranljive podloge i uslovi inkubacije (posude, CO2 koncentracija, temperatura i vlažnost). Postojećim ćelijskim linijama i sojevima mora se rutinski proveriti stabilnost u modalnom broju hromozoma i odsustvo kontaminacije mikoplazmom pri čemu se ćelijske linije i sojevi ne koriste ako su kontaminirani. Treba da budu poznati uobičajeno vreme ćelijskog ciklusa ćelije i uslovi kultivisanja koji se koriste.
1.4.1.3. Priprema kultura
Utvrđene ćelijske linije i sojevi: ćelije se umnožavaju od "stock" kultura, zasejavaju se u podlozi pri gustini koja je takva da se u kulturama ne dostigne konfluentnost pre vremena sakupljanja i inkubiraju se na temperaturi od 37°C.
Limfociti: puna krv tretirana sa antikoagulansom (npr. heparinom) ili izdvojeni limfociti dobijeni od zdrave životinje dodaju se podlozi koji sadrži mitogen (npr. fitohemaglutinin) i inkubiraju se na temperaturi od 37°C.
1.4.1.4. Metabolička aktivacija
Ćelije moraju da se izlože ispitivanoj supstanci u prisustvu i u odsustvu odgovarajućeg sistema metaboličke aktivacije. Najčešće korišćeni sistem je post-mitohodrijalna frakcija sa kofaktorom (S9) pripremljena od jetre glodara tretiranih agensima koji indukuju enzime kao što su: Aroclor 12546, 7, 8, 9 ili smeša fenobarbitona i ß-naftoflavona10, 11, 12.
Post-mitohondrijalne frakcije obično se koriste u koncentracijama u opsegu od 1% v/v do 10% v/v u konačnoj podlozi. Uslovi metaboličke aktivacije mogu da zavise od klase hemikalije koja se ispituje. U nekim slučajevima prikladno je da se koristi više od jedne koncentracije post-mitohondrijalne frakcije.
Pojedina dostignuća, uključujući ćelijske linije dobijene genetskim inženjeringom kod kojih se javlja ekspresija specifičnih aktivirajućih enzima, mogu da omoguće potencijal za endogenu aktivaciju. Izbor korišćenih ćelijskih linija mora da bude naučno opravdan (npr. relevantnost izoenzima citohroma P450 za metabolizam ispitivane supstance).
1.4.1.5. Ispitivana hemikalija
Ispitivane supstance u čvrstom stanju, pre tretmana ćelija, moraju da se rastvore ili suspenduju u odgovarajućem rastvaraču ili vehikulumu i, ako je potrebno, da se razblaže. Ispitivane supstance u tečnom stanju mogu da se dodaju neposredno u ispitivani sistem, odnosno mogu da se razblaže pre tretmana. Koriste se sveži preparati ispitivane supstance, osim ako podaci o stabilnosti pokazuju da se preparati mogu čuvati.
1.4.2. Uslovi ispitivanja
1.4.2.1. Vehikulum
Vehikulum treba da bude takav da hemijski ne reaguje sa ispitivanom supstancom i da bude kompatibilan sa preživljavanjem ćelija i S9 aktivnošću. Ako se koristi vehikulum koji nije opštepoznat, njegova primena mora da bude obrazložena podacima koji potvrđuju njegovu kompatibilnost. Preporučuje se, kad god je moguće, da se u prvom redu koriste vodeni vehikulumi. Ako su ispitivane supstance nestabilne u vodi, organski rastvarači koja se koriste ne smeju da sadrže vodu. Voda može da se ukloni dodavanjem molekularnog sita.
1.4.2.2. Koncentracije izlaganja
Kriterijumi koji moraju da se razmotre kod određivanja najviših koncentracija su: citotoksičnost, rastvorljivost u ispitivanom sistemu i promene pH ili osmolalnost.
Citotoksičnost mora da se odredi sa i bez metaboličke aktivacije u glavnom eksperimentu uz korišćenje odgovarajuće indikacije za ćelijski integritet i rast, kao što je stepen združivanja, broj živih ćelija ili mitotski indeks. Korisno je da se u prethodnom eksperimentu odredi citotoksičnost i rastvorljivost.
Analizira se najmanje tri koncentracije. Koncentracije koje izazivaju citotoksičnost treba da pokriju opseg od maksimalne do male toksičnosti ili bez toksičnosti; što obično znači da koncentracije treba međusobno da se razlikuju najviše za faktor između √2 i √10. U vreme zrelosti najviša koncentracija mora da pokaže znatno smanjenje stepena združivanja, broja ćelija ili mitotskog indeksa (sve veće od 50%). Mitotski indeks je posredna mera citotoksičnih/citostatskih efekata i zavisi od vremena nakon tretmana. Mitotski indeks prihvatljiv je za suspenzije kultura kod kojih bi druge mere toksičnosti mogle da budu komplikovane i nepraktične. Podatak o kinetici ciklusa ćelije kao što je prosečno vreme generisanja (u daljem tekstu: AGT) može da se koristi kao dodatni podatak. AGT je srednja vrednost koja ne otkriva uvek postojanje subpopulacija, i čak i mali porasti prosečnog vremena generacije mogu da budu povezani sa vrlo bitnim kašnjenjem u vremenu optimalne produkcije aberacija.
Za supstance koje su relativno necitotoksične, najviša ispitivana koncentracija treba da bude 5 µL/mL, 5 mg/mL ili 0,01 M, zavisno od toga koja koncentracija je niža.
Za relativno nerastvorne supstance koje nisu toksične pri proizvodu koncentracija njenih jona nižem od proizvoda rastvorljivosti, najviša doza koja se koristi treba da bude iznad granice rastvorljivosti u konačnoj podlozi na kraju tretmana. U nekim slučajevima (npr. kad se toksičnost supstance pojavljuje samo pri proizvodu koncentracija jona višim od proizvoda rastvorljivosti), preporučuje se da se ispitivanje obavi sa više od jedne doze sa talogom. Procena rastvorljivosti na početku i na kraju tretmana može da bude od koristi, jer se rastvorljivost može menjati tokom izlaganja u sistemu ispitivanja usled prisutnosti ćelija, S9, seruma, itd. Talog može da se otkrije golim okom. Talog ne sme da utiče na ocenjivanje.
1.4.2.3. Pozitivne i negativne kontrole
Istovremene pozitivne i negativne (vehikulum) kontrole, sa i bez metaboličke aktivacije, moraju da budu uključene u svaki eksperiment. Ako se koristi metabolička aktivacija, pozitivne kontrolne hemikalije moraju biti one koje zahtevaju aktivaciju, kako bi dale mutageni odgovor.
Kod pozitivnih kontrola koristi se poznati klastogen i nivoi izloženosti kod kojih se očekuje dobijanje reproduktivnog povećanja u odnosu na kontrolu, što ukazuje na osetljivost ispitivanog sistema.
Koncentracije pozitivne kontrole treba da pokažu jasne efekte, ali da licu koje obavlja tumačenje rezultata ne bude odmah poznat identitet kodiranih slajdova.
Primeri supstanci za pozitivnu kontrolu:
Tabela 1.
Uslovi metaboličke aktivacije | Supstanca | CAS br. | EINEC br. |
Odsustvo egzogene | Metil metansulfonat | 66-27-3 | 200-625-0 |
Etil metansulfonat | 62-50-0 | 200-536-7 | |
Etil nitrozourea | 759-73-9 | 212-072-2 | |
Mitomicin S | 50-07-7 | 200-008-6 | |
4-Nitrohinolin-N-oksid | 56-57-5 | 200-281-1 | |
Prisustvo egzogene metaboličke | Benzo[a]piren | 50-32-8 | 200-028-5 |
Ciklofosfamid | 50-18-0 | 200-015-4 |
Za pozitivnu kontrolu mogu da se koriste i druge supstance. Kada je moguće, treba razmotriti upotrebu pozitivne kontrole koja je srodne klase ispitivanoj hemikaliji.
Negativne kontrole koje se sastoje samo od vehikuluma u podlozi za tretiranje i sa kojima se postupa na isti način kao i sa tretiranim kulturama, moraju da budu uključene za svako vreme sakupljanja. Koriste se i netretirane kontrole, osim ako postoje podaci kontrole iz ranijih studija koji pokazuju da odabrani rastvarač ne izaziva nikakve štetne niti mutagene efekte.
1.4.3. Postupak
1.4.3.1. Tretman ispitivanom supstancom
Ćelije se tokom proliferacije tretiraju ispitivanom supstancom u prisustvu ili odsustvu sistema metaboličke aktivacije. Obrada limfocita mora da počne oko 48 sati nakon stimulacije mitoze.
1.4.3.2.
Za svaku koncentraciju obično se koriste kulture u duplikatu, a strogo se preporučuju za negativne kontrolne kulture odnosno kontrolne kulture vehikuluma. Kada na osnovu postojećih podataka mogu da se pokažu minimalne promene između kultura u duplikatu13, 14 prihvatljivo je korišćenje jedne kulture za svaku koncentraciju.
Gasovite ili isparljive supstance moraju se ispitati odgovarajućim metodama, npr. korišćenjem hermetički zatvorenih posuda za kultivisanje15, 16.
1.4.3.3. Vreme sakupljanja kulture
U prvom eksperimentu ćelije se izlažu ispitivanoj supstanci 3 do 6 sati sa i bez metaboličke aktivacije, a uzorci se uzimaju posle približno 1,5 dužine normalnog ćelijskog ciklusa nakon početka tretmana12. Ako ovaj protokol da negativne rezultate i sa i bez aktivacije, obavlja se dodatni eksperiment bez aktivacije, sa neprekidnim tretmanom do uzorkovanja posle približno 1,5 dužine normalnog ćelijskog ciklusa. Određene hemikalije mogu se lakše otkriti kod vremena tretmana/uzorkovanja koje je duže od 1,5 dužine ciklusa. Negativni rezultati sa metaboličkom aktivacijom moraju da se potvrde u zavisnosti od slučaja. U slučajevima kada se potvrda negativnih rezultata ne smatra potrebnom, daje se obrazloženje.
1.4.3.4. Priprema hromozoma
Ćelijske kulture tretiraju se Colcemid®-om ili kolhicinom obično jedan do tri sata pre sakupljanja. Svaka ćelijska kultura sakuplja se i obrađuje posebno za pripremu hromozoma. Priprema hromozoma obuhvata: tretiranje ćelija hipotoničnim rastvorom, fiksaciju i bojenje.
1.4.3.5. Analiza
Svi slajdovi, uključujući one pozitivnih i negativnih kontrola, moraju da se nezavisno kodiraju pre mikroskopske analize. Postupci fiksacije često dovode do prekida proporcije metafaznih ćelija sa gubitkom hromozoma, pa procenjivane ćelije treba da sadrže broj centromera koji je jednak modalnom broju ± 2 za sve vrste ćelija. Najmanje 200 dobro raspoređenih metafaza, podjednako podeljenih između duplikata, mora da se uoči po koncentraciji i kontroli. Taj broj može da bude i manji ako se uoči veliki broj aberacija.
Iako je svrha ispitivanja otkrivanje hromozomskih aberacija, važno je zabeležiti i poliploidiju i endoreduplikaciju, ukoliko se uoče.
Eksperimentalna jedinica je ćelija. Zbog ovoga mora da se proceni procenat ćelija sa strukturnim hromozomskim aberacijama. Strukturno različite vrste hromozomskih aberacija moraju da se upišu sa svojim brojevima i učestalostima za eksperimentalne i kontrolne kulture. Oštećenja se upisuju odvojeno i navode u izveštaju, ali generalno nisu uključena u ukupnu učestalost aberacija.
Istovremene mere citotoksičnosti za sve tretirane i negativne kontrolne kulture u glavnim ispitivanjima aberacija, takođe moraju da se zabeleže.
Navode se podaci o svakoj pojedinačnoj kulturi. Svi podaci se navode sažeto u tabeli.
Ne postoje zahtevi za potvrdu jasnog pozitivnog odgovora. Dvosmisleni rezultati moraju se razjasniti daljim ispitivanjem, ako je moguće modifikacijama eksperimentalnih uslova. Potreba za potvrđivanjem negativnih rezultata razmotrena je odeljku 1.4.3.3. ove metode. Za izvođenje daljih eksperimenata mora se razmotriti modifikacija parametara ispitivanja za proširenje opsega procenjenih uslova. Parametri ispitivanja se mogu modifikovati obuhvataju opseg koncentracije i uslove metaboličke aktivacije.
2.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA
Postoji nekoliko kriterijuma za određivanje pozitivnog rezultata, kao što je povećanje zavisno od koncentracije ili reproducibilno povećanje broja ćelija sa hromozomskim aberacijama. Prvo se razmatra biološka relevantnost rezultata. Statističke metode mogu da se koriste kao pomoć u proceni rezultata ispitivanja3, 13. Statistički značaj ne može da bude jedini faktor koji određuje pozitivni odgovor.
Povećanje broja poliploidnih ćelija može da ukaže na to da ispitivana supstanca ima potencijal da inhibira procese mitoze i izazove numeričke hromozomske aberacije. Povećanje broja ćelija sa endoreduplikovanim hromozomima može da ukaže na to da ispitivana supstanca ima potencijal da inhibira progresiju ćelijskog ciklusa17, 18.
Ispitivana supstanca za koju rezultati ispitivanja ne zadovoljavaju gore navedene kriterijume smatra se nemutagenom u ovom sistemu.
Iako većina eksperimenata daje jasne pozitivne ili negativne rezultate, u retkim slučajevima dobijeni podaci ne omogućavaju donošenje konačne procene aktivnosti ispitivane supstance. Rezultati mogu da ostanu dvosmisleni ili nejasni bez obzira na to koliko puta je eksperiment ponovljen.
Pozitivni rezultati iz in vitro ispitivanja aberacije hromozoma ukazuju da ispitivana supstanca izaziva strukturne aberacije hromozoma u kulturi somatskih ćelija sisara. Negativni rezultati ukazuju da, pod ispitivanim uslovima, ispitivana supstanca ne izaziva aberaciju hromozoma u kulturi somatskih ćelija sisara.
Izveštaj o ispitivanju mora da sadrži podatke o:
1) Vehikulumu:
- obrazloženje za izbor vehikuluma;
- rastvorljivost i stabilnost ispitivane supstance u vehikulumu, ako su poznati.
2) Ćelijama:
- vrsta i poreklo ćelija;
- kariotipne karakteristike i podesnost korišćene vrste ćelija;
- odsustvo mikoplazme, ako je primenljivo;
- podatak o dužini ćelijskog ciklusa;
- pol davaoca krvi, puna krv ili korišćeni odvojeni limfociti, mitogen;
- broj prolaza, ako je primenljivo;
- metode za održavanje kulture ćelije, ako je primenljivo;
- modalni broj hromozoma.
3) Uslovima ispitivanja:
- identitet supstance koja je korišćena za zaustavljanje metafaze, njena koncentracija i trajanje izloženosti ćelije;
- argumentacija za izbor koncentracija i broj kultura, uključujući npr. podatke o citotoksičnosti, ograničenju rastvorljivosti, ako su dostupni;
- sastav podloge, koncentracija CO2, ako je primenljivo;
- koncentracija ispitivane supstance;
- zapremina vehikuluma i dodate ispitivane supstance;
- temperatura inkubacije;
- vreme inkubacije;
- trajanje tretmana;
- gustina ćelija kod zasejavanja, ako je primenljivo;
- vrsta i sastav sistema metaboličke aktivacije, uključujući kriterijume prihvatljivosti;
- pozitivne i negativne kontrole;
- metode pripreme slajdova;
- kriterijumi za procenu aberacije;
- broj analiziranih metafaza;
- metode za merenje toksičnosti;
- kriterijumi za smatranje studija pozitivnim, negativnim ili dvosmislenim.
4) Rezultatima:
- znakovi toksičnosti, tj. stepen konfluencije, podaci o ćelijskom ciklusu, broj izbrojanih ćelija, mitotski indeks;
- znakovi taloženja;
- podaci o pH i osmolalnosti podloge za tretiranje, ako je određeno;
- definicija za aberacije, uključujući oštećenja;
- broj ćelija sa hromozomskim aberacijama i vrsta aberacija hromozoma, za svaku tretiranu i kontrolnu kulturu posebno;
- promene u ploidiji, ako se vide;
- odnos doza-odgovor, kada je moguće;
- eventualne statističke analize;
- podaci o istovremenoj negativnoj (vehikulum) i pozitivnoj kontroli;
- podaci iz literature o negativnoj (vehikulum) i pozitivnoj kontroli sa opsezima, srednjim vrednostima i standardnim devijacijama.
5) Obrazloženju rezultata.
6) Zaključcima.
1. Evans, H.J., (1976) Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, p. 1-29.
2. Ishidate, M. Jr. and Sofuni, T., (1985). The In vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, p. 427-432.
3. Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Anderson, G. and Zeiger, E., (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl. 10), p. 1-175.
4. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C., (1991) Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res, 257, p. 147-204.
5. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, p. 297-305.
6. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347-364.
7. Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173-215.
8. Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and de Vogel, N., (1976) Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System in vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, p. 83-90.
9. Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr., (1979) Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In vitro. Mutation Res., 66, p. 277-290.
10. Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in In vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 175-177.
11. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., (1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds) In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, p. 85-88.
12. Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M.Jr., Ivett, J.L., Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T., (1994) Report from Working Group on in In vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312, p. 241-261.
13. Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D.O. and Phillips, B., (1989) Analysis of Data from In vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, p. 141-154.
14. Soper, K.A. and Galloway, S.M., (1994) Replicate Flasks are not Necessary for In vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, p. 139-149.
15. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T., (1982) CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, p. 91-103.
16. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L., (1983) Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, p. 795-801.
17. Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, p. 403-413.
18. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983) Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, p. 1362-1364.
B.11. MUTAGENOST - in vivo ISPITIVANJE HROMOZOMSKIH ABERACIJA NA KOSTNOJ SRŽI SISARA
Metoda ispitivanja potpuno odgovara metodi OECD: TG 475, Ispitivanje hromozomskih aberacija u kostnoj srži sisara (1997).
Ispitivanje hromozomskih aberacija in vivo kod sisara koristi se za otkrivanje strukturnih hromozomskih aberacija koje je ispitivana supstanca izazvala u ćelijama kostne srži životinja, obično glodara1, 2, 3, 4. Strukturne hromozomske aberacije mogu biti dvojake: hromozomske i hromatidne. Povećanje poliploidnosti može da ukaže na to da hemikalija ima potencijal da izazove numeričke aberacije. Većina hemijskih mutagena izaziva aberacije hromatidnog tipa, ali dolazi i do aberacija hromozomskog tipa. Hromozomske mutacije i sa njima povezane pojave uzrok su mnogih genetskih bolesti kod ljudi i postoje značajni dokazi da su hromozomske mutacije i sa njima povezane pojave, koje izazivaju promene onkogena i tumor-supresorskih gena, povezane sa rakom kod ljudi i u eksperimentalnim sistemima.
U ovoj metodi ispitivanja obično se koriste glodari. Kostna srž predstavlja ciljno tkivo ovog ispitivanja, s obzirom da je reč o visoko prokrvljenom tkivu koje sadrži populaciju ćelija koje brzo prolaze kroz cikluse, a koje je moguće lako izolovati i obraditi. Druge životinjske vrste i ciljna tkiva nisu predmet ove metode ispitivanja.
Navedeno ispitivanje hromozomskih aberacija posebno je relevantno za procenu opasnosti od mutagenog dejstva jer omogućava da se uzme u obzir metabolizam in vivo, farmakokinetičke i procese reparacije DNK, iako se isti mogu razlikovati kod različitih vrsta i tkiva. In vivo ispitivanje korisno je i za dalje istraživanje mutagenih efekata otkrivenih prilikom in vitro ispitivanja.
Ovaj oblik ispitivanja ne odgovara ukoliko se pojave dokazi da ispitivana supstanca ili reaktivni metabolit neće dospeti do ciljnog tkiva.
Videti Opšti uvod.
Aberacija tipa hromatida jeste strukturno oštećenje hromozoma izraženo kao prekidanje pojedinih hromatida ili prekidanje i ponovno spajanje između hromatida.
Aberacija tipa hromozoma jeste strukturno oštećenje hromozoma izraženo kao prekidanje pojedinih hromatida ili prekidanje i ponovno spajanje hromatida na identičnom mestu.
Endoreduplikacija jeste proces kod koga nakon S faze replikacije DNK jedro ne ulazi u mitozu nego započinje druga S faza. Rezultat su hromozomi sa 4, 8, 16 i više hromatida.
"Gap" (prekid) jeste ahromatska lezija manja od širine jedne hromatide i sa minimalnom iskrivljenosti hromatida.
Numerička aberacija jeste promena u broju hromozoma u odnosu na normalan broj karakterističan za ćelije koje se koriste.
Poliploidija jeste pojava kada ćelija sadrži više od haploidnog broja hromozoma (n), osim kada sadrži diploidni broj (tj. 3n, 4n, itd.).
Strukturna aberacija jeste promena u strukturi hromozoma koja se može otkriti mikroskopskim pregledom u metafazi ćelijske deobe, a koja se zapaža u vidu delecija i fragmentacija, translokacija ili inverzija.
Životinje se odgovarajućim putem izlažu ispitivanoj supstanci i žrtvuju u određeno vreme nakon tretiranja. Pre žrtvovanja, životinje se tretiraju agensom za zaustavljanje metafaze (npr. kolhicinom ili Colcemid®-om). Nakon toga, pripreme se preparati hromozoma ćelija kostne srži i analiziraju se ćelije u metafazi sa ciljem utvrđivanja hromozomskih aberacija.
1.4.1. Pripreme
1.4.1.1. Izbor životinjske vrste
Obično se koriste pacovi, miševi i kineski hrčci. Mogu se koristiti i druge odgovarajuće vrste sisara. Treba da se koriste mlade, zdrave, odrasle životinje sojeva koji se uobičajeno upotrebljavaju. Prilikom započinjanja istraživanja odstupanje u telesnoj masi životinja treba da bude minimalno i da ne prelazi ± 20% prosečne telesne mase za svaki pol.
1.4.1.2. Uslovi smeštaja i ishrane
Primenjuju se opšti uslovi koji su navedeni u Opštem uvodu, iako treba da se nastoji da se vlažnost održi na nivou od 50% do 60%.
1.4.1.3. Priprema životinja
Zdrave odrasle životinje nasumično se grupišu u kontrolnu i tretirane grupe. Kavezi treba da budu takvi da mogući efekti na ispitivanje budu minimalni. Životinje se pojedinačno označavaju. Životinje se aklimatizuju na laboratorijske uslove najmanje pet dana pre početka ispitivanja.
1.4.1.4. Priprema doza
Pre tretiranja životinja ispitivanom supstancom čvrste ispitivane supstance treba da se rastvore ili suspenduju u odgovarajućim vehikulumima i, ukoliko je potrebno, da se razblaže. Tečne ispitivane supstance mogu direktno da se primene ili da se razblaže pre primene. Sveže preparate ispitivane supstance treba odmah upotrebiti, osim ukoliko podaci o stabilnosti ne pokazuju da je čuvanje prihvatljivo.
1.4.2. Uslovi ispitivanja
1.4.2.1. Vehikulum
Vehikulum ne sme da izaziva toksične efekte pri doznim nivoima koji se primenjuju i ne sme da postoji sumnja da će hemijski da reaguje sa ispitivanom supstancom. Ukoliko se primenjuju manje poznati vehikulumi, njihovo uključivanje u ispitivanje treba obrazložiti podacima koji ukazuju na njihovu kompatibilnost. Kad god je moguće, preporučuje se primena vodenog rastvora.
1.4.2.2. Kontrole
Istovremene pozitivne i negativne (vehikulum) kontrole treba da budu uključene u svako ispitivanje i za svaki pol. Osim primene ispitivane supstance, sa životinjama u kontrolnim grupama treba postupati na isti način kao i sa životinjama u tretiranim grupama.
Pozitivne kontrole treba da proizvedu strukturne aberacije in vivo pri nivoima izloženosti za koje se očekuje da će dati povećanje u odnosu na pozadinu koja može da se detektuje. Pozitivne kontrolne doze biraju se tako da efekti budu jasni, ali da licu koje očitava rezultate odmah ne otkriju identitet šifriranih mikroskopskih preparata (slajdova). Dozvoljeno je da se supstanca koja je pozitivna kontrola primeni putem koji je različit od puta primene ispitivane supstance, i da se uzorkuje samo jednom. Može se uzeti u obzir primena pozitivnih kontrola koje pripadaju istoj hemijskoj klasi kao i ispitivana hemikalija. Primeri supstanci koje se koriste kao pozitivne kontrole:
Tabela 1.
Supstanca | CAS br. | EINECS br. |
etil metansulfonat | 62-50-0 | 200-536-7 |
etil nitrozourea | 759-73-9 | 212-072-2 |
mitomicin S | 50-07-7 | 200-008-6 |
ciklofosfamid | 50-18-0 | 200-015-4 |
trietilenmelamin | 51-18-3 | 200-083-5 |
Negativne kontrole, tretirane samo vehikulumom, sa kojima se inače postupa na isti način kao sa grupama obuhvaćenim tretmanom, treba da budu obuhvaćene svakim uzorkovanjem, osim ukoliko su dostupni podaci o varijabilnosti u okviru vrste i u frekvenciji ćelija sa hromozomskim aberacijama. Ukoliko se na negativne kontrole primenjuje jedno uzorkovanje, najprimerenije je vreme prvog uzorkovanja. Istovremeno se koriste i netretirane kontrole (kontrolni uzroci), osim ukoliko postoje podaci o kontrolama iz ranijih studija ili objavljeni kontrolni podaci koji dokazuju da odabran vehikulum ne izaziva štetne ili mutagene efekte.
1.5.1. Broj i pol životinja
Svaka tretirana i kontrolna grupa mora da obuhvati najmanje pet životinja istog pola na kojima je moguće obaviti analizu. Ukoliko postoje podaci istraživanja obavljenog na istoj vrsti i istim putem izlaganja koji dokazuju da ne postoje značajnije razlike u toksičnosti među polovima, dovoljno je obaviti ispitivanje kod samo jednog pola. U slučajevima u kojima izlaganje ljudi hemikalijama može da bude specifično za određeni pol, kao na primer kod nekih farmaceutskih agensa, ispitivanje treba obaviti na životinjama odgovarajućeg pola.
1.5.2. Plan tretmana
Preporučuje se primena ispitivane supstance u okviru jednog tretmana. Ispitivane supstance je moguće davati u obliku podeljene doze, tj. dva tretmana tokom istog dana u razmaku od najviše nekoliko sati, kako bi se olakšalo davanje velike zapremine ispitivane supstance. Ostali režimi tretiranja treba da budu naučno opravdani.
Uzorci se uzimaju u dva navrata nakon tretmana tokom jednog dana. Kod glodara prvo vreme uzorkovanja je 1,5 dužina redovnog ćelijskog ciklusa (koji iznosi 12 do 18 sati) nakon tretmana.
S obzirom da vreme koje je potrebno za unos i metabolizam ispitivane supstance, kao i za njen efekat na dinamiku ćelijskog ciklusa, može da utiče na optimalno vreme potrebno za otkrivanje hromozomske aberacije, preporučuje se i kasnije uzimanje uzorka: 24 sata nakon prvog uzorkovanja. Ukoliko se primenjuju režimi tretiranja ispitivanom supstancom duži od jednog dana, nakon poslednjeg tretmana treba obaviti jedno uzorkovanje od oko 1,5 dužine normalnog ćelijskog ciklusa.
Pre žrtvovanja životinjama se intraperitonealno ubrizgava odgovarajuća doza agensa za zaustavljanje metafaze (npr. Colcemid® ili kolhicin). Životinjama se nakon toga uzimaju uzorci u odgovarajućim intervalima. Za miševe navedeni interval iznosi otprilike 3-5 sati, a za kineske hrčke interval je približno 4 do 5 sati. Ćelije se izoluju iz kostne srži i analiziraju radi otkrivanja hromozomskih aberacija.
1.5.3. Dozni nivoi
Ukoliko se ispitivanje obavlja sa ciljem utvrđivanja opsega doza zbog toga što nema dostupnih podataka, navedeno ispitivanje treba obaviti u istoj laboratoriji, uz korišćenje iste vrste, soja, pola i režima tretiranja kao i u glavnom ispitivanju5. Ukoliko postoji toksičnost, za prvo uzorkovanje koriste se tri dozna nivoa. Navedene doze treba da obuhvate opseg od maksimalne do niske toksičnosti ili nivo bez toksičnosti. Prilikom narednog uzorkovanja potrebno je koristiti samo najvišu dozu. Najviša doza se definiše kao doza usled koje nastaju takvi znakovi toksičnosti da bi viša doza prouzrokovala uginjavanje životinja. Supstance specifične biološke aktivnosti u malim netoksičnim dozama (poput hormona i mitogena) mogu biti izuzetak za primenu kriterijuma za izbor doza i tada doze treba proceniti u zavisnosti od slučaja. Najviša doza se može definisati i kao doza koja dovodi do nekih indikacija toksičnosti u kostnoj srži (npr. smanjenje mitotskog indeksa veće od 50%).
1.5.4. Ispitivanje granične doze
Ukoliko u ispitivanju sa jednom dozom od najmanje 2.000 mg/kg TM u jednokratnom tretmanu ili u dva tretmana tokom istog dana ne nastanu nikakvi primetni toksični efekti i ukoliko se na osnovu podataka o strukturno srodnim supstancama ne očekuje genotoksičnost, nije potrebno primeniti kompletno ispitivanje primenom tri dozna nivoa. Za ispitivanja u trajanju do 14 dana granična doza iznosi 2.000 mg/kg TM/dan, a za tretmane koji traju duže od 14 dana 1.000 mg/kg TM/dan. Očekivana izloženost ljudi može da ukaže na potrebu za primenom više doze u ispitivanju granične doze.
1.5.5. Primena doza
Ispitivana supstanca obično se primenjuje intubacijom i to korišćenjem želudačne sonde ili odgovarajuće intubacione kanile ili intraperitonealnom injekcijom. Mogu se primeniti i drugi putevi izlaganja uz navođenje obrazloženja za tu primenu. Maksimalna zapremina tečnosti koju je moguće dati putem sonde ili injekcijom u jednom navratu zavisi od veličine eksperimentalne životinje. Zapremina ne treba da prelazi 2 mL/100 g TM. Upotrebu većih zapremina potrebno je obrazložiti. Izuzev u slučaju iritativnih i korozivnih supstanci kod kojih će se normalno ispoljiti pogoršani efekti pri višim koncentracijama, odstupanja u zapremini treba da budu minimalna podešavanjem koncentracije, kako bi se obezbedila konstantna zapremina pri svim nivoima doza.
1.5.6. Hromozomski preparat
Odmah nakon žrtvovanja životinje, uzima se kostna srž koja se izlaže hipotoničnom rastvoru i fiksira. Ćelije se nanesu na mikroskopske pločice i oboje.
1.5.7. Analiza
Kao mera citotoksičnosti određuje se mitotski indeks u najmanje 1.000 ćelija po životinji za sve tretirane životinje (uključujući pozitivne kontrole) i netretirane životinje negativne kontrolne grupe.
Analizi treba podvrgnuti najmanje 100 ćelija svake životinje. Navedeni broj se može smanjiti ukoliko se uoči veliki broj aberacija. Sve preparate (slajdove), uključujući one pozitivne i negativne kontrole, potrebno je šifrovati pre mikroskopske analize. S obzirom da postupci izrade preparata često imaju za posledicu promenu proporcije metafaza uz gubitak hromozoma, ćelije koje se broje treba da sadrže broj centromera jednak broju 2n ± 2.
Podaci koji se odnose na pojedine životinje navode se tabelarno. Životinja predstavlja eksperimentalnu jedinicu. Za svaku životinju potrebno je odrediti broj ćelija koje se procenjuju, broj aberacija po ćeliji i procenat ćelija sa strukturnim hromozomskim aberacijama. Navode se različite vrste strukturnih hromozomskih aberacija zajedno sa svojim brojevima i frekvencijama, a u odnosu na tretirane i kontrolne grupe. Hromozomski prekidi navode se odvojeno, ali se generalno ne uključuju u ukupnu učestalost aberacija. Ukoliko ne postoje dokazi o razlikama među polovima, podatke dobijene ispitivanjem oba pola moguće je sjediniti radi statističke analize.
2.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA
Postoji nekoliko kriterijuma za utvrđivanje pozitivnog rezultata, kao što je dozno zavisno povećanje relativnog broja ćelija sa hromozomskim aberacijama ili jasno povećanje broja ćelija sa aberacijama u grupi koja je primila jednu dozu, prilikom jedinog vremena uzorkovanja. Prvenstveno se uzima u obzir biološki značaj rezultata. Statističke metode se mogu primeniti kao pomoćno sredstvo prilikom vrednovanja rezultata ispitivanja6. Statistički značaj ne treba da bude jedini faktor za utvrđivanje pozitivne reakcije. Dvosmisleni rezultati treba da budu pojašnjeni daljim ispitivanjem, najbolje modifikovanjem eksperimentalnih uslova.
Povećanje poliploidnosti može da ukaže na to da ispitivana supstanca ima potencijal da izazove numeričke hromozomske aberacije. Povećanje endoreduplikacije (endomitoze) može da ukaže na to da ispitivana supstanca ima potencijal da inhibira progresiju ćelijskog ciklusa7, 8.
Ispitivana supstanca za koju dobijeni rezultati ne zadovoljavaju gore navedene kriterijume, smatra se nemutagenom u ovom ispitivanju.
Iako većina eksperimenata daje jasno pozitivne ili negativne rezultate, u retkim slučajevima utvrđeni podaci ne omogućavaju donošenje konačne odluke o delovanju ispitivane supstance. Rezultati mogu ostati dvosmisleni ili pod znakom pitanja, bez obzira na broj obavljenih eksperimenata.
Pozitivni rezultati ispitivanja hromozomskih aberacija in vivo ukazuju na to da supstanca uzrokuje hromozomske aberacije u kostnoj srži ispitivane životinjske vrste. Negativni rezultati ukazuju na to da, pod navedenim eksperimentalnim uslovima, ispitivana supstanca ne izaziva aberacije u kostnoj srži ispitivane vrste.
Potrebno je razmotriti verovatnoću da ispitivana supstanca ili njeni metaboliti dospeju u krvotok ili, konkretno, do ciljnog tkiva (npr. sistemska toksičnost).
Izveštaj o ispitivanju mora da sadrži podatke o:
1) Vehikulumu:
- opravdanost izbora vehikuluma;
- rastvorljivost i stabilnost ispitivane supstance u vehikulumu, ukoliko su poznati.
2) Eksperimentalnim životinjama:
- vrsta/soj;
- broj, starost i pol životinja;
- izvor/poreklo, smeštaj, ishrana, itd.;
- pojedinačna telesna masa životinja na početku ispitivanja, uključujući raspon telesne mase, srednju vrednost i standardnu devijaciju za svaku grupu.
3) Uslovima ispitivanja:
- pozitivna i negativna (vehikulum) kontrola;
- rezultati ispitivanja za utvrđivanje raspona doza, ukoliko je obavljeno;
- obrazloženje za izbor doznih nivoa;
- detalji pripreme ispitivane supstance;
- detalji primene ispitivane supstance;
- obrazloženje puta primene;
- metode za potvrdu činjenice da je ispitivana supstanca dospela u sistemski krvotok ili do ciljnog tkiva, ukoliko je primenljivo;
- način preračunavanja koncentracije ispitivane supstance u hrani/vodi za piće (ppm) u dozu (mg/kg TM/dan), ukoliko je primenljivo;
- detalji o kvalitetu hrane i vode;
- detaljan opis rasporeda tretmana i uzorkovanja;
- metode za merenje toksičnosti;
- identitet supstance koja zaustavlja metafazu, njena koncentracija i trajanje tretmana;
- metode pripremanja mikroskopskih preparata;
- kriterijumi za prebrojavanje aberacija;
- broj analiziranih ćelija po životinji;
- kriterijumi za proglašavanje ispitivanja pozitivnim, negativnim ili dvosmislenim.
4) Rezultatima:
- znakovi toksičnosti;
- mitotski indeks;
- vrsta i broj aberacija, pojedinačno navedenih za svaku životinju;
- ukupan broj aberacija po grupi, srednja vrednost i standardna devijacija;
- broj ćelija sa aberacijama po grupi, srednja vrednost i standardna devijacija;
- promene u ploidiji, ukoliko su uočene;
- odnos doza-odgovor, gde je moguće;
- statističke analize, ukoliko postoje;
- podaci istovremene negativne kontrole;
- negativni kontrolni podaci iz literature sa opsezima, srednjim vrednostima i standardnim devijacijama;
- istovremeni pozitivni kontrolni podaci.
5) Obrazloženju rezultata.
6) Zaključcima.
1. Adler, I.D., (1984) Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J.M. Parry (Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., p. 275-306.
2. Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian In vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189, p. 157-165.
3. Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G., Bootman, J. and Henderson, L., (1990) in vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115-141.
4. Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B., (1994) Report from the Working Group on the In vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test. Mutation Res., 312, p. 305-312.
5. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 313-319.
6. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University Press, Cambridge. p. 184-232.
7. Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res. 119, p. 403-413.
8. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983) Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, p. 1362-1364.
B.12. MUTAGENOST - MIKRONUKLEUS TEST in vivo NA ERITROCITIMA SISARA
Metoda ispitivanja potpuno odgovara metodi OECD: TG 474, Mikronukleus test na eritrocitima sisara (1997).
Mikronukleus test in vivo kod sisara koristi se za otkrivanje oštećenja izazvanih ispitivanom supstancom na hromozomima ili mitotskom sistemu eritroblasta, na osnovu analize eritrocita iz kostne srži i/ili ćelija periferne krvi životinja, obično glodara.
Svrha mikronukleus testa jeste identifikacija supstanci koje izazivaju citogenetska oštećenja koja za posledicu imaju formiranje mikronukleusa koji sadrži zaostale fragmente hromozoma ili čitave hromozome.
Kada se eritroblast kostne srži razvije u polihromatski eritrocit, glavni nukleus biva istisnut; svaki nastali mikronukleus može da zaostane u citoplazmi koja inače nema jezgro. Vidljivost mikronukleusa u ovim ćelijama olakšana je s obzirom da im nedostaje glavno jezgro. Povećanje učestalosti polihromatskih eritrocita sa mikronukleusima kod tretiranih životinja pokazatelj je izazvanih hromozomskih oštećenja.
Za navedeno ispitivanje obično se koristi kostna srž glodara, jer se proizvodnja polihromatskih eritrocita odvija u tom tkivu. Mera mikronukleusnih nezrelih (polihromatskih) eritrocita u perifernoj krvi jednako je prihvatljiva kod bilo koje vrste kod koje je dokazana nesposobnost slezine da ukloni mikronukleusne eritrocite ili koja je pokazala odgovarajuću osetljivost na otkrivanje agensa koji izazivaju strukturne ili numeričke hromozomske aberacije. Mikronukleuse je moguće razlikovati na osnovu većeg broja kriterijuma. Navedeni kriterijumi obuhvataju identifikaciju prisustva ili odsustva kinetohore ili centromere DNK u mikronukleusima. Učestalost mikronukleusnih nezrelih (polihromatskih) eritrocita predstavlja ciljni pokazatelj ispitivanja. U slučajevima kada se životinje neprekidno tretiraju tokom četiri nedelje ili duže, kao krajnja tačka ispitivanja može se koristiti broj zrelih (normohromatskih) eritrocita u perifernoj krvi koji sadrže mikronukleuse u datom broju zrelih eritrocita.
In vivo mikronukleus test kod sisara posebno je važan za procenu mutagenosti jer uzima u obzir faktore metabolizma in vivo, farmakokinetku i procese reparacije DNK, iako isti mogu da se razlikuju između različitih vrsta i tkiva, kao i između različitih genetskih pokazatelja ispitivanja. in vivo ispitivanje korisno je i za dalje istraživanje mutagenih efekata otkrivenih u in vitro sistemu.
Ovo ispitivanje ne odgovara ukoliko se pojave dokazi da ispitivana supstanca ili reaktivni metabolit neće stići do ciljnog tkiva.
Videti Opšti uvod.
Centromera (Kinetohora) jeste područje(a) hromozoma sa kojima su tokom ćelijske deobe povezane niti deobnog vretena, a čime je omogućeno uredno kretanje kćerki hromozoma prema polovima kćerki ćelija.
Mikronukleusi jesu zasebni mali nukleusi, odvojeni od glavnog jedra ćelije, nastali tokom telofaze mitoze (mejoze) zaostajanjem fragmenata hromozoma ili čitavih hromozoma.
Normohromatski eritrociti jesu zreli eritrociti kojima nedostaju ribozomi. Mogu se razlikovati od nezrelih polihromatskih eritrocita na osnovu crta karakterističnih za prisustvo ribozoma.
Polihromatski eritrociti jesu nezreli eritrociti u prelaznoj fazi razvoja koji još uvek sadrže ribozome. Mogu se razlikovati od zrelih, normohromatskih eritrocita na osnovu crta karakterističnih za prisustvo ribozoma.
Životinje se odgovarajućim putem izlažu ispitivanoj supstanci. Ukoliko se koristi kostna srž, životinje se žrtvuju u odgovarajuće vreme nakon tretmana, nakon čega se uzima kostna srž i izrađuju i boje preparati1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Prilikom korišćenja periferne krvi, krv se uzima u odgovarajuće vreme nakon tretmana i izrađuju se preparati razmaza krvi koji se boje4, 8, 9, 10. Kod istraživanja sa perifernom krvlju vreme proteklo od poslednjeg izlaganja i ubiranja ćelija treba da bude što kraće. Preparati se analiziraju kako bi se utvrdilo postojanje mikronukleusa.
1.4.1. Pripreme
1.4.1.1. Izbor životinjske vrste
U slučaju korišćenja kostne srži preporučuje se primena miševa i pacova, iako se mogu koristiti i druge odgovarajuće vrste sisara. U slučaju korišćenja periferne krvi preporučuju se miševi. Mogu se koristiti i druge odgovarajuće vrste sisara pod uslovom da slezina te vrste ne uklanja eritrocite sa mikronukleusima ili da je vrsta pokazala odgovarajuću osetljivost za otkrivanje agensa koji izazivaju strukturne ili numeričke hromozomske aberacije. Koriste se mlade, zdrave životinje laboratorijskih sojeva koji se generalno upotrebljavaju. Prilikom započinjanja istraživanja odstupanje u telesnoj masi životinja treba da bude minimalno i ne veće od ± 20% prosečne telesne mase svakog pola.
1.4.1.2. Uslovi čuvanja i ishrane
Primenjuju se opšti uslovi dati u Opštem uvodu, iako se nastoji da se vlažnost održava na nivou od 50% do 60%.
1.4.1.3. Priprema životinja
Zdrave, odrasle životinje nasumično se grupišu u kontrolnu i tretirane grupe. Životinje se pojedinačno označavaju. Životinje treba da se aklimatizuju na laboratorijske uslove najmanje pet dana. Kavezi treba da budu takvi da se mogući uticaji svedu na minimum.
1.4.1.4. Priprema doza
Pre primene, čvrste ispitivane supstance se rastvaraju ili suspenduju u odgovarajućim vehikulumima i, ukoliko je potrebno, razblažuju. Tečne ispitivane supstance mogu direktno da se primene ili da se pre primene razblaže. Sveže preparate ispitivane supstance treba odmah upotrebiti, osim ukoliko podaci o stabilnosti pokazuju da je čuvanje prihvatljivo.
1.4.2. Uslovi ispitivanja
1.4.2.1. Vehikulum
Vehikulum ne sme da izaziva toksične efekte pri doznim nivoima u kojima se primenjuje i ne sme da postoji sumnja da će hemijski da reaguje sa ispitivanom supstancom. Ukoliko se primenjuju manje poznati vehikulumi, njihovo uključivanje u ispitivanje treba obrazložiti podacima koji ukazuju na njihovu kompatibilnost. Kad god je moguće, preporučuje se primena vodenog vehikuluma.
1.4.2.2. Kontrole
Istovremene pozitivne i negativne (vehikulum) kontrole treba da budu uključene u svako ispitivanje i za svaki pol. Osim tretiranja ispitivanom supstancom, sa životinjama u kontrolnim grupama postupa se na isti način kao i sa životinjama u tretiranim grupama.
Pozitivne kontrole treba da izazovu stvaranje mikronukleusa in vivo pri doznim nivoima za koje se očekuje da će dovesti do uočljivog povećanja u odnosu na negativnu kontrolu. Doze pozitivne kontrole biraju se tako da efekti budu jasni, ali da licu koja očitava rezultate odmah ne otkriju identitet šifriranih mikroskopskih preparata (slajdova). Dozvoljeno je da se pozitivna kontrola primeni putem koji je različit od puta primene ispitivane supstance, i uzorak se uzima samo jednom. Može se uzeti u obzir primena pozitivnih kontrola koje pripadaju istoj hemijskoj klasi kao i ispitivana hemikalija. Primeri supstanci koje se koriste kao pozitivne kontrole:
Tabela 1.
Supstanca | CAS br. | EINECS br. |
Etil metansulfonat | 62-50-0 | 200-536-7 |
N-etil-N-nitrozourea | 759-73-9 | 212-072-2 |
Mitomicin C | 50-07-7 | 200-008-6 |
Ciklofosfamid | 50-18-0 | 200-015-4 |
Trietilenmelamin | 51-18-3 | 200-083-5 |
Negativne kontrole, tretirane samo vehikulumom, sa kojima se postupa na isti način kao sa grupama obuhvaćenim tretmanom, treba da budu obuhvaćene svakim uzorkovanjem, osim ukoliko su dostupni podaci kontrole iz ranijih studija o varijabilnosti u okviru vrste i frekvenciji ćelija sa mikronukleusima. Ukoliko se na negativne kontrole primenjuje jedno uzorkovanje, najprimerenije je vreme prvog uzorkovanja. Istovremeno se koriste i netretirane kontrole (kontrolni uzroci), osim ukoliko postoje kontrolni podaci iz prethodnih ispitivanja ili objavljeni kontrolni podaci koji dokazuju da odabran vehikulum ne izaziva štetne ili mutagene efekte.
Kada se koristi periferna krv može biti prihvatljiv i uzorak uzet pre tretmana u svojstvu negativne kontrole (negativnog kontrolnog uzorka), ali samo kod kratkotrajnih istraživanja periferne krvi (npr. 1 do 3 tretmana), a kada se dobijeni podaci nalaze unutar očekivanog opsega s obzirom na raniju kontrolu.
1.5.1. Broj i pol životinja
Svaka tretirana i kontrolna grupa mora da obuhvati najmanje pet životinja istog pola na kojima je moguće obaviti analizu11. Ukoliko postoje podaci istraživanja obavljenog na istoj vrsti i istim putem izlaganja koji dokazuju da ne postoje značajnije razlike među polovima u toksičnosti, dovoljno je da se ispitivanje obavi kod samo jednog pola. U slučajevima u kojima izlaganje ljudi hemikalijama može da bude specifično za pol, kao na primer kod nekih farmaceutskih agenasa, ispitivanje treba obaviti sa životinjama odgovarajućeg pola.
1.5.2. Plan tretmana
Nije moguće preporučiti nikakav standardni plan tretmana (tj. jedan, dva ili više tretmana u intervalima od 24 sata). Uzorci dobijeni iz produženih režima tretmana prihvatljivi su pod uslovom da je dokazan pozitivan efekat ili, kada je u pitanju negativno ispitivanje, pod uslovom da je dokazana toksičnost ili upotrebljena granična doza i da je tretiranje nastavljeno sve do vremena uzorkovanja. Ispitivane supstance se mogu davati u obliku podeljenih doza, tj. u obliku dva tretmana tokom istog dana u razmaku od najviše nekoliko sati, kako bi se olakšalo davanje velike zapremine materijala.
Ispitivanje se može obaviti na dva načina:
a) Životinje se jednom tretiraju ispitivanom supstancom. Uzorci kostne srži uzimaju se najmanje dva puta, počevši najranije 24 sata nakon tretmana, ali najkasnije 48 sati nakon tretmana, uz primenu odgovarajućih intervala između uzimanja uzoraka. Uzorkovanje pre isteka perioda od 24 sata nakon tretmana potrebno je obrazložiti. Uzorci periferne krvi uzimaju se najmanje dva puta, počevši najranije 36 sati nakon tretmana, uz primenu odgovarajućih intervala nakon uzimanja prvog uzorka, ali ne duže od 72 sata nakon tretmana. Ukoliko se potvrdi pozitivna reakcija prilikom jednog intervala uzorkovanja, nije potrebno dalje uzorkovanje.
b) Ukoliko se primenjuje dva ili više tretmana dnevno (npr. dva ili više tretmana u intervalima od 24 sata), uzorke treba uzimati jednom, između 18 sati i 24 sata nakon konačnog tretmana kada je u pitanju kostna srž, i jednom između 36 sati i 48 sati nakon konačnog tretmana u slučaju periferne krvi12.
Mogu se dodatno primeniti drugi intervali uzorkovanja, kada je to značajno.
1.5.3. Dozni nivoi
Ukoliko se zbog nedostatka dostupnih podataka obavlja istraživanje sa ciljem utvrđivanja opsega doza, navedeno istraživanje treba da se obavi u istoj laboratoriji, uz korišćenje iste vrste, soja, pola i režima ispitivanja kao i u glavnom istraživanju13. Ukoliko postoji toksičnost, prilikom prvog uzorkovanja koriste se tri dozna nivoa. Navedene doze treba da obuhvate raspon od maksimalne do niske toksičnosti ili nivo bez toksičnosti. Prilikom drugog uzorkovanja potrebno je upotrebiti samo najvišu dozu. Najviša doza toksičnosti definiše se kao doza usled koje nastaju takvi znakovi toksičnosti da bi viša doza prouzrokovala uginjavanje životinja. Supstance specifične biološke aktivnosti u malim netoksičnim dozama (poput hormona i mitogena) mogu biti izuzetak od kriterijuma za izbor doza i tada doze treba da se procene u zavisnosti od slučaja. Najviša doza se može definisati i kao dozu koja dovodi do nekih indikacija toksičnosti u kostnoj srži (npr. smanjenje udela nezrelih eritrocita u ukupnom broju eritrocita u kostnoj srži ili perifernoj krvi).
1.5.4. Ispitivanje granične doze
Ukoliko u ispitivanju sa jednom dozom od najmanje 2.000 mg/kg TM u jednokratnom tretmanu ili u obliku dva tretmana tokom istog dana ne nastanu nikakvi primetni toksični efekti i ukoliko se na osnovu podataka o strukturno sličnim supstancama ne očekuje genotoksičnost, nije potrebno primeniti kompletno ispitivanje primenom tri dozna nivoa. Za ispitivanja koja traju do 14 dana granična doza iznosi 2.000 mg/kg TM/dan, a za ispitivanja koja traju duže od 14 dana iznosi 1.000 mg/kg TM/dan. Očekivana izloženost ljudi može da ukaže na potrebu za primenom više doze u ispitivanju granične doze.
1.5.5. Primena doza
Ispitivana supstanca obično se primenjuje intubacijom, i to korišćenjem želučane sonde ili odgovarajuće intubacione kanile ili intraperitonealnom injekcijom. Mogu se primeniti i ostali putevi izlaganja uz obrazloženje. Maksimalna zapremina tečnosti koja se može dati putem sonde ili injekcijom u jednom navratu zavisi od veličine eksperimentalne životinje. Zapremina ne treba da prelazi 2 mL/100 g TM. Upotrebu većih zapremina potrebno je obrazložiti. Izuzev u slučaju iritanasa i koroziva kod kojih se efekti ispoljavaju pri višim koncentracijama, odstupanja u zapremini treba da budu minimalna podešavanjem koncentracije, a kako bi se obezbedila konstantna zapremina pri svim doznim nivoima.
1.5.6. Pripremanje uzoraka kostne srži/krvi
Ćelije kostne srži obično se dobijaju iz butne ili goleničnih kostiju odmah nakon žrtvovanja. Ćelije se izoluju iz butne kosti i golenice, pripremljene i obojene primenom potvrđenih metoda ispitivanja. Periferna krv se uzima iz repne vene ili drugog odgovarajućeg krvnog suda. Krvne ćelije se odmah supravitalno oboje8, 9, 10 ili se izrade preparati u obliku razmaza koji se zatim oboje. Primenom boje koja je specifična za DNK (npr. akridin oranž14 ili Hoechst 33258 plus pironin-Y15) mogu se otkloniti neki od nedostataka vezanih za primenu DNK-nespecifičnih boja. Navedena prednost ne isključuje primenu uobičajenih boja (npr. Giemsa). Mogu da se primene i dodatni sistemi (npr. celulozne ploče za otklanjanje nukleusnih ćelija16), pod uslovom da je dokazano kako navedeni sistemi na odgovarajući način funkcionišu prilikom izrade mikronukleusnih preparata u laboratoriji.
1.5.7. Analiza
Udeo nezrelih eritrocita u ukupnom broju eritrocita (nezreli plus zreli) utvrđuje se za svaku životinju prebrojavanjem ukupnog broja od najmanje 200 eritrocita za kostnu srž i 1.000 eritrocita za perifernu krv17. Sve preparate, uključujući one pozitivne i negativne kontrole, potrebno je šifrirati pre mikroskopske analize. Za svaku životinju najmanje 2.000 nezrelih eritrocita podvrgava se analizi radi utvrđivanja pojave mikronukleusnih nezrelih eritrocita. Dodatni podaci mogu se dobiti prebrojavanjem zrelih eritrocita sa mikronukleusima. Prilikom analiziranja mikroskopskih preparata, udeo nezrelih eritrocita prema ukupnom broju eritrocita ne treba da bude manji od 20% kontrolne vrednosti. Kada se životinje neprekidno tretiraju tokom četiri nedelje ili duže, na pojavu mikronukleusa može se ispitati najmanje 2.000 zrelih eritrocita po životinji. Sistemi za automatizovanu analizu (analiza krvne slike i protočna citometrija suspenzije ćelija) predstavljaju prihvatljive alternative manuelnom ocenjivanju ukoliko su opravdani i validirani.
Podaci koji se odnose na pojedinačne životinje navode se tabelarno. Životinja predstavlja eksperimentalnu jedinicu. Za svaku analiziranu životinju zasebno se navodi: broj nezrelih vrednovanih eritrocita, broj mikronukleusnih nezrelih eritrocita i ukupan broj nezrelih eritrocita. Kada se životinje neprekidno tretiraju tokom četiri nedelje ili duže, potrebno je navesti i podatke o zrelim eritrocitima ukoliko se isti prikupljaju. Za svaku životinju se navodi odnos između broja nezrelih i ukupnog broja eritrocita i, ukoliko je potrebno, procenat mikronukleusnih eritrocita. Ukoliko ne postoje dokazi o razlikama među polovima, podaci dobijeni ispitivanjem oba pola mogu se sjediniti radi statističke analize.
2.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA
Postoji nekoliko kriterijuma za utvrđivanje pozitivnog rezultata, kao što je dozno zavisno povećanje broja mikronukleusnih ćelija ili jasno povećanje broja mikronukleusnih ćelija u grupi koja je primala jednu dozu, prilikom jednog intervala uzorkovanja. Prvenstveno se uzima u obzir biološka relevantnost rezultata. Mogu se primeniti statističke metode kao pomoćno sredstvo prilikom procene rezultata ispitivanja18, 19. Statistički značaj ne treba da bude jedini faktor za utvrđivanje pozitivne reakcije. Dvosmisleni rezultati treba da budu pojašnjeni daljim ispitivanjem, najbolje modifikovanjem eksperimentalnih uslova.
Ispitivana supstanca za koju rezultati ne zadovoljavaju gore navedene kriterijume, u ovom ispitivanju smatra se nemutagenom.
Iako većina eksperimenata daje jasno pozitivne ili negativne rezultate, u retkim slučajevima utvrđeni podaci ne omogućavaju donošenje konačne odluke o delovanju ispitivane supstance. Rezultati mogu ostati dvosmisleni ili pod znakom pitanja, bez obzira na broj obavljenih eksperimenata.
Pozitivni rezultati mikronukleus testa ukazuju na to da supstanca izaziva nastajanje mikronukleusa koji su posledica hromozomskih oštećenja ili oštećenja mitotskog sistema u eritroblastima eksperimentalne vrste životinja. Negativni rezultati ukazuju na to da, pod eksperimentalnim uslovima, ispitivana supstanca ne izaziva nastanak mikronukleusa u nezrelim eritrocitima eksperimentalne vrste životinja.
Potrebno je razmotriti verovatnoću da ispitivana supstanca ili njeni metaboliti dospeju u krvotok ili, konkretno, do ciljnog tkiva (npr. sistemska toksičnost).
Izveštaj o ispitivanju mora da sadrži podatke o:
1) Vehikulumu:
- opravdanost izbora vehikuluma;
- rastvorljivost i stabilnost ispitivane supstance u vehikulumu, ukoliko su poznati.
2) Eksperimentalnim životinjama:
- vrsta/soj;
- broj, starost i pol životinja;
- izvor, smeštaj, ishrana, itd.;
- pojedinačna telesna masa životinja na početku ispitivanja, uključujući raspon telesne mase, srednju vrednost i standardnu devijaciju za svaku grupu.
3) Uslovima ispitivanja:
- pozitivna i negativna (vehikulum) kontrola;
- podaci ispitivanja za utvrđivanje raspona doza, ukoliko je obavljeno;
- obrazloženje za izbor doznih nivoa;
- detalji pripreme ispitivane supstance
- detalji primene ispitivane supstance;
- obrazloženje puta primene;
- metode za potvrdu činjenice da je ispitivana supstanca dospela u sistemski krvotok ili do ciljnog tkiva, ukoliko je primenljivo;
- način preračunavanja koncentracije ispitivane supstance u hrani/vodi za piće (ppm) u dozu (mg/kg TM/dan), ukoliko je primenljivo;
- detalji o kvalitetu hrane i vode;
- detaljan opis rasporeda tretmana i uzorkovanja;
- metode pripreme mikroskopskih pločica (slajdova);
- metode merenja toksičnosti;
- kriterijum za vrednovanje mikronukleusnih nezrelih eritrocita;
- broj analiziranih ćelija po životinji;
- kriterijum za smatranje ispitivanja kao pozitivnog, negativnog ili dvosmislenog.
4) Rezultatima:
- znakovi toksičnosti;
- udeo nezrelih eritrocita prema ukupnom broju eritrocita;
- broj mikronukleusnih nezrelih eritrocita, zasebno dat za svaku životinju;
- srednja vrednost ± standardna devijacija broja mikronukleusnih nezrelih eritrocita po grupama;
- odnos doza-odgovor, gde je moguće;
- primenjene statističke analize i metode;
- podaci negativne kontrole iz konkurentne studije i ranije studije;
- podaci pozitivne kontrolne iz konkurentne studije.
4) Obrazloženju rezultata.
5) Zaključcima.
1. Heddle, J.A., (1973) A Rapid In vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, p. 187-190.
2. Schmid, W., (1975) The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, p. 9-15.
3. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res., 123, p. 61-118.
4. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and Heddle, J.A., (1990) The In vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, p. 29-80.
5. MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M., (1983) Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. Iin: "Developments in Science and Practice of Toxicology", Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, p. 555-558.
6. MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H., Ramel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D., (1987) Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res., 189, p. 103-112.
7. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E., (1990) The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol., 14, p. 513-522.
8. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr., (1990) The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Res., 245, p. 245-249.
9. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test, (1992) Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., p. 278, 83-98.
10. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), (1995) Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 153-159.
11. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B., (1994) In vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res., 312, p. 293-304.
12. Higashikuni, N. and Sutou, S., (1995) An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 313-319.
13. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M., (1992) Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 313-319.
14. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr., (1983) An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res., 120, p. 241-247.
15. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G., (1983) A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, p. 269-275.
16. Romagna, F. and Staniforth, C.D., (1989) The automated bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 213, p. 91-104.
17. Gollapudi, B. and McFadden, L.G., (1995) Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, p. 97-99.
18. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L., (1990) In vivo Cytogenetics Assay. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115-141.
19. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K., (1989) Statistical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 184-232.
B. 13/14. MUTAGENOST: ISPITIVANJE REVERZNIH MUTACIJA NA BAKTERIJAMA
Metoda ispitivanja potpuno odgovara metodi OECD: TG 471, Ispitivanje Bakterijskih Reverznih Mutacija (1997).
Za ispitivanje bakterijskih reverznih mutacija koriste se sojevi Salmonella-e typhimurium i Escherichia-e coli kojima su neophodne aminokiseline, sa ciljem otkrivanja tačkastih mutacija koje obuhvataju supstituciju, adiciju i deleciju jednog ili nekoliko parova baza DNK1, 2, 3. Princip ispitivanja bakterijskih reverznih mutacija je da detektuje mutacije koje dovode do reverzije mutacija prisutnih u ispitivanim sojevima i tako obnavljaju funkcionalnu sposobnost bakterija da sintetišu esencijalne aminokiseline. Reverzno mutirane bakterije mogu se otkriti na osnovu njihove sposobnosti rasta u odsustvu aminokiseline koja je potrebna roditeljskom ispitivanom soju.
Tačkaste mutacije su uzrok mnogih genetskih oboljenja kod ljudi i postoje znatni dokazi da tačkaste mutacije u onkogenima i tumor-supresorskim genima somatskih ćelija učestvuju u nastanku tumora kod ljudi i eksperimentalnih životinja. Ispitivanje bakterijskih reverznih mutacija je brzo, jeftino i relativno jednostavno za izvođenje. Mnogi eksperimentalni sojevi imaju nekoliko osobina koje ih čine osetljivijim na otkrivanje mutacija, uključujući osetljive sekvence DNK na mestima reverzije, povećanu propustljivost ćelija za veće molekule i eliminaciju sistema reparacije DNK ili pojačavanja procesa reparacije DNK molekula sklonih greškama. Specifičnost eksperimentalnih sojeva može da pruži korisne podatke o tipu mutacija koje izazivaju genotoksični agensi. Dostupna je velika baza rezultata ispitivanja bakterijskih reverznih mutacija za veliki broj različitih struktura i razvijene su dobro utemeljene metodologije za ispitivanje hemikalija sa različitim fizičkim i hemijskim svojstvima, uključujući isparljiva jedinjenja.
Videti Opšti uvod.
Ispitivanje reverzne mutacije na Salmonella typhimurium ili na Escherichia coli otkriva mutaciju u soju kome je neophodna aminokiselina (histidin odnosno triptofan, redom) koja proizvodi soj koji ne zavisi od spoljašnjeg izvora aminokiseline.
Mutageni koji dovode do supstitucije baznog para (mutageni supstitucije baznog para) jesu agensi koji izazivaju promene baza u DNK. U ispitivanju reverznih mutacija do ove promene može doći na mestu izvorne mutacije ili na drugom mestu u bakterijskom genomu.
Mutageni koji dovode do pomeranja okvira čitanja (mutageni pomaka okvira) jesu agensi koji izazivaju adiciju ili deleciju jednog ili više parova baza u DNK, menjajući time okvir očitavanja RNK.
Za ispitivanje bakterijskih reverznih mutacija koriste se prokariotske ćelije koje se od ćelija sisara razlikuju u karakteristikama kao što su: unošenje, metabolizam, hromozomska struktura i procesi reparacije DNK. Ispitivanja koja se obavljaju in vitro obično zahtevaju upotrebu egzogenog izvora metaboličke aktivacije. Sistemi za in vitro metaboličku aktivaciju ne mogu potpuno da oponašaju in vivo uslove kod sisara. Ispitivanje ne pruža direktne podatke o mutagenom i karcinogenom potencijalu supstance kod sisara.
Ispitivanje bakterijskih reverznih mutacija obično se primenjuje kao inicijalni skrining za genotoksičnu aktivnost i, posebno, kao aktivnost koja izaziva pojavu tačkastih mutacija. Opsežna baza podataka pokazala je da mnoge hemikalije koje su u ovom ispitivanju dale pozitivan rezultat pokazuju mutageno delovanje i u drugim ispitivanjima. Postoje primeri mutagenih agensa koji se ne mogu otkriti ovim ispitivanjem. Razlozi za ove nedostatke mogu se pripisati specifičnoj prirodi efekta koji se detektuje, razlikama u metaboličkoj aktivaciji ili u bioraspoloživosti. Faktori koji povećavaju osetljivost ispitivanja bakterijskih reverznih mutacija mogu da dovedu do precenjivanja mutagene aktivnosti.
Ispitivanje bakterijskih reverznih mutacija možda neće biti prikladno za procenu određenih klasa hemikalija, npr. visoko baktericidnih jedinjenja (npr. određeni antibiotici), kao i onih za koje se smatra (ili je poznato) da specifično interferiraju sa sistemom replikacije ćelija sisara (npr. neki inhibitori topoizomeraze i neki analozi nukleotida). U tim slučajevima mogu da budu primerenija ispitivanja mutacija na ćelijama sisara.
Iako je mnoštvo jedinjenja, koja daju pozitivan rezultat u ovom ispitivanju, karcinogeno za sisare, povezanost nije apsolutna. Ona zavisi od klase hemikalije, a postoje i karcinogeni koji se ne mogu otkriti ovim ispitivanjem zbog toga što deluju posredstvom drugih mehanizama koji nisu genotoksični ili putem mehanizama koji ne postoje u ćelijama bakterija.
Suspenzije bakterijskih ćelija izlažu se ispitivanoj supstanci u prisustvu i odsustvu egzogenog sistema metaboličke aktivacije. U okviru metode inkorporacije u podlogu, navedene suspenzije mešaju se sa nadslojem agara i odmah se nanose na minimalnu količinu podloge. U metodi preinkubacije smeša za tretman se inkubira, a zatim meša sa nadslojem agara pre nanošenja na minimalnu količinu podloge. Kod obe tehnike, nakon dva ili tri dana inkubacije, broje se revertantne kolonije i upoređuju sa brojem spontanih revertantnih kolonija na kontrolnim podlogama sa vehikulumom.
Opisano je nekoliko postupaka za izvođenje ispitivanja bakterijskih reverznih mutacija. Među navedenim obično se koristi metoda inkorporacije u podlogu1, 2, 3, 4, metoda preinkubacije2, 3, 5, 6, 7, 8, metoda fluktuacije9, 10 i metoda suspenzije11. Opisane su i modifikacije namenjene ispitivanju gasova ili para12.
Postupci opisani u metodi ispitivanja prvenstveno se odnose na metodu inkorporacije u podlogu i metodu preinkubacije. Obe metode prikladne su za izvođenje eksperimenta sa i bez metaboličke aktivacije. Neke supstance se mogu efikasnije otkriti primenom metode preinkubacije. Navedene supstance pripadaju hemijskim klasama koje uključuju alifatične nitrozamine kratkog lanca, dvovalentne metale, aldehide, azo-boje i diazo jedinjenja, pirolizidinske alkaloide, alil jedinjenja i nitro jedinjenja3. Određene klase mutagena ne mogu se uvek detektovati korišćenjem standardnih postupaka, poput metode inkorporacije u podlogu ili metode preinkubacije. Navedene klase mutagena smatraju se "posebnim slučajevima" i za njihovo otkrivanje preporučuje se korišćenje alternativnih postupaka. Mogu se identifikovati sledeći "posebni slučajevi" (zajedno s primerima postupaka koji se mogu upotrebiti za njihovo otkrivanje): azo-boje i diazo jedinjenja3, 5, 6, 13, gasovi i isparljive hemikalije12, 14, 15, 16 i glikozidi17, 18. Odstupanje od standardnog postupka treba da bude naučno opravdano.
1.5.1. Pripreme
1.5.1.1. Bakterije
Sveže kulture bakterija treba da budu uzgojene do kasne eksponencijalne ili rane stacionarne faze rasta (približno 109 ćelija po mL). Kulture u kasnoj stacionarnoj fazi ne treba upotrebljavati. Potrebno je da kulture koje se koriste tokom eksperimenta sadrže visok titar vijabilnih bakterija. Titar se može pokazati ili iz krivih rasta na osnovu podataka kontrole iz ranijih studija ili u svakom ispitivanju utvrđivanjem broja vijabilnih ćelija eksperimentom na podlozi.
Preporučena temperatura inkubacije iznosi 37°C.
Potrebno je upotrebiti najmanje pet sojeva bakterija. Sojevi treba da obuhvate četiri soja S. typhimurium (TA1535; TA1537 ili TA97a ili TA97; TA98; i TA100) koji su se pokazali kao pouzdani i reproducibilni između laboratorija. Navedena četiri soja S. typhimurium imaju GC parove baza na primarnom mestu reverzne mutacije i poznato je da oni možda neće otkriti određene oksidujuće mutagene, agense koji dovode do unakrsnog povezivanja i hidrazine. Ovakve supstance mogu se otkriti pomoću sojeva E. coli WP2 ili S. typhimurium TA10219 koji imaju AT bazni par na primarnom mestu reverzne mutacije. Preporučena kombinacija sojeva je:
- S. typhimurium TA1535 i
- S. typhimurium TA1537 ili TA97 ili TA97a i
- S. typhimurium TA98 i
- S. typhimurium TA100 i
- E. coli WP2 uvrA ili E. coli WP2 uvrA (pKM101) ili S. typhimurium TA102.
Kako bi se otkrili mutageni koji dovode do unakrsnog povezivanja, može biti potrebno da se uključi TA102 ili dodati soj E. coli koji je vičan u popravci DNK (npr. E. coli WP2 ili E. coli WP2 (PKM101)).
Potrebno je primeniti prihvaćene postupke za pripremanje "stock" kulture, verifikaciju markera i čuvanje. Potreba za aminokiselinama za rast treba da se demonstrira za svaki preparat zamrznute "stock" kulture (za histidinom za sojeve S. typhimurium i triptofanom za sojeve E. coli). Na sličan način potrebno je proveriti ostale fenotipske karakteristike, odnosno prisustvo ili odsustvo plazmida R-faktora ako je potrebno (tj. rezistencija na ampicilin kod sojeva TA98, TA100 i TA97a ili TA97, WP2 uvrA i WP2 uvrA (pKM101) i rezistencija na ampicilin + tetraciklin kod soja TA102); postojanje svojstvenih mutacija (tj. rfa mutacija kod S. typhimurium putem osetljivosti na kristal-violet i uvrA mutacija kod E. Coli ili uvrB mutacija kod S. typhimurium, putem osetljivosti na ultraljubičastu svetlost)2, 3. Sojevi treba da daju takav broj spontanih revertantnih kolonija na podlogama koji se nalazi u okviru raspona učestalosti koji se očekuje na osnovu podataka iz ranije kontrole laboratorije i koji se po mogućstvu nalazi unutar raspona koji se navodi u literaturi.
1.5.1.2. Podloga
Primenjuje se odgovarajući minimalni agar (npr. koji sadrži Vogel-Bonner-ovu minimalnu podlogu "E" i glukozu) i nadsloj agara koji sadrži histidin i biotin ili triptofan koji omogućava nekoliko deoba ćelija1, 2, 9.
1.5.1.3. Metabolička aktivacija
Bakterije treba da budu izložene ispitivanoj supstanci i u prisustvu i u odsustvu sistema metaboličke aktivacije. Najčešće korišćen sistem je postmitohondrijalna frakcija sa kofaktorom (S9) pripremljena od jetre glodara tretiranih agensima enzimske indukcije poput Aroclor-a 12541, 2 ili kombinacije fenobarbitona i ß-naftoflavona18, 20, 21. Postmitohondrijalna frakcija obično se koristi u koncentracijama u rasponu od 5% v/v do 30% v/v u obliku S9-mešavine. Izbor i uslovi sistema metaboličke aktivacije mogu da zavise od klase hemikalije koja se ispituje. U nekim slučajevima može da bude prikladno da se iskoristi više od jedne koncentracije postmitohondrijalne frakcije. Za azo-boje i diazo-jedinjenja može da se pokaže primerenijom primena sistema reduktivne metaboličke aktivacije6, 13.
1.5.1.4. Ispitivana supstanca/Preparat
Pre tretiranja bakterija, čvrste ispitivane supstance treba da se rastvore ili suspenduju u odgovarajućim vehikulumima i, ukoliko je potrebno, da se razblaže. Tečne ispitivane supstance mogu se direktno dodati ispitivanim sistemima i/ili se razblažiti pre tretiranja. Sveže preparate ispitivane supstance treba upotrebiti odmah, osim ukoliko podaci o stabilnosti pokazuju da je čuvanje prihvatljivo.
Ne sme da postoji sumnja da vehikulum hemijski reaguje sa ispitivanom supstancom. Vehikulum treba da bude kompatibilan sa preživljenjem bakterija i S9 aktivnošću22. Ukoliko se primenjuju manje poznati vehikulumi, njihovo uključivanje u ispitivanje treba da bude potkrepljeno podacima koji ukazuju na njihovu kompatibilnost. Kad god je moguće, preporučuje se vodeni vehikulum. Prilikom ispitivanja supstanci koje su nestabilne u vodi, organski rastvarači koji se koriste ne smeju sadržati vodu.
1.5.2. Uslovi ispitivanja
1.5.2.1. Eksperimentalni sojevi
Videti odeljak 1.5.1.1. ove metode.
1.5.2.2. Koncentracija kojoj se izlažu bakterije
Među kriterijima koji se uzimaju u obzir prilikom utvrđivanja najveće količine ispitivane supstance koja će se primeniti je citotoksičnost i rastvorljivost u konačnoj smeši namenjenoj za primenu.
Može da bude korisno da se utvrdi toksičnost i rastvorljivost u preliminarnom eksperimentu. Citotoksičnost se može otkriti preko redukcije broja revertantnih kolonija, bistrenjem ili smanjivanjem pozadine ili stepena preživljavanja tretiranih kultura. Citotoksičnost neke supstance može se promeniti usled prisustva sistema metaboličke aktivacije. Nerastvorljivost je potrebno oceniti kao precipitaciju (taloženje) u konačnoj mešavini pod stvarnim eksperimentalnim uslovima, a koja je vidljiva golim okom.
Preporučena maksimalna ispitivana koncentracija za rastvorne supstance koje nisu citotoksične iznosi 5 mg/podloga ili 5 µL/podloga. Za supstance koje nisu citotoksične i koje se ne rastvaraju pri 5 mg/podloga ili 5 µL/podloga, jedna ili više ispitivanih koncentracija treba da bude nerastvorna u konačnoj smeši namenjenoj za tretman. Ispitivane supstance koje su ciotoksične već pri nivoima nižim od 5 mg/podloga ili 5 µL/podloga treba ispitivati sve do citotoksične koncentracije. Precipitat ne sme da utiče na ocenjivanje (prebrojavanje).
Potrebno je upotrebiti najmanje pet različitih koncentracija ispitivane supstance (koje je moguće analizirati) u intervalima od otprilike polovine log (tj. √10) između tačaka ispitivanja u inicijalnom eksperimentu. Manji intervali mogu se pokazati prikladnim prilikom ispitivanja veze između koncentracije i odgovora. Ispitivanje koncentracija iznad 5 mg/podloga ili 5 µL/podloga može da se uzme u obzir prilikom vrednovanja supstance koje sadrže značajne količine potencijalno mutagenih nečistoća.
1.5.2.3. Pozitivne i negativne kontrole
Svako ispitivanje uključuje istovremene pozitivne i negativne kontrole (vehikulum) specifične za soj, sa i bez metaboličke aktivacije. Potrebno je odabrati koncentracije pozitivne kontrole koje će pokazati efikasno obavljanje svakog eseja.
Za eseje sa sistemom metaboličke aktivacije, referentnu supstancu pozitivne kontrole treba odabrati na osnovu vrste bakterijskih sojeva koji se koriste.
Primeri supstanci odgovarajućih pozitivnih kontrola za eseje sa metaboličkom aktivacijom:
Tabela 1.
CAS br. | EINECS br. | Nazivi |
781-43-1 | 212-308-4 | 9,10-dimetilantracen |
57-97-6 | 200-359-5 | 7,12-dimetilbenzo[a]antracen |
50-32-8 | 200-028-5 | benzo[a]piren |
613-13-8 | 210-330-9 | 2-aminoantracen |
50-18-0 |
| ciklofosfamid |
6055-19-2 | 200-015-4 | ciklofosfamid monohidrat |
Supstanca koja predstavlja odgovarajuću pozitivnu kontrolu za metodu reduktivne metaboličke aktivacije:
Tabela 2.
CAS br. | EINECS br. | Nazivi |
573-58-0 | 209-358-4 | Kongo crveno |
2-aminoantracen ne treba upotrebljavati kao jedini indikator efikasnosti S9-smeše. Ukoliko se koristi 2-aminoantracen, svaki lot S9 takođe treba da nosi obeležje mutagena koji zahteva metaboličku aktivaciju mikrozomalnim enzimima, npr. benz[a]piren, dimetilbenzantracen.