Prethodni

Supstance date u Tabeli 3 primeri su pozitivnih kontrola specifičnih za soj za eseje koji se sprovode bez egzogenog sistema metaboličke aktivacije:

Tabela 3.

Mogu se koristiti i druge referentne supstance kao pozitivne kontrole. Uzima se u obzir upotreba hemikalije srodne klase kao pozitivna kontrola, kada je dostupna.

Potrebno je uključiti negativne kontrole koje se sastoje samo od vehikuluma, bez ispitivane supstance i sa kojima se postupa na isti način kao i sa tretiranim grupama. Potrebno je koristiti netretirane kontrole, osim ukoliko postoje kontrolni podaci iz ranijih studija koji pokazuju da izabrani vehikulum ne dovodi do štetnih ili mutagenih efekata.

1.5.3. Postupak

Kod metode inkorporacije u podlogu1, 2, 3, 4 bez metaboličke aktivacije, obično se 0,05 mL ili 0,1 mL ispitivanih rastvora, 0,1 mL sveže bakterijske kulture (koja sadrži otprilike 108 vijabilnih ćelija) i 0,5 mL sterilnog pufera pomeša sa 2,0 mL nadsloja agara. Za esej sa metaboličkom aktivacijom, obično se 0,5 mL smeše za metaboličku aktivaciju, koja sadrži odgovarajuću količinu postmitohondrijalne frakcije (u rasponu od 5% v/v do 30% v/v u smeši za metaboličku aktivaciju) meša s nadslojem agara (2,0 mL) zajedno s bakterijama i ispitivanom supstancom/ispitivanim rastvorom. Sadržaj svake epruvete izmeša se i prelije preko površine minimalne agar hranjive podloge. Nadsloj agara ostavlja se kako bi se stvrdnuo pre inkubacije.

Kod metode preinkubacije2, 3, 5, 6 ispitivana supstanca/ispitivan rastvor se preinkubira zajedno s ispitivanim sojem (koji sadrži otprilike 108 vijabilnih ćelija) i sterilnim puferom ili sistemom metaboličke aktivacije (0,5 mL), obično u trajanju od 20 minuta ili duže, pri temperaturi od 30°C do 37°C, a pre mešanja s nadslojem agara i prelivanja preko površine minimalne agar podloge. Obično se 0,05 mL ili 0,1 mL ispitivane supstance/ispitivanog rastvora, 0,1 mL bakterija i 0,5 mL S9-smeše ili sterilnog pufera pomeša sa 2,0 mL nadsloja agara. Epruvete tokom preinkubacionog perioda treba snabdeti vazduhom, primenom uređaja za mućkanje.

Potrebno je da se primene po tri podloge za svaki dozni nivo u cilju odgovarajuće procene varijabilnosti. Prihvatljivo je da se primene po dve podloge u slučajevima kada je to naučno opravdano. Povremeni gubitak podloge ne čini nužno esej nevažećim.

Gasovite i isparljive supstance potrebno je ispitivati pomoću odgovarajućih metoda, npr. u zapečaćenim sudovima12, 14, 15, 16.

1.5.4. Inkubacija

Sve podloge u određenom ispitivanju treba inkubirati na temperaturi od 37°C tokom 48 do 72 sata. Nakon perioda inkubacije prebrojava se broj revertantnih kolonija po podlozi.

2. PODACI

2.1. OBRADA REZULTATA

Podaci se navode u obliku broja revertantnih kolonija po podlozi. Navodi se broj revertantnih kolonija na podlogama negativne (kontrola sa vehikulumom i netretirana kontrola, ukoliko su primenjene) i pozitivne kontrole. Potrebno je navesti broj i srednju vrednost revetrantnih kolonija po podlozi i standardnu devijaciju za ispitivanu supstancu i pozitivne i negativne (netretirane i/ili vehikulum) kontrole.

Ne postoji potreba za verifikovanjem jasno pozitivne reakcije. Ako se dobiju dvosmisleni rezultati, treba ih razjasniti u daljim ispitivanjima, najbolje modifikovanjem eksperimentalnih uslova. Negativne rezultate potrebno je potvrditi u zavisnosti od slučaja. U slučajevima u kojima se potvrda negativnih rezultata ne smatra neophodnom, daje se obrazloženje. U narednim eksperimentima potrebno je razmotriti modifikaciju parametara ispitivanja s ciljem proširenja opsega ocenjivanih uslova. Parametri ispitivanja koje je moguće modifikovati obuhvataju razmak između koncentracija, metodu tretmana (inkorporacija u podlogu ili tečna preinkubacija) i uslove metaboličke aktivacije.

2.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Postoji nekoliko kriterijuma za utvrđivanje pozitivnog rezultata, kao što je povećanje u zavisnosti od koncentracije u okviru ispitivanog opsega i/ili reproducibilnog povećanja broja revertantnih kolonija po podlozi pri jednoj ili više koncentracija, kod najmanje jednog soja, sa ili bez sistema metaboličke aktivacije23. Prvenstveno se uzima u obzir biološki značaj rezultata. Mogu da se primene statističke metode kao pomoć prilikom ocenjivanja rezultata ispitivanja24. Statistički značaj ne treba da bude jedini činilac pomoću koga se utvrđuje pozitivni odgovor.

Ispitivana supstanca za koju rezultati ne zadovoljavaju gore navedene kriterijume smatra se nemutagenom u ovom ispitivanju.

Iako većina eksperimenata daje jasne pozitivne ili negativne rezultate, u retkim slučajevima utvrđeni podaci ne omogućavaju donošenje konačnog suda o delovanju ispitivane supstance. Rezultati mogu da ostanu dvosmisleni ili pod znakom pitanja, bez obzira koliko se puta eksperiment ponovi.

Pozitivni rezultati ispitivanja bakterijskih reverznih mutacija ukazuju na to da supstanca uzrokuje tačkaste mutacije supstitucijom baze ili pomeranjem okvira čitanja u genomu kod Salmonella typhimurium odnosno Escherichia coli. Negativni rezultati ukazuju na to da, pod eksperimentalnim uslovima, ispitivana supstanca ne izaziva mutagene promene kod eksperimentne vrste.

3. IZVEŠTAJ

Izveštaj o ispitivanju mora da sadrži podatke o:

1) Vehikulumu:

- obrazloženje izbora vehikuluma;

- rastvorljivost i stabilnost ispitivane supstanca u vehikulumu, ukoliko su poznati.

2) Sojevima:

- upotrebljeni sojevi;

- broj ćelija po kulturi;

- karakteristike soja.

3) Uslovima ispitivanja:

- količina ispitivane supstance po podlozi (mg/podloga ili µL/podloga) s obrazloženjem za izbor doze i broj podloga po koncentraciji;

- upotrebljena podloga;

- tip i sastav sistema metaboličke aktivacije, uključujući kriterijume prihvatljivosti;

- postupci tretmana.

4) Rezultatima:

- znakovi toksičnosti;

- znakovi precipitacije;

- broj za pojedinačne podloge;

- prosečan broj revertantnih kolonija po podlozi i standardna devijacija;

- odnos doza-odgovor, ako je moguće;

- statističke analize, ukoliko postoje;

- podaci negativne (vehikulum) i pozitivne kontrole iz konkurentne studije, sa opsezima, srednjim vrednostima i standardnim devijacijama;

- podaci negativne (vehikulum) i pozitivne kontrole iz ranije studije, sa opsezima srednjim vrednostima i standardnim devijacijama;

5) Obrazloženju rezultata.

6) Zaključcima.

4. LITERATURA

1. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E., (1975) Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347-364.

2. Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173-215.

3. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E., (1994) Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation Res., 312, p. 217-233.

4. Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V., (1986) The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 168, p. 69-240.

5. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y., (1975) Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, p. 91-96.

6. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M., (1980) Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests. In: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens. Ed. Norpoth K.H. and Garner, R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York. p. 273-285.

7. Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. and Foster, R., (1980) Bacterial Mutation Assays. In: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed. D.J. Kirkland, Cambridge University Press,p. 13-61.

8. Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L., (1987) Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety, 8, p. 167-177.

9. Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A., (1976) Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens. Mutation Res., 38, p. 33-42.

10. Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. Bridges (1984) The Fluctuation Test in Bacteria. In: Handbook of Mutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J., Legator, M., Nichols, W. And Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, p. 141-161.

11. Thompson, E.D. and Melampy, P.J., (1981) An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium. Environmental Mutagenesis, 3, p. 453-465.

12. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994) Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307, p. 335-344.

13. Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and Vaughn, V.L., (1984) Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay. Mutation Res., 136, p. 33-47.

14. Zeiger, E., Anderson, B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K., (1992) Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 19, p. 2-141.

15. Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G., (1977) Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water. In Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. Sobels (Eds.) Elsevier, Amsterdam, p. 249-258.

16. Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, L.D., (1987) Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay. Environmental Mutagenesis, 9, p. 421-441.

17. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T., (1979) Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium. Cancer Res., 39, p. 3780-3782.

18. Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N., (1980) Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, p. 4961-4965.

19. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G., (1990) Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains. Mutagenesis, 5, p. 285-291.

20. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., (1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems. In: "In vitro metabolic Activation in Mutagenesis Testing" Eds. F.J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, p. 85-88.

21. Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992) Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 175-177.

22. Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N., (1981) Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test. Mutation Res., p. 88343-350.

23. Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E., (1987) Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity. Mutation Res. 189, p. 83-91.

24. Mahon, G.A.T., Green, M.H.L., Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W.D. and Tweats, D.J., (1989) Analysis of Data from Microbial Colony Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J., Cambridge University Press, p. 28-65.

B.15. ISPITIVANJE MUTAGENOSTI I SKRINING ZA GENSKE MUTACIJE KARCINOGENOSTI-SACCAHAROMYCES CEREVISIAE

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Videti Opšti uvod.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIP METODE

Merenje produkcije genskih mutacija izazvanih hemijskim agensima sa i bez metaboličke aktivacije može da se izvodi na više haploidnih i diploidnih sojeva kvasca Saccharomyces cerevisiae.

Koriste se rani sistemi mutacije kod haploidnih sojeva, poput merenja mutacije od crvenih mutanata zavisnih od adenina (ade-1, ade-2) do belih mutanata dvostruko zavisnih od adenina i selektivni sistemi poput indukcije rezistencije na kanavnain i cikloheksimid.

Najobimnije validiran sistem reverznih mutacija uključuje primenu haploidnog soja HV 185-14C koji nosi oker nonsense mutacije ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 i trp 5-48, koje su reverzibilne mutageninima supstitucije baza koji izazivaju mutacije specifičnih lokacija ili mutacije oker supresora. HV 185-14C takođe nosi marker his 1-7, missense mutaciju koja se reverzno mutira uglavnom kroz mutacije na drugoj lokaciji, kao i marker hom 3-10 koga reverzno mutiraju mutageni pomaka okvira čitanja.

U diploidnim sojevima S. cerevisiae jedini soj koji ima široku primenu je D7 koji je homozigotan za ilv 1-92.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Nisu propisani.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Pripreme

Rastvore ispitivanih hemikalija i kontrole treba pripremiti neposredno pre ispitivanja, uz primenu odgovarajućeg vehikuluma. Kada su u pitanju organska jedinjenja koja nisu rastvorna u vodi, ne treba upotrebljavati rastvor jači od 2% v/v za organske rastvarače kao što su etanol, aceton ili dimetilsulfoksid (DMSO). Konačna koncentracija vehikuluma ne treba u značajnoj meri da utiče na ćelijsku vijabilnost i osobine rasta.

1.6.1.1. Metabolička aktivacija

Ćelije treba da budu izložene ispitivanim hemikalijama i u prisustvu i u odsustvu odgovarajućeg egzogenog sistema metaboličke aktivacije.

Najčešće korišćen sistem jeste postmitohondrijalna frakcija sa kofaktorom pripremljena od jetre glodara prethodno tretiranih agensima enzimske indukcije. Za metaboličku aktivaciju može biti prihvatljiva primena i drugih vrsta, tkiva, postmitohondrijalnih frakcija ili postupaka.

1.6.2. Uslovi ispitivanja

1.6.2.1. Eksperimentalni sojevi

Haploidni soj HV 185-14C i diploidni soj D7 su sojevi koji se najčešće primenjuju u ispitivanjima genskih mutacija. Mogu da odgovaraju i drugi sojevi.

1.6.2.2. Podloge

Radi utvrđivanja preživljavanja i broja mutanata koriste se odgovarajuće podloge za kultivisanje.

1.6.2.3. Primena pozitivnih i negativnih kontrola

Potrebno je istovremeno izvesti pozitivne, netretirane i kontrole vehikuluma. Za svaki posmatrani specifični efekat mutacije primenjuju se odgovarajuće hemikalije pozitivne kontrole.

1.6.2.4. Koncentracija izlaganja

Potrebno je upotrebiti najmanje pet odgovarajuće raspoređenih koncentracija ispitivane supstance. Najviša ispitivana koncentracija toksičnih supstanci ne sme da smanji preživljenje ispod 5% do 10%. Supstance koje su relativno nerastvorne u vodi treba ispitati do granice rastvorljivosti, uz primenu odgovarajućih postupaka. Za netoksične supstance koje se lako rastvaraju u vodi gornju granicu koncentracije treba odrediti u zavisnosti od slučaja.

1.6.2.5. Uslovi inkubacije

Podloge se inkubiraju od četiri do sedam dana na temperaturi od 28°C do 30°C na tamnom mestu.

1.6.2.6. Frekvencija spontanih mutacija

Potrebno je da se koriste subkulture kod kojih je frekvenca spontanih mutacija u okviru prihvaćenog normalnog opsega.

1.6.2.7. Broj replikata

Neophodno je da se primene najmanje tri podloge po koncentraciji za esej prototrofa nastalih usled genske mutacije i za vijabilnost ćelija. U slučaju eksperimenta koji koriste markere kao što je hom 3-10 sa niskim stopom mutacija, broj hranljivih podloga mora da se poveća kako bi se dobili statistički relevantni podaci.

1.6.3. Postupak

Tretiranje sojeva S. cerevisiae obično se obavlja u postupku ispitivanja u tečnoj podlozi koji obuhvata ćelije u fazi mirovanja ili ćelije u rastu. Inicijalne eksperimente treba izvoditi na ćelijama u rastu: 1-5 x 107 ćelija/mL izlaže se ispitivanoj hemikaliji do 18 sati na temperaturi od 28°C do 37°C uz mešanje. Tokom tretmana dodaje se odgovarajuća količina sistema metaboličke aktivacije kada je prikladno. Na kraju tretmana ćelije se centrifugiraju, ispiraju i zasejavaju na odgovarajuću podlogu. Nakon inkubacije, podloge se ocenjuju na preživljavanje i indukciju genskih mutacija.

Ukoliko je prvi eksperiment negativan, drugi eksperiment se izvodi uz primenu ćelija u fazi mirovanja. Ukoliko je prvi eksperiment pozitivan, potvrđuje se obavljanjem odgovarajućeg nezavisnog eksperimenta.

2. PODACI

Podaci se navode tabelarno. Navodi se: broj izbrojanih kolonija, broj mutanata, preživljavanje i učestalost mutacija. Sve rezultate potrebno je potvrditi u nezavisnom eksperimentu. Podaci se procenjuju primenom odgovarajućih statističkih metoda.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži podatke o:

- upotrebljenom soju;

- uslovima ispitivanja: faza mirovanja ili ćelije u rastu, sastav podloge, temperatura inkubacije i trajanje, sistem metaboličke aktivacije;

- uslovima tretiranja: nivoi izlaganja, postupak i trajanje tretmana, temperatura na kojoj se izvodi, pozitivne i negativne kontrole;

- broju izbrojanih kolonija, broj mutanata, preživljavanje i učestalost mutanata, odnos doza-odgovor, ukoliko je moguće, statističku procenu podataka;

- obrazloženju rezultata,

- tumačenju rezultata.

3.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Videti Opšti uvod.

4. LITERATURA

Videti Opšti uvod.

B.16. MITOTSKA REKOMBINACIJA - SACCAROMYCES CEREVISIAE

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Videti Opšti uvod.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIP METODE

Mitotska rekombinacija kod Saccaromyces cerevisiae može se otkriti između gena (ili obično između gena i njegove centromere), kao i unutar gena. Prvi navedeni događaj naziva se mitotskim krosingoverom (crossing-over) i stvara recipročne proizvode, dok drugi događaj najčešće nije recipročan i naziva se konverzijom gena. Krosingover se obično ispituje na osnovu stvaranja recesivnih homozigotnih kolonija ili sektora stvorenih u heterozigotnom soju, dok se konverzija gena ispituje na osnovu stvaranja prototrofnih revertanata koji nastaju u auksotrofnom heteroalelnom soju koji nosi dva različita defektna alela istog gena. Najčešće korišćeni sojevi namenjeni otkrivanju mitotske konverzije gena su: D4 (heteroalel na ade 2 i trp 5), D7 (heteroalel na trp 5), BZ34 (heteroalel na arg 4) i JDl (heteroalel na his 4 i trp 5). Mitotski krosingover koji stvara crvene i ružičaste homozigotne sektore može da se analizira kod D5 ili D7 (čime se ujedno meri mitotska konverzija gena i reverzna mutacija na ilv 1-92), pri čemu su oba soja heteroalelna za komplementarne alele ade 2.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Nisu propisani.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Priprema

Rastvori ispitivanih hemikalija i kontrolnih ili referentnih jedinjenja pripremaju se neposredno pre ispitivanja, uz primenu odgovarajućeg vehikuluma. Kada su u pitanju organska jedinjenja koji nisu rastvorljiva u vodi, ne treba upotrebljavati rastvor jači od 2% v/v organskih rastvarača kao što su etanol, aceton ili dimetilsulfoksid (DMSO). Konačna koncentracija vehikuluma ne sme u značajnoj meri da utiče na ćelijsku vijabilnost i osobine rasta ćelija.

1.6.1.1. Metabolička aktivacija

Ćelije treba da budu izložene ispitivanim hemikalijama i u prisustvu i u odsustvu odgovarajućeg egzogenog sistema metaboličke aktivacije. Najčešće korišćen sistem je postmitohondrijalna frakcija sa kofaktorom, pripremljena od jetre glodara prethodno tretiranih agensima koji indukuju enzime. Za metaboličku aktivaciju mogu da se primene i druge vrste, tkiva, postmitohondrijalne frakcije ili postupci.

1.6.2. Uslovi ispitivanja

1.6.2.1. Eksperimentalni sojevi

Najčešće se primenjuju sojevi diploidi D4, D5, D7 i JD1. Mogu da se koriste i drugi sojevi.

1.6.2.2. Podloga

Za određivanje preživljavanja i učestalosti mitotske rekombinacije koriste se odgovarajuće podloge.

1.6.2.3. Upotreba pozitivnih i negativnih kontrola

Istovremeno je potrebno izvoditi pozitivne, netretirane i kontrole vehikuluma. Primenjuju se odgovarajuće hemikalije pozitivne kontrole za svaki specifični pokazatelj ispitivanja rekombinacije.

1.6.2.4. Koncentracije izlaganja

Potrebno je upotrebiti najmanje pet odgovarajuće raspoređenih koncentracija ispitivane supstance. Među faktorima koji se uzimaju u obzir nalaze se citotoksičnost i rastvorljivost. Najniža koncentracija ne sme da ima efekat na vijabilnost ćelija. Najviša ispitivana koncentracija toksičnih hemikalija ne sme da smanji preživljenje ispod 5% do 10%. Hemikalije koje su relativno nerastvorne u vodi treba ispitivati do njihove granice rastvorljivosti uz primenu odgovarajućih postupaka. Za netoksične supstance koje se lako rastvaraju u vodi gornja granica koncentracije određuje se u zavisnosti od slučaja.

Ćelije mogu da se izlože ispitivanim hemikalijama u fazi mirovanja ili tokom rasta u trajanju do 18 sati. Za dugotrajne tretmane kulture treba mikroskopski pregledati na formiranje spora, čije postojanje čini ispitivanje nevažećim.

1.6.2.5. Uslovi inkubacije

Podloge se inkubiraju na tamnom mestu, od četiri do sedam dana, na temperaturi od 28°C do 30°C. Podloge koje se koriste za ispitivanje crvenih i ružičastih homozigotnih sektora koji su nastali mitotskim krosingoverom treba držati u frižideru (na temperaturi oko 4°C) tokom jednog do dva dana pre ocenjivanja, a kako bi se omogućio razvoj odgovarajućih pigmentovanih kolonija.

1.6.2.6. Učestalosti spontane mitotske rekombinacije

Koriste se subkulture sa učestalošću spontanih mutacija mitotske rekombinacije u okviru prihvaćenog normalnog opsega.

1.6.2.7. Broj replikata

Za ispitivanje prototrofa nastalih usled mitotske konverzije gena i za vijabilnost ćelija neophodno je primeniti najmanje tri podloge po koncentraciji. U slučaju ispitivanja recesivnih homozigota koje nastaju mitotskim krosingoverom, potrebno je povećati broj podloga kako bi se obezbedio odgovarajući broj kolonija.

1.6.3. Postupak

Tretiranje sojeva S. Cerevisiae obično se obavlja postupkom u tečnoj podlozi koji uključuje ćelije u fazi mirovanja ili ćelije u rastu. Prethodni eksperimenti se obavljaju na ćelijama u rastu: 1-5 x 107 ćelija/mL izlaže se ispitivanoj hemikaliji do 18 sati na temperaturi od 28°C do 37°C uz mešanje. Tokom tretmana dodaje se odgovarajuća količina sistema za metaboličku aktivaciju, kada je prikladno.

Na kraju tretmana ćelije se centrifugiraju, ispiraju i zasejavaju na odgovarajuće podloge za kultivisanje. Nakon inkubacije, hranljive podloge se ocenjuju na preživljenje i indukciju mitotske rekombinacije.

Ukoliko je prvi eksperiment negativan, treba obaviti drugi eksperiment uz primenu ćelija u fazi mirovanja. Ukoliko je prvi eksperiment pozitivan, ovaj rezultat se potvrđuje u nezavisnom eksperimentu.

2. PODACI

Podaci se navode tabelarno. Navodi se: broj izbrojanih kolonija, broj rekombinanata, preživljenje i frekvenca rekombinanata.

Potrebno je potvrditi rezultate u nezavisnom eksperimentu.

Podaci se procenjuju primenom odgovarajućih statističkih metoda.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži podatke o:

- upotrebljenom soju;

- uslovima ispitivanja: stacionarna faza ili ćelije u rastu, sastav podloge, temperatura inkubacije i trajanje, sistem metaboličke aktivacije;

- uslovima tretiranja: koncentracija kojoj su ćelije izložene, postupak i trajanje tretmana, temperatura, pozitivne i negativne kontrole;

- broju izbrojanih kolonija, broj rekombinanata, preživljenje i učestalost rekombinacije, odnos doza-odgovor, ukoliko je moguće, statistička procena podataka;

- obrazloženju rezultata;

- tumačenju rezultata.

3.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Videti Opšti uvod.

4. LITERATURA

Videti Opšti uvod.

B.17. MUTAGENOST - IN VITRO ISPITIVANJE GENSKE MUTACIJE NA ĆELIJAMA SISARA

1. METODA ISPITIVANJA

Ova metoda potpuno odgovara metodi OECD: TG 476, In vitro ispitivanje genskih mutacija na ćelijama sisara (Mammalian Cell Gene Mutation Test) (1997).

1.1. UVOD

Za otkrivanje genskih mutacija izazvanih hemijskim supstancama može se koristiti ispitivanje genskih mutacija na ćelijama sisara in vitro. Odgovarajuće ćelijske linije obuhvataju L5178Y ćelije mišjeg limfoma, CHO, CHO-AS52 i V79 linije ćelija kineskog hrčka i TK6 ćelije humanog limfoblasta1. U ovim ćelijskim linijama najčešće posmatrani genski pokazatelji mere mutaciju na timidin kinazi (u daljem tekstu: TK) i hipoksantin-gvanin fosforibozil transferazi (u daljem tekstu: HPRT) i transgenu za ksantin-gvanin fosforibozil transferazu (u daljem tekstu: XPRT). Ispitivanja mutacija na TK, HPRT i XPRT otkrivaju različite spektre genetskih pojava. Autozomalna lokacija TK i XPRT može da omogući otkrivanje genetskih pojava (npr. velikih delecija), a koje nisu otkrivene na HPRT lokusu na X-hromozomima2, 3, 4, 5, 6.

In vitro ispitivanje genske mutacije na ćelijama sisara mogu da se izvode na kulturama definisanih ćelijskih linija ili ćelijskih sojeva. Ćelije koje se upotrebljavaju biraju se na osnovu sposobnosti rasta u kulturi i stabilnosti učestalosti spontanih mutacija.

Ispitivanja koja se obavljaju in vitro generalno zahtevaju primenu egzogenog izvora metaboličke aktivacije. Ovaj sistem metaboličke aktivacije ne može u potpunosti da oponaša in vivo uslove kod sisara. Potrebno je da se izbegavaju uslovi koji dovode do rezultata koji ne oslikavaju intrinzičnu mutagenost. Usled promena pH, osmolalnosti ili visokih nivoa citotoksičnosti mogu da nastanu pozitivni rezultati koji ne oslikavaju intrinzičnu mutagenost7.

Navedeno ispitivanje koristi se za otkrivanje mogućih mutagena i karcinogena za sisare. Mnoga jedinjenja koja daju pozitivan rezultat u ovom ispitivanju karcinogeni su za sisare; međutim, međusobna zavisnost između ovog ispitivanja i karcinogenosti nije besprekorna. Korelacija zavisi od klase hemikalije i ima sve više dokaza da postoje karcinogeni koji se ne mogu otkriti ovim ispitivanjem zbog toga što deluju putem drugih, negenotoksičnih mehanizama ili mehanizama koji ne postoje u bakterijskim ćelijama6.

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Napredna direktna mutacija jeste genska mutacija iz roditeljskog tipa u mutirani oblik koja dovodi do izmene ili gubitka enzimske aktivnosti ili funkcije kodiranog proteina.

Mutageni supstitucije baznog para jesu supstance koje dovode do supstitucije jednog ili nekoliko parova baza u DNK.

Mutageni pomaka okvira jesu supstance koje dovode do adicije ili delecije jednog ili više parova baza u molekulu DNK.

Vreme ekspresije fenotipa jeste vremenski period tokom koga nepromenjeni genski proizvodi bivaju odstranjeni iz novomutiranih ćelija.

Frekvenca mutanata jeste broj primećenih mutiranih ćelija podeljen brojem vijabilnih ćelija.

Relativni ukupni rast jeste povećanje broja ćelija tokom vremena u poređenju s kontrolnom populacijom ćelija. Izračunava se kao proizvod rasta u suspenziji u odnosu na vreme efikasnosti kloniranja negativne kontrole i u odnosu na negativnu kontrolu.

Relativni rast u suspenziji jeste povećanje broja ćelija tokom perioda ekspresije u odnosu na negativnu kontrolu.

Vijabilnost jeste efikasnost kloniranja tretiranih ćelija u vreme zasejavanja u selektivnim uslovima nakon perioda ekspresije.

Preživljavanje jeste efikasnost kloniranja tretiranih ćelija nakon što se iste zaseju na podlogu na kraju perioda tretmana. Preživljavanje se obično izražava u odnosu na preživljenje kontrolne populacije ćelija.

1.3. PRINCIP METODE

Ćelije bez timidin kinaze (u daljem tekstu: TK) su zbog mutacije TK+/- > TK-/- otporne na citotoksične efekte analoga pirimidina trifluorotimidina (u daljem tekstu: TFT). Ćelije s timidin kinazom osetljive su na TFT koji inhibira ćelijski metabolizam i zaustavlja dalju deobu ćelija. Zbog toga mutirane ćelije mogu da se razmnožavaju u prisustvu TFT-a, dok normalne ćelije, koje sadrže timidin kinazu, ne mogu. Slično se ćelije bez HPRT-a ili XPRT-a selektuju po otpornosti na 6-tiogvanin (u daljem tekstu: TG) ili 8-azagvanin (u daljem tekstu: AG). Svojstva ispitivane supstance treba pažljivo razmotriti ukoliko se u bilo kojem ispitivanju genske mutacije u ćelijama sisara ispituje analog baze ili jedinjenje srodno selektivnom agensu. Na primer, potrebno je istražiti svaku selektivnu toksičnost na koju se sumnja da postoji kod ispitivane supstance, a u odnosu na mutirane i nemutirane ćelije. Potrebno je potvrditi efikasnost selekcijskog sistema/agensa, a kada se ispituju hemikalije koje su strukturno srodne selektivnom agensu8.

Ćelije u suspenziji ili jednoslojnoj kulturi izlažu se ispitivanoj supstanci sa i bez metaboličke aktivacije, tokom odgovarajućeg vremenskog perioda i subkultivišu se kako bi se utvrdila citotoksičnost i kako bi se omogućila fenotipska ekspresija pre selekcije mutanata9, 10, 11, 12, 13. Citotoksičnost se obično utvrđuje merenjem relativne efikasnosti kloniranja (preživljenje) ili relativnog ukupnog rasta kultura nakon perioda tretiranja. Tretirane kulture održavaju se u podlozi za rast tokom dovoljnog vremenskog perioda, koje je karakteristično za svaki izabrani lokus i vrstu ćelija, a kako bi se omogućila skoro optimalna fenotipska ekspresija indukovanih mutacija. Frekvenca mutanata utvrđuje se zasejavanjem poznatog broja ćelija u podlozi koja sadrži selektivni agens, kako bi se detektovale mutirane ćelije, kao i u podlozi bez selektivnog agensa kako bi se utvrdila efikasnost kloniranja (vijabilnost). Nakon odgovarajućeg vremena inkubacije kolonije se prebroje. Frekvenca mutacija izračunava se iz broja mutiranih kolonija u selektivnoj podlozi i broja kolonija u neselektivnoj podlozi.

1.4. OPIS METODE

1.4.1. Pripreme

1.4.1.1. Ćelije

Za primenu u ovom ispitivanju na raspolaganju je više vrsta ćelija, uključujući i suklonove ćelija L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 ili TK6. Za vrstu ćelija koje se koriste u ovom ispitivanju treba da je dokazana osetljivost na hemijske mutagene, visoka efikasnost kloniranja i stabilna učestalost pojave spontanih mutanata. Potrebno je proveriti da ćelije nisu kontaminirane mikoplazmom i ukoliko su kontaminirane ne smeju se upotrebiti.

Ispitivanje treba da bude dizajnirano tako da ima unapred određenu osetljivost i potencijal. Broj upotrebljenih ćelija, kultura i koncentracija ispitivane supstance treba da oslikava navedene definisane parametre14. Najmanji broj vijabilnih ćelija koje prežive tretman i broj onih koje se upotrebljavaju u svakoj fazi eksperimenta treba da se zasniva na učestalosti spontanih mutacija. Preporuka je da se upotrebi onoliki broj ćelija koji je najmanje jednak deseterostrukoj recipročnoj vrednosti učestalosti spontanih mutacija. Preporučuje se primena najmanje 106 ćelija. Treba da su dostupni odgovarajući podaci o ćelijskom sistemu iz ranije studije kako bi ukazali na konzistentnost ispitivanja.

1.4.1.2. Podloge i uslovi kultivisanja

Upotrebljavaju se odgovarajuće podloge i uslovi inkubacije (posude za kulture, temperatura, koncentracija CO2 i vlažnost). Podloge se biraju u zavisnosti od selektivnog sistema i vrste ćelija koje se upotrebljavaju u ispitivanju. Posebno je važno izabrati uslove kultivisanja koji obezbeđuju optimalan rast ćelija tokom razdoblja ekspresije i sposobnost formiranja kolonija mutiranih i nemutiranih ćelija.

1.4.1.3. Pripremanje kultura

Ćelije se razmnože iz početnih kultura, zaseju na podlogu i inkubiraju na temperaturi od 37°C. Pre upotrebe u ovom ispitivanju možda će iz kultura biti potrebno odstraniti već postojeće mutirane ćelije.

1.4.1.4. Metabolička aktivacija

Ćelije je potrebno izložiti ispitivanoj supstanci i u prisustvu i u odsustvu odgovarajućeg sistema metaboličke aktivacije. Najčešće korišćen sistem je postmitohondrijalna frakcija sa kofaktorom (S9), pripremljena od jetre glodara tretiranih agensima koji indukuju enzime poput Aroclora 125415, 16, 17, 18 ili kombinacije fenobarbitona i ß-naftoflavona19, 20.

Postmitohondrijalna frakcija obično se koristi u koncentracijama u rasponu od 1% v/v do 10% v/v u konačnoj podlozi za ispitivanje. Izbor i stanje sistema metaboličke aktivacije mogu da zavisi od klase hemikalije koja se ispituje. U nekim slučajevima može biti prikladno da se koristi više od jedne koncentracije postmitohondrijalne frakcije.

Niz razvojnih promena, uključujući konstruisanje genetskim inžinjeringom ćelijskih linija sa ekspresijom specifičnih aktivišućih enzima, mogu da obezbede mogućnost za endogenu aktivaciju. Izbor upotrebljenih ćelijskih linija treba da bude naučno utemeljen (npr. na osnovu značaja izoenzima citohroma P450 za metabolizam ispitivane supstance).

1.4.1.5. Ispitivana supstanca/Preparat

Čvrste ispitivane supstance se rastvaraju ili suspenduju u odgovarajućim rastvaračima ili vehikulumima i, ukoliko je potrebno, razblažuju pre tretiranja ćelija. Tečne ispitivane supstance mogu direktno da se dodaju eksperimentnim sistemima odnosno da se razblaže pre tretiranja. Sveže preparate ispitivane supstance treba odmah upotrebiti, osim ukoliko podaci o stabilnosti pokazuju da je čuvanje prihvatljivo.

1.4.2. Uslovi ispitivanja

1.4.2.1. Behikulum

Ne sme da postoji sumnja da će rastvarač/vehikulum hemijski da reaguje sa ispitivanom supstancom. Rastvarač/vehikulum treba da bude kompatibilan sa preživljenjem ćelija i aktivnošću S9. Ukoliko se primenjuju rastvarači/vehikulumi koja nisu poznati, njihovo uključivanje u ispitivanje treba da bude potkrepljeno podacima koji ukazuju na njihovu kompatibilnost. Kad god je moguće, preporučuje se da se prvo uzme u obzir primena vodenog rastvarača/vehikuluma. Prilikom ispitivanja supstance koje su nestabilne u vodi, organski rastvarači koji se koriste ne smeju da sadrže vodu. Voda se može odstraniti dodavanjem molekularnog sita.

1.4.2.2. Koncentracije izlaganja

Među kriterijumima koje je potrebno uzeti u obzir prilikom utvrđivanja najviše koncentracije su: citotoksičnost, rastvorljivost u ispitivanome sistemu i promene u pH i osmolalnosti.

Citotoksičnost je potrebno utvrditi sa i bez metaboličke aktivacije u glavnom eksperimentu uz primenu odgovarajućeg pokazatelja ćelijskog integriteta i rasta, kao što je relativna efikasnosti kloniranja (preživljavanje) ili relativni ukupni rast. Može da bude korisno da se odredi citotoksičnost i rastvorljivost u preliminarnom eksperimentu.

Upotrebljava se najmanje četiri koncentracije koje se mogu analizirati. Kada postoji citotoksičnost, navedene koncentracije treba da obuhvate raspon od maksimalne do niske ili bez toksičnosti. Ovo najčešće znači da razlika među nivoima koncentracija ne treba da bude veća od faktora između √2 i √10. Ukoliko se najviša koncentracija temelji na citotoksičnosti, tada za posledicu treba da ima relativno preživljenje (relativnu efikasnost kloniranja) ili relativni ukupni rast od oko 10% do 20% (ali ne manje od 10%). Za relativno necitotoksične supstance najviša ispitivana koncentracija treba da bude 5 mg/mL 5 µL/mL, ili 0,01 M, u zavisnosti od toga koja koncentracija je niža.

Relativno nerastvorne supstance treba ispitati do ili iznad njihove granice rastvorljivosti u uslovima kultivisanja. Dokaze nerastvorljivosti potrebno je utvrditi u konačnoj podlozi za tretiranje kome su izložene ćelije. Može da bude korisno da se rastvorljivost proceni na početku i na kraju tretmana, s obzirom da rastvorljivost može da se promeni tokom izlaganja u ispitivanom sistemu, usled prisutnosti ćelija, S9, seruma, itd. Nerastvorljivost se može otkriti golim okom. Precipitat ne sme da utiče na prebrojavanje.

1.4.2.3. Kontrole

U svaki eksperiment treba da budu uključene istovremene pozitivne i negativne (rastvarač ili vehikulum) kontrole, sa i bez metaboličke aktivacije. Kada se koristi metabolička aktivacija, hemikalija pozitivne kontrole treba da bude ona kojoj je za mutageni odgovor potrebna aktivacija.

Primeri supstanci pozitivne kontrole:

Tabela 1.

Mogu da se primene i druge odgovarajuće referentne supstance kao pozitivne kontrole, npr. ukoliko laboratorija raspolaže bazom podataka iz ranijih studija o 5-brom 2'-dezoksiuridinu (CAS br. 59-14-3, EINECS br. 200-415-9) tada mogu da se primene ove referentne supstance. Kada su dostupne klase hemikalija koje su vezi sa pozitivnom kontrolom, razmatra se njihovo korišćenje.

Potrebno je uključiti negativne kontrole koje se sastoje samo od rastvarača ili vehikuluma u podlozi za tretiranje i sa kojima je postupano na isti način kao i sa grupama obuhvaćenim tretmanom. Treba koristiti i netretirane kontrole, osim ukoliko postoje kontrolni podaci iz prethodnih ispitivanja koji dokazuju da odabran rastvarač ne izaziva štetne ili mutagene efekte.

1.4.3. Postupak

1.4.3.1. Tretiranje ispitivanom supstancom

Ćelije u proliferaciji izlažu se ispitivanoj supstanci sa i bez metaboličke aktivacije. Trajanje izloženosti treba da bude odgovarajuće (obično se postiže efekat sa tri do šest sati). Vreme izlaganja može da se produži na jedan ili više ćelijskih ciklusa.

Pri ispitivanju svake koncentracije mogu da se tretiraju jedna ili dve kulture. Kada se upotrebljava jedna kultura, potrebno je povećati broj koncentracija kako bi se obezbedio odgovarajući broj kultura za analizu (npr. najmanje osam koncentracija koje se mogu analizirati). Potrebno je upotrebiti duplikat kulture negativne kontrole (rastvarača).

Gasovite ili isparljive supstance ispituju se primenom odgovarajućih metoda, npr. u zatvorenim posudama za kulture21, 22.

1.4.3.2. Merenje preživljavanja, vijabilnosti i učestalosti mutacija

Na kraju ekspozicije ćelije se ispiraju i kultivišu kako bi se odredio nivo preživljenja i kako bi se omogućila ekspresija mutiranog fenotipa. Merenje citotoksičnosti, na osnovu utvrđivanja relativne efikasnosti kloniranja (preživljenje) ili relativnog ukupnog rasta kultura, obično se počinje nakon tretmana.

Svakom lokusu je potrebno određeno minimalno vreme za skoro optimalnu ekspresiju fenotipa novoindukovanih mutacija (HPRT i XPRT zahtevaju najmanje 6-8 dana, dok su TK-u potrebna najmanje dva dana). Ćelije se uzgajaju u podlozi sa i bez selektivnih agenasa radi utvrđivanja broja mutanata i efikasnosti kloniranja, redom. Merenje vijabilnosti (koja se koristi za izračunavanje učestalosti mutacija) započinje na kraju vremena ekspresije zasejavanjem u neselektivnu podlogu.

Ukoliko ispitivana supstanca prilikom ispitivanja L5178Y TK+/- da pozitivan rezultat, kolonije treba razvrstati po veličini (izmeriti veličinu) kod najmanje jedne od ispitivanih kultura (najviša pozitivna koncentracija) i kod negativnih i pozitivnih kontrola. Ukoliko ispitivana supstanca prilikom ispitivanja L5178Y TK+/- da negativan rezultat, kolonije je potrebno razvrstati po veličini kod negativnih i pozitivnih kontrola. Razvrstavanje kolonija po veličini može da se obavi i kod ispitivanja u kojima se primenjuje TK6TK+/-.

2. PODACI

2.1. OBRADA REZULTATA

Podaci treba da obuhvate citotoksičnost i vijabilnost, broj kolonija i učestalost mutacija za tretirane i kontrolne kulture. U slučaju pozitivne reakcije u eksperimentu L5178Y TK+/-, kolonije se prebrojavaju prema kriterijumu velikih i malih kolonija kod najmanje jedne koncentracije ispitivane supstance (najviše pozitivne koncentracije) i kod negativne i pozitivne kontrole. Molekularna i citogenetska priroda velikih i malih kolonija mutanata detaljno je istražena23, 24. U eksperimentu TK+/-, kolonije se prebrojavaju prema kriterijumu kolonija normalnog rasta (velike) i kolonija usporenog rasta (male)25. Mutirane ćelije koje su pretrpele najopsežnija genetska oštećenja imaju produženo vreme udvostručavanja i zbog toga formiraju male kolonije. Opseg navedenih oštećenja obično se kreće od gubitka čitavog gena do hromozomskih aberacija koje su vidljive u kariotipu. Indukcija mutanata s malim kolonijama dovodi se u vezu sa hemikalijama koje uzrokuju velike hromozomske aberacije26. Mutirane ćelije koje su manje pogođene rastu brzinom koja je slična roditeljskim ćelijama i formiraju velike kolonije.

Navodi se i preživljavanje (relativne efikasnosti kloniranja) ili relativni ukupni rast. Učestalost mutacija treba da bude izražena u obliku broja mutiranih ćelija u odnosu na broj preživelih ćelija.

Potrebno je navesti podatke o pojedinačnim kulturama. Podaci se navode tabelarno.

Ne postoji potreba za verifikovanjem jasno pozitivne reakcije. Dvosmisleni rezultati se pojašnjavaju daljim ispitivanjem, tj. najbolje modifikovanjem eksperimentalnih uslova. Negativne rezultate potrebno je potvrditi u zavisnosti od slučaja. U slučajevima u kojima se potvrda negativnih rezultata ne smatra neophodnom, potrebno je navesti obrazloženje. Za dvosmislene ili negativne rezultate kod daljih eksperimenata koji se nadovezuju na prethodne potrebno je razmotriti modifikaciju parametara ispitivanja s ciljem proširenja opsega vrednovanih uslova. Parametri ispitivanja koje je moguće modifikovati obuhvataju razmak izeđu koncentracija i uslove metaboličke aktivacije.

2.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Postoji nekoliko kriterijuma za utvrđivanje pozitivnog rezultata, kao što je povećanje učestalosti mutacija u zavisnosti od koncentracije ili reproducibilno. Prvenstveno je potrebno uzeti u obzir biološki značaj rezultata. Mogu da se primene statističke metode kao pomoć prilikom vrednovanja rezultata ispitivanja. Statistički značaj ne treba da bude jedini kriterijum za pozitivnu reakciju.

Ispitivana supstanca za koju rezultati ne zadovoljavaju gore navedene kriterijume smatra se nemutagenom u ovom ispitivanju. Iako većina eksperimenta daje jasno pozitivne ili negativne rezultate, u retkim slučajevima utvrđeni podaci onemogućavaju donošenje konačne odluke o delovanju ispitivane supstance. Rezultati mogu da ostanu dvosmisleni ili pod znakom pitanja, bez obzira koliko se puta eksperiment ponovi.

Pozitivni rezultati in vitro ispitivanja genskih mutacija u ćelijama sisara ukazuju na to da ispitivana supstanca uzrokuje genske mutacije u upotrebljenim kultivisanim ćelijama sisara. Od najvećeg značaja je postojanje reproducibilnog pozitivnog odgovora zavisnog od koncentracije. Negativni rezultati pokazuju da, pod eksperimentalnim uslovima, ispitivana supstanca ne uzrokuje genske mutacije u upotrebljenim kultivisanim ćelijama sisara.

3. IZVEŠTAJ

Izveštaj o ispitivanju mora da sadrži podatke o:

1) Rastvaraču/vehikulumu:

- obrazloženje izbora rastvarača/vehikuluma;

- rastvorljivost i stabilnost ispitivane supstance u rastvaraču/vehikulumu, ukoliko su poznati.

2) Ćelijama:

- vrsta i poreklo ćelija;

- broj ćelijskih kultura;

- broj prolaza ćelija, ukoliko je primenljivo;

- metode za održavanje ćelijske kulture, ukoliko je primenljivo;

- odsustvo mikoplazme.

3) Uslovima ispitivanja:

- logička osnova za izbor koncentracija i broj kultura, uključujući, podatke o citotoksičnosti i ograničenja zbog rastvorljivosti, ukoliko postoje;

- sastav podloge, koncentracija CO2;

- koncentracija ispitivane supstance;

- zapremina vehikuluma i dodate ispitivane supstance;

- temperatura inkubacije;

- vreme inkubacije;

- trajanje tretmana;

- gustina ćelija tokom tretmana;

- tip i sastav sistema metaboličke aktivacije, uključujući kriterijume prihvatljivosti;

- pozitivne i negativne kontrole;

- dužina perioda ekspresije (uključujući broj zasejanih ćelija i supkultura i raspored prehranjivanja, ukoliko odgovara);

- selektivni agensi;

- kriterijum za smatranje ispitivanja pozitivnim, negativnim ili dvosmislenim;

- metode primenjene za prebrojavanje vijabilnih ćelija i mutiranih ćelija;

- definicija kolonija čija se veličina i vrsta uzimaju u obzir (uključujući kriterijume za "male" i "velike" kolonije, ako odgovara).

4) Rezultatima:

- znakovi toksičnosti;

- znakovi precipitacije;

- podaci o pH i osmolalnosti tokom izlaganja ispitivanoj supstanci, ukoliko su utvrđeni;

- veličina kolonija ukoliko je ista utvrđena barem za negativne i pozitivne kontrole;

- adekvatnost laboratorije da otkrije mutante malih kolonija primenom sistema L5178Y TK+/-, kada je potrebno;

- odnos doza - odgovor, gde je moguće;

- statističke analize, ukoliko postoje;

- podaci negativne (rastvarač/vehikulum) i pozitivne kontrole iz konkurentne studije;

- podaci negativne (rastvarač/vehikulum) i pozitivne kontrole iz ranije studije, sa opsezima, srednjom vrednosti i standardnom devijacijom;

- učestalost mutanata.

5) Obrazloženju rezultata.

6) Zaključcima.

4. LITERATURA

1. Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, CoLD Spring Harbor Laboratory, New York.

2. Chu, E.H.Y. and Malling, H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306-1312.

3. Liber, H.L. and Thilly, W.G. (1982). Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts. Mutation Res., 94, 467-485.

4. Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and DearfieLD, K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, 394-403.

5. Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, 121-128.

6. Aaron, C.S., BolcsfoLDi, G.,Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. And Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, 235-239.

7. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicfity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-204.

8. Clive, D., McCuen, R., Spestor, J.F.S., Piper, C. and Mavournin, K.H. (1983). Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, 225-251.

9. Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 196, 17-36.

10. Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., Loveday, K.S., O'Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135-141.

11. Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.

12. Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191- Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191- Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.

13. Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D. (1984). Procedures for the L5178Y/TK+/- -TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mutagenisity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239-268.

14. Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., Ed., Cambridge University Press, pp. 66-101.

15. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.

16. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.

17. Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and Brown M.M.M. (1979). Validation and Characterization of the L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59, 61-108.

18. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173-215.

19. Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, 175-177.

20. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

21. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103.

22. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, 795-801.

23. Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and Hozier, J.C. (1990). Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 51-55.

24. Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard, B.E., Batson, A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J. (1985). Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, 161-174.

25. Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B. (1990). Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229, 89-102.

26. Moore, M.M. and Doerr, C.L. (1990). Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small- Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- -3.7.2C Mouse Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5, 609-614.

B.18. OŠTEĆENJE I REPARACIJA DNK - VANREDNA SINTEZA DNK - ĆELIJE SISARA IN VITRO

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Videti Opšti uvod.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIP METODE

Ispitivanje vanredne sinteze DNK (u daljem tekstu: UDS) meri sintezu DNK za reparaciju nakon isecanja i otklanjanja odsečka DNK koji sadrži region oštećenja koji je izazvan hemijskim i fizičkim agensima. Ispitivanje se zasniva na ugrađivanju timidina obeleženog tricijumom (u daljem tekstu: 3H-TdR) u DNK ćelije sisara koje se ne nalaze u S fazi ćelijskog ciklusa. Aktivno preuzimanje 3H-TdR može da se odredi autoradiografijom ili tečnim scintilacionim brojanjem (u daljem tekstu: LSC) DNK iz tretiranih ćelija. Ćelije sisara u kulturi, osim ukoliko se ne koriste primarni hepatociti pacova, tretiraju se ispitivanim agensom sa i bez egzogenog sistema metaboličke aktivacije. UDS može da se meri i u in vivo sistemima.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Nisu propisani.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Preparati

Ispitivane hemikalije i kontrolne ili referentne supstance pripremaju se u podlozi za rast ili se rastvaraju ili suspenduju u odgovarajućim vehikulumima i zatim se dodatno razblažuju u podlozi za rast za upotrebu u eksperimentu. Konačna koncentracija vehikuluma ne sme da utiče na vijabilitet ćelija.

U eseju mogu da se koriste primarne kulture hepatocita pacova, ljudskih limfocita ili utvrđenih ćelijskih linija (npr. ljudski diploidni fibroblasti).

Ćelije treba izložiti ispitivanoj hemikaliji i u prisustvu i u odsustvu odgovarajućeg sistema metaboličke aktivacije.

1.6.2. Uslovi ispitivanja

1.6.2.1. Broj kultura

Potrebno je najmanje dve kulture ćelija za autoradiografiju i šest kultura (ili manje ukoliko je to naučno opravdano) za određivanje LSC UDS za svaku eksperimentalnu tačku.

1.6.2.2. Upotreba negativnih i pozitivnih kontrola

U svako ispitivanje treba da budu uključene istovremene pozitivne i negativne (netretirane i/ili vehikulum) kontrole, sa i bez metaboličke aktivacije.

Primeri pozitivnih kontrola za eksperiment sa hepatocitima pacova obuhvataju 7,12-dimetil benzantracen (7,12-DMBA) ili 2-acetil aminofluoren (2-AAF). U slučaju utvrđenih ćelijskih linija, 4-nitrokvinolin-N-oksid (4-NQO) predstavlja primer pozitivne kontrole i za autoradiografske i za LSC eseje koji se izvode bez metaboličke aktivacije. N-dimetil nitrozamin je primer jedinjenja pozitivne kontrole kada se koriste sistemi metaboličke aktivacije.

1.6.2.3. Koncentracije izlaganja

Treba primeniti višestruke koncentracije ispitivane supstance u rasponu koji odgovara za definisanje odgovora. Najviša koncentracija treba da izaziva određene citotoksične efekte. Jedinjenja koji su relativno nerastvorna u vodi treba ispitati do granice rastvorljivosti. U slučaju hemikalija koje su netoksične i dobro rastvorne u vodi, gornja ispitivana koncentracija hemikalije utvrđuje se u zavisnosti od slučaja.

1.6.2.4. Ćelije

Prilikom održavanja kultura potrebno je primeniti odgovarajući podlogu za rast, koncentraciju CO2, temperaturu i vlažnost. Utvrđene ćelijske linije periodično se proveravaju na kontaminaciju mikoplazmom.

1.6.2.5. Metabolička aktivacija

Sistem metaboličke aktivacije ne koristi se sa primarnim kulturama hepatocita. Određene ćelijske linije i limfociti izlažu se ispitivanoj supstanci i u prisustvu i u odsustvu odgovarajućeg sistema metaboličke aktivacije.

1.6.3. Postupak

1.6.3.1. Priprema kultura

Utvrđene ćelijske linije dobijaju se iz "stock", kultura (npr. tripsinizacijom ili otresanjem), zasađuju se u posude za kultivisanje pri odgovarajućoj gustini i inkubiraju na temperaturi od 37°C.

Kratkotrajne kulture hepatocita pacova utvrđuju se omogućavanjem sveže izdvojenim hepatocitima da se u odgovarajućoj podlozi pričvrste za površinu za rast.

Kulture ljudskih limfocita uspostavljaju se korišćenjem odgovarajućih metoda.

1.6.3.2. Tretiranje kultura ispitivanom supstancom

1.6.3.2.1. Primarni hepatociti pacova

Sveže izolovani hepatociti pacova tretiraju se ispitivanom supstancom u podlozi koja sadrži 3H-TdR tokom odgovarajućeg vremenskog perioda. Na kraju perioda tretiranja, podlogu treba odstraniti sa ćelija, koje se nakon toga ispiraju, fiksiraju i suše. Slajdove zatim treba umočiti u autoradiografsku emulziju (može se koristiti alternativni tanki film), izložiti, razviti, obojiti i prebrojati.

1.6.3.2.2. Utvrđene ćelijske linije i limfociti

Autoradiografske tehnike: ćelijske kulture se izlažu ispitivanoj supstanci tokom odgovarajućih vremenskih perioda, nakon čega se tretiraju sa 3H-TdR. Vremenski periodi se određuju u skladu sa prirodom supstance, aktivnosti metaboličkih sistema i vrstom ćelija. Kako bi se otkrio maksimum UDS-a, potrebno je dodati 3H-TdR, istovremeno s ispitivanom supstancom ili tokom nekoliko minuta nakon izlaganja ispitivanoj supstanci. Na izbor jednog od ova dva postupka utiču moguće interakcije ispitivane supstance i 3H-TdR. Kako bi se napravila razlika između UDS i semi-konzervativne replikacije DNK, ova druga se može sprečiti, npr. primenom podloge bez arginina, niskog sadržaja seruma ili hidroksiureom u podlozi za kultivisanje.

LSC merenja UDS-a: pre tretiranja ispitivanom supstancom potrebno je blokirati ulazak ćelija u S-fazu na način kako je gore opisano. Ćelije se zatim izlažu ispitivanoj hemikaliji na način kako je opisano za autoradiografiju. Na kraju perioda inkubacije, DNK se ekstrahuje iz ćelija i određuje se ukupni sadržaj DNK i stepen inkorporacije 3H-TdR.

Treba napomenuti da, u slučajevima kada se koriste ljudski limfociti u gore navedenim tehnikama, kod nestimulisanih kultura nije potrebna supresija semi-konzervativne replikacije DNK.

1.6.3.3. Analize

1.6.3.3.1. Autoradiografska određivanja

Prilikom određivanja UDS-a u ćelijama u kulturi ne prebrojavaju se jedra u S-fazi. Potrebno je prebrojati najmanje 50 ćelija po koncentraciji. Slajdove pre prebrojavanja treba šifrovati. Na svakom slajdu treba prebrojiti nekoliko široko razdvojenih nasumičnih polja. Količina inkorporacije 3H-TdR u citoplazmi određuje se prebrojavanjem tri područja veličine nukleusa u citoplazmi svake prebrojane ćelije.

1.6.3.3.2. LSC određivanja

Za LSC UDS određivanja, za svaku koncentraciju, primenjuje se odgovarajući broj kultura, kao i za kontrolu.

Sve rezultate treba potvrditi u nezavisnom eksperimentu.

2. PODACI

Podaci se navode tabelarno.

2.1. AUTORADIOGRAFSKA ODREĐIVANJA

Stepen inkorporacije 3H-TdR u citoplazmi i broj zrna pronađenih u jedru ćelije odvojeno se navode.

Za opisivanje raspodele stepena inkorporacije 3H-TdR u citoplazmi i broja zrna po nukleusu mogu da se koriste srednje vrednosti, medijana i modus.

2.2. LSC ODREĐIVANJA

Za određivanja koja se odnose na LSC, inkorporaciju 3H-TdR potrebno je izraziti kao dpm/μg DNK. Može se primeniti srednja vrednost dpm/μg DNK sa standardnom devijacijom, a kako bi se opisala raspodela inkorporacije. Podaci se procenjuju odgovarajućim statističkim metodama.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži podatke o:

- upotrebljenim ćelijama, gustini i broju prolaza u vreme tretiranja, broju kultura ćelija;

- metodi primenjenoj u održavanju ćelijskih kultura, uključujući podlogu, temperaturu i koncentraciju CO2;

- ispitivanoj supstanci, vehikulumu, koncentraciji i logičkoj osnovi za izbor koncentracija primenjenih u ispitivanju;

- detaljima o sistemima metaboličke aktivacije;

- rasporedu tretmana;

- pozitivnim i negativnim kontrolama;

- primenjenoj autoradiografskoj tehnici;

- postupcima korišćenim za blokiranje ulaska ćelija u S-fazu;

- postupcima korišćenim za ekstrakciju DNK i utvrđivanje ukupnog sadržaja DNK u LSC određivanju;

- odnosu doza/odgovor, kada je moguće;

- statističkoj proceni;

- obrazloženju rezultata;

- tumačenju rezultata.

3.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Videti Opšti uvod.

4. LITERATURA

Videti Opšti uvod.

B.19. IN VITRO ISPITIVANJE IZMENE SESTRINSKIH HROMATIDA

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Videti Opšti uvod.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIP METODE

Ispitivanje izmene sestrinskih hromatida (u daljem tekstu: SCE) jeste kratkotrajno ispitivanje namenjeno otkrivanju međusobnih izmena DNK dve sestrinske hromatide hromozoma koji se udvostručava. SCE predstavlja izmenu proizvoda replikacije DNK na naizgled homologim mestima. Postupak razmene verovatno obuhvata prekidanje i ponovno sjedinjavanje DNK, iako se malo zna o njegovoj molekulskoj osnovi. Detekcija SCE-a zahteva ulaganje određenog napora u diferencijalno obeležavanje sestrinskih hromatida, što se može postići inkorporacijom bromdeoksiuridina (u daljem tekstu: BrdU) u hromozomsku DNK kroz dva ćelijska ciklusa.

Ćelije sisara in vitro izlažu se ispitivanoj hemikaliji sa i bez sisarskog egzogenog sistema metaboličke aktivacije, ukoliko je svrsishodno i kultivišu se tokom dva kruga replikacije u medijumu koji sadrži BrdU. Posle obrade inhibitorom deobnog vretena (npr. kolhicinom) da bi se akumulirale ćelije u stadijumu mitoze koji je sličan metafazi (c-metafaza) ćelije se skupljaju i pripremaju se hromozomski preparati.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Nisu propisani.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Preparati

U ispitivanju mogu da se koriste primarne kulture (ljudski limfociti) ili određene ćelijske linije (npr. ćelije ovarijuma kineskog hrčka). Ćelijske linije treba proveriti na kontaminaciju mikoplazmom,

Neophodno je da se primeni odgovarajući medijum za kulture i uslovi inkubacije (npr. temperatura, posude za kulture, koncentracija CO2 i vlažnost).

Ispitivane supstance mogu da se pripreme u medijumu kulture ili da se rastvore ili suspenduju u odgovarajućim vehikulumima pre tretiranja ćelija. Konačna koncentracija vehikuluma u sistemu kulture ne sme u znatnoj meri da utiče na vijabilitet ćelija ili stepen rasta. Uticaj na učestalost SCE-a treba pratiti putem kontrole rastvarača.

Ćelije treba da budu izložene ispitivanoj supstanci u prisustvu i u odsustvu sisarskog egzogenog sistema metaboličke aktivacije. Alternativno, u slučajevima kada se koriste tipovi ćelija s intrinzičnom metaboličkom aktivnošću, obim i priroda aktivnosti treba da odgovaraju klasi hemikalije koja se ispituje.

1.6.2. Uslovi ispitivanja

1.6.2.1. Broj kultura

Za svaku tačku ispitivanja treba primeniti najmanje dve kulture.

1.6.2.2. Primena pozitivnih i negativnih kontrola

U svaki eksperiment treba da budu uključene pozitivne kontrole i to primenom jedinjenja direktnog dejstva, kao i jedinjenja koje zahteva metaboličku aktivaciju. Potrebna je i primena kontrole vehikuluma.

Supstance koje se mogu primeniti kao pozitivne kontrole:

- jedinjenje direktnog delovanja;

- etil-metansulfonat;

- jedinjenje indirektnog delovanja;

- ciklofosfamid.

Kada je primereno, u ispitivanje može da se uključi dodatna pozitivna kontrola iste hemijske klase kojoj pripada i hemikalija koja se ispituje.

1.6.2.3. Koncentracije izlaganja

Potrebno je da se primeni bar tri odgovarajuće raspoređene koncentracije ispitivane supstance. Najviša koncentracija treba da izazove značajan toksični efekt, ali pri tome mora da omogući odgovarajuću replikaciju ćelija. Supstance koje su relativno nerastvorljive u vodi treba ispitati do granice rastvorljivisti uz primenu odgovarajućih postupaka. U slučaju supstanci koje su slobodno rastvorljive u vodi i nisu toksične, gornja koncentracija ispitivane supstance utvrđuje se od slučaja do slučaja.

1.6.3. Postupak

1.6.3.1. Priprema kultura

Utvrđene ćelijske linije dobijaju se iz postojećih ("stock") kultura (npr. tripsinizacijom ili otresanjem), zasejavaju se u posude za kulture na odgovarajućoj gustini i inkubiraju na temperaturi od 37°C. Za jednoslojne kulture potrebno je prilagoditi broj ćelija po posudi, tako da kulture u vreme skupljanja ne budu konfluentne mnogo više od 50%. Alternativno, mogu da se primene ćelije u kulturi u obliku suspenzije. Kulture ljudskih limfocita dobijaju se iz heparinizirane krvi odgovarajućim tehnikama i inkubiraju se na temperaturi od 37°C.

1.6.3.2. Tretiranje

Ćelije koje se nalaze u eksponencijalnom stadijumu rasta izlažu se ispitivanoj supstanci u odgovarajućem vremenskom periodu. U većini slučajeva jedan do dva sata može da bude delotvorno, ali je u određenim situacijama moguće produžiti vreme tretiranja do dva cela ćelijska ciklusa. Ćelije bez dovoljne intrinzične (sopstvene) metaboličke aktivnosti treba izlagati ispitivanoj hemikaliji u prisustvu i odsustvu odgovarajućeg sistema metaboličke aktivacije. Po završetku perioda izlaganja sa ćelija se ispiraju ostaci ispitivane supstance pa se iste kultivišu tokom dva kruga replikacije u prisustvu BrdU. Kao alternativa može se primeniti postupak tokom kog se ćelije istovremeno izlažu ispitivanoj hemikaliji i BrdU tokom čitavog vremena kultivisanja od dva ćelijska ciklusa.

Kulture ljudskih limfocita tretiraju se dok se nalaze u polusinhronom stanju.

Analiza ćelija obavlja se tokom njihove druge deobe posle tretmana, kako bi se obezbedilo da najosetljiviji stadijumi ćelijskog ciklusa budu izloženi hemikaliji. Sa svim kulturama kojima se dodaje BrdU rukuje se u mraku ili uz prigušenu svetlost inkandescentnih lampi, sve do skupljanja ćelija, kako bi se fotoliza DNK koji sadrži BrdU svela na najmanju meru.

1.6.3.3. Skupljanje ćelija

Ćelijske kulture tretiraju se inhibitorom deobnog vretena (npr. kolhicinom) jedan do četiri sata pre skupljanja. Ćelije svake kulture ubiraju se i obrađuju odvojeno za preparate hromozoma.

1.6.3.4. Preparati i bojenje hromozoma

Hromozomski preparati pripremaju se primenom standardnih citogenetskih tehnika. Bojenje slajdova, kako bi se prikazali SCE, može da se izvede pomoću nekoliko tehnika (npr. fluorescencija plus Giemsa metoda).

1.6.4. Analiza

Broj analiziranih ćelija treba da se zasniva na spontanoj kontrolnoj učestalosti SCE. Obično se za SCE analizira najmanje 25 dobro rasprostranjenih metafaza po kulturi. Slajdovi se pre analize šifriraju. Kod ljudskih limfocita analiziraju se samo metafaze koje sadrže 46 centromera. Kod utvrđenih ćelijskih linija analiziraju se samo metafaze koje sadrže ± 2 centromere modalnog broja. Navodi se da li se centromerna zamena oznake vrednuje kao SCE. Rezultati treba da se potvrde u nezavisnom ispitivanju.

2. PODACI

Podaci se navode tabelarno. Broj SCE za svaku metafazu i broj SCE po hromozomu za svaku metafazu navode se odvojeno za sve tretirane i kontrolne kulture.

Podaci se procenjuju korišćenjem odgovarajućih statističkih metoda.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži podatke o:

- upotrebljenim ćelijama, metodama održavanja ćelijske kulture;

- uslovima ispitivanja: sastav medijuma, koncentracija CO2, koncentracija ispitivane supstance, korišćeni vehikulum, temperatura inkubacije, vreme tretiranja, korišćeni inhibitor deobnog vretena, njegova koncentracija i trajanje tretmana istim, vrsta korišćenog sisarskog sistema aktivacije, pozitivne i negativne kontrole;

- broju ćelijskih kultura po tački ispitivanja;

- detaljima tehnike korišćene za pripremu slajdova;

- broju analiziranih metafaza (podaci se navode odvojeno za svaku kulturu);

- prosečnom broju SCE po ćeliji i po hromozomu (podaci se navode odvojeno za svaku kulturu);

- kriterijumima za vrednovanje SCE;

- logičkoj osnovi za izbor doze;

- odnosu doza/odgovor, ako je primenljivo;

- statističkoj proceni;

- obrazloženju rezultata;

- tumačenju rezultata.

3.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Videti Opšti uvod.

4. LITERATURA

Videti Opšti uvod.

B.20. ISPITIVANJE RECESIVNE LETALNOSTI VEZANE ZA POL NA DROSOPHILA-e MELANOGASTER

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Videti Opšti uvod.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIP METODE

Ispitivanjem recesivne letalnosti vezane za pol (u daljem tekstu: SLRL) kod Drosophila-e melanogaster otkriva se pojava mutacija, uključujući i tačkaste mutacije i male delecije, u zametnoj lozi insekta. Navedeno ispitivanje je analiza napredne mutacije, koja je sposobna za skrining mutacija na oko 800 lokusa (genskih mesta) na hromozomu X; što čini oko 80% svih lokusa hromozoma X. Hromozom X predstavlja približno jednu petinu čitavog haploidnog genoma.

Mutacije u hromozomu X Drosophila-e melanogaster fenotipski su izražene kod mužjaka koji nose mutirani gen. Kad je mutacija letalna u hemizigotnim uslovima, o njenom postojanju se zaključuje na osnovu izostanka jedne kategorije muških potomaka od dve kategorije koje normalno iznese heterozigotna ženka. SLRL ispitivanje koristi navedene činjenice pomoću posebno označenih i raspoređenih hromozoma.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Nisu propisani.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Pripreme

1.6.1.1. Kulture soja

Mogu se primeniti mužjaci kvalitetno definisane kulture soja divljeg tipa i ženki kulture soja Myller-5. Mogu se upotrebiti i ostale, dobro označene, ženske kulture soja s višestrukim invertiranim hromozomima X.

1.6.1.2. Ispitivana supstanca

Ispitivane supstance treba rastvoriti u vodi. Supstance koje su nerastvorljive u vodi mogu da se rastvore ili suspenduju u odgovarajućem vehikulumu (npr. smeši etanola i Tween-a 60 ili 80), a zatim pre primene da se razblaže u vodi ili rastvoru soli. Dimetilsulfoksid (u daljem tekstu: DMSO) treba izbegavati kao medijum.

1.6.1.3. Broj životinja

Ispitivanje treba da bude osmišljeno tako da ima unapred određenu osetljivost i snagu. Učestalost spontanih mutacija, koja bude primećena u odgovarajućem kontrolnom uzorku, u značajnoj meri utiče na broj tretiranih hromozoma koji moraju da se analiziraju.

1.6.1.4. Put primene

Izlaganje može biti: oralnim putem, putem injekcije ili izlaganje gasovima ili parama. Ispitivana supstanca može se dati i u rastvoru šećera. Kada je neophodno, materija može da se rastvori u 0,7% rastvoru NaCl i da se ubrizga u grudni koš ili abdomen.

1.6.1.5. Primena pozitivnih i negativnih kontrola

Neophodno je uključiti negativne (vehikulum) i pozitivne kontrole. Ukoliko postoje odgovarajući laboratorijski podaci iz prethodnih ispitivanja, nisu potrebne istovremene kontrole.

1.6.1.6. Nivoi izlaganja

Primenjuju se tri nivoa izlaganja. Za preliminarnu procenu može da se primeni jedan nivo izlaganja ispitivanoj supstanci, s tim da navedeni nivo izlaganja treba da bude ili maksimalna tolerisana koncentracija ili ona koncentracija pri kojoj nastaju neki znaci toksičnosti. Za netoksične materije potrebno je izlaganje maksimalno mogućoj koncentraciji.

1.6.2. Postupak

Mužjaci divljeg tipa (stari tri do pet dana) tretiraju se ispitivanom supstancom i pojedinačno pare s velikim brojem nevinih ženki kulture soja Myller-5 ili druge kulture soja, označenim (višestrukim invertiranim hromozomima X) na odgovarajući način. Ženke se zamenjuju novim nevinim ženkama svaka dva do tri dana kako bi se obuhvatio čitav ciklus polne ćelije. Potomci navedenih ženki proveravaju se na postojanje letalnih efekta koji odgovaraju efektima na zrelom spermatozoidu, spermatidima u srednjoj ili kasnoj fazi, spermatidima u ranoj fazi, spermatocitima i spermatogonijima u vreme tretiranja ispitivanom supstancom.

Heterozigotnim F1 ženkama, dobijenima navedenim ukrštanjem, dopušteno je da se pojedinačno pare (tj. jedna ženka po bočici) sa svojom braćom. U F2 generaciji svaka se kultura proverava na odsustvo mužjaka divljeg tipa. Ukoliko se dogodi da kultura potiče od F1 ženke koja je nosilac smrtnosti u roditeljskom hromozomu X (tj. nije primećen nijedan mužjak s tretiranim hromozomom), kćeri ženke s istim genotipom treba obavezno ispitati kako bi se utvrdilo da li se smrtnost ponavlja u narednoj generaciji.

2. PODACI

Podaci se navode u tablearnom obliku kako bi se prikazao broj ispitanih hromozoma X, broj neplodnih mužjaka i broj letalnih hromozoma pri svakoj koncentraciji izlaganja i za svaki period parenja za svakog tretiranog mužjaka. Neophodno je navesti i brojeve grupa (klastera) različitih veličina po svakom mužjaku. Potrebno je da se dobijeni rezultati potvrde u posebnom ispitivanju.

Prilikom procene ispitivanja recesivne letalnosti vezane za pol primenjuju se odgovarajuće statističke metode. Grupisanje recesivnih smrtnih ishoda koji potiču od jednoga mužjaka razmatra se i procenjuje odgovarajućom statističkom metodom.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži podatke o:

- kulturi soja: korišćene kulture soja ili sojevi Drosophila-e, starost insekata, broj tretiranih mužjaka, broj sterilnih mužjaka, broj utvrđenih F2 kultura, broj F2 kultura bez potomstva, broj hromozoma nosilaca letala koji su primećeni pri svakome stadijumu polne ćelije;

- kriterijumima za utvrđivanje veličine tretiranih grupa;

- uslovima ispitivanja, detaljan opis plana tretiranja i uzorkovanja, nivoe izlaganja, podatke o toksičnosti, negativne (rastvarač) i pozitivne kontrole, zavisno od konkretnog slučaja;

- kriterijumima za beleženje letalnih mutacija;

- odnosu izloženost/efekat, gde je moguće;

- proceni podataka;

- obrazloženju rezultata;

- tumačenju rezultata.

3.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Videti Opšti uvod.

4. LITERATURA

Videti Opšti uvod.

B.21. IN VITRO ISPITIVANJA TRANSFORMACIJE ĆELIJA SISARA

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Videti Opšti uvod.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIP METODE

Kulture ćelija sisara mogu da se koriste za otkrivanje fenotipskih promena in vitro izazvanih hemijskim supstancama koje su povezane s malignom transformacijom in vivo. Među ćelije koje se najviše primenjuju spadaju: C3H10T1/2, 3T3, SHE i ćelije pacova Fischer soja, dok se ispitivanja oslanjaju na promene u morfologiji ćelije, formiranju fokusa ili promene u zavisnosti od pričvršćivanja u polučvrstom agaru. Postoje i kulture ćelija koje se ređe koriste, a koje otkrivaju druge fiziološke ili morfološke promene u ćelijama posle izlaganja karcinogenim hemikalijama. Nijedna od in vitro krajnjih tačaka ispitivanja nema utvrđenu mehanističku vezu s rakom. Neke od kultura ćelija mogu da detektuju promotore tumora. Citotoksičnost može da se utvrdi merenjem efekta ispitivanog materijala na sposobnosti formiranja kolonija (efikasnost kloniranja) ili stepene rasta kultura. Merenje citotoksičnosti služi da se utvrdi da je izlaganje ispitivanoj hemikaliji bilo toksikološki relevantno, ali ne može da se upotrebi za izračunavanje transformacije: učestalosti kod svih analiza s obzirom da neke od njih mogu da uključuju produženu inkubaciju i/ili subkultivisanje.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Nisu propisani.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Pripreme

1.6.1.1. Ćelije

U zavisnosti od vrste ispitivanja transformacije koja se koristi, dostupne su različite ćelijske linije ili primarne ćelije. Ispitivač je dužan da se pobrine da se kod ćelija koje se koriste u ispitivanju posle izlaganja poznatim karcinogenima pokaže odgovarajuća promena u fenotipu, kao i da se pobrine za to da je ispitivanje, u laboratoriji ispitivača, dokazanog i dokumentovanog kvaliteta i pouzdanosti.

1.6.1.2. Medijum

Neophodno je da se koristi medijum i eksperimentalni uslovi koji odgovaraju obliku ispitivanja transformacije koji se koristi.

1.6.1.3. Ispitivana supstanca

Ispitivane supstance mogu da se pripreme u medijumu kulture ili da se rastvore ili suspenduju u odgovarajućim vehikulumima pre tretiranja ćelija. Konačna koncentracija vehikuluma u sistemu kulture ne sme da utiče na vijabilitet ćelija, stepen rasta ili učestalost transformacija.

1.6.1.4. Metabolička aktivacija

Ćelije treba da budu izložene ispitivanoj supstanci u prisustvu i u odsustvu odgovarajućeg sistema metaboličke aktivacije. Alternativno, kada se koriste tipovi ćelija sa intrinzičnom (sopstvenom) metaboličkom aktivnošću, priroda aktivnosti treba da odgovara kategoriji (klasi) hemikalije koja se ispituje.

1.6.2. Uslovi ispitivanja

1.6.2.1. Primena pozitivnih i negativnih kontrola

U svako ispitivanje treba da budu uključene pozitivne kontrole i to primenom jedinjenja direktnog delovanja, kao i jedinjenja koje zahteva metaboličku aktivaciju. Neophodno je primeniti i negativne kontrole (vehikuluma).

Supstance koje se mogu primeniti kao pozitivne kontrole su:

a) Hemikalije direktnog delovanja:

- etil metansulfonat;

- β propiolakton.

b) Jedinjenja koji zahtevaju metaboličku aktivaciju:

- 2- acetil aminofluoren;

- 4-dimetilaminoazobenze;

- 7,12-dimetilbenz[a]antracen.

Kad je primereno, u ispitivanje se uključuje dodatna pozitivna kontrola iste hemijske kategorije kojoj pripada i jedinjenje koji se ispituje.

1.6.2.2. Koncentracije izlaganja

Neophodno je da se primeni nekoliko koncentracija ispitivane supstance. Navedene koncentracije treba da izazovu toksične efekte zavisne od koncentracije, pri čemu najviša koncentracija uzrokuje nizak stepen preživljenja, dok je preživljenje kod najniže koncentracije slično onome kod negativne kontrole. Supstance koje su relativno nerastvorljive u vodi treba ispitati do granice rastvorljivosti, uz primenu odgovarajućih postupaka. U slučaju supstanci koje su netoksične i dobro rastvorljive u vodi, gornja koncentracija ispitivane supstance utvrđuje se posebno za svaki pojedinačni slučaj.

1.6.3. Postupak

Ćelije se izlažu ispitivanoj supstanci tokom odgovarajućeg vremenskog perioda, u zavisnosti od sistema koji se koristi u ispitivanju. U slučaju produženog izlaganja, može se uključiti ponovljeno doziranje praćeno promenom medijuma (i ukoliko je potrebno, svežom smešom za metaboličku aktivaciju). Ćelije bez dovoljne intrinzične (sopstvene) metaboličke aktivnosti treba izlagati ispitivanoj supstanci u prisustvu i odsustvu odgovarajućeg sistema metaboličke aktivacije. Po završetku perioda izlaganja sa ćelija se ispiraju ostaci ispitivane supstance i iste ćelije se kultivišu pod uslovima koji su primereni za pojavu transformisanog fenotipa koji se posmatra, a posle čega se utvrđuje incidenca transformacije. Svi rezultati potvrđuju se u okviru nezavisnog ispitivanja.

2. PODACI

Podaci se navode tabelarno i mogu biti različito formulisani zavisno od oblika ispitivanja koji se koristi, na primer: broj podloga, pozitivne podloge ili broj transformisanih ćelija. Kad odgovara, stepen preživljavanja se izražava u obliku procenta od kontrolnih nivoa. Učestalost transformacija izražava se kao broj transformanata prema broju preživelih. Podaci se procenjuju primenom odgovarajućih statističkih metoda.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži podatke o:

- korišćenom tipu ćelija, broju ćelijskih kultura, metodama održavanja ćelijskih kultura;

- uslovima ispitivanja: koncentracija ispitivane supstance, korišćeni medijum, vreme inkubacije, trajanje i učestalost tretiranja, gustina ćelija tokom tretmana, vrsta korišćenog egzogenog sistema metaboličke aktivacije, pozitivne i negativne kontrole, detaljan opis fenotipa koji se posmatra, korišćeni selektivni sistem (zavisno od slučaja), logička osnova za izbor doze;

- metodi korišćenoj za prebrojavanje vijabilnih i transformisanih ćelija;

- statističkoj proceni;

- obrazloženju rezultata;

- tumačenju rezultata.

3.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Videti Opšti uvod.

4. LITERATURA

Videti Opšti uvod.

B.22. ISPITIVANJE DOMINANTNE LETALNOSTI NA GLODARIMA

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Videti Opšti uvod.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIP METODE

Efekti dominantne letalnosti za posledicu imaju embrionalnu ili fetalnu smrt. Indukcija dominantnih letala izlaganjem hemijskoj supstanci ukazuje na činjenicu da je supstanca delovala na germinativno tkivo ispitivane životinjske vrste. Opšteprihvaćeno mišljenje je da su dominantni letali posledica hromozomskih oštećenja (strukturnih i numeričkih anomalija). U slučaju tretiranja ženki ispitivanom supstancom, embrionalna smrt može da bude i posledica toksičnih dejstava.

Obično se mužjaci izlažu delovanju ispitivanog jedinjenja i potom se pare s netretiranim nevinim ženkama. Primenom sekvencijalnih intervala parenja moguće je odvojeno ispitati različite stadijume polnih ćelija. Povećanje broja mrtvih implanta po svakoj ženki u tretiranoj grupi u odnosu na broj mrtvih implanta po svakoj ženki u kontrolnoj grupi odražava postimplantacioni gubitak. Predimplantacioni gubitak može da se proceni na osnovu broja žutih tela ili poređenjem ukupnoga broja implanta po svakoj ženki u kontrolnoj i tretiranoj grupi. Ukupan efekt dominantne letalnosti predstavlja zbir pred- i post- implantacionog gubitka. Procena ukupnoga efekta dominantne letalnosti zasniva se na poređenju živih implanta po svakoj ženki u ispitivanoj grupi i živih implanta po svakoj ženki u kontrolnoj grupi. Smanjenje broja implanta u određenim vremenskim razmacima može biti posledica ubijanja ćelija (tj. spermatocita i/ili spermatogonija).

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Nisu propisani.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Pripreme

Kada je moguće, ispitivane supstance se rastvaraju ili suspenduju u izotoničnom rastvoru. Hemikalije nerastvorljive u vodi mogu da se rastvore ili suspenduju u odgovarajućim medijumima. Medijum koji se koristi ne sme da interferira sa ispitivanom hemikalijom, niti za posledicu da ima toksične efekte. Neophodna je upotreba svežih rastvora/suspenzija ispitivane hemikalije.

1.6.2. Uslovi ispitivanja

1.6.2.1. Put primene

Ispitivano jedinjenje uglavnom se primenjuje samo jednom. Na osnovu toksikoloških podataka može se primeniti plan ponovljenog tretiranja. Uobičajeni putevi primene su oralna intubacija ili intraperitonealna injekcija. Mogu da odgovaraju i drugi putevi primene.

1.6.2.2. Eksperimentalne životinje

Kao odgovarajuće vrste za ispitivanje preporučuju se pacovi i miševi. Zdrave i potpuno polno zrele životinje randomiziraju se i dodeljuju grupama koje se tretiraju i kontrolnim grupama.

1.6.2.3. Broj i pol

Koristi se odgovarajući broj tretiranih mužjaka, uzimajući u obzir spontano variranje bioloških svojstava koja se vrednuju. Izabrani broj treba da se zasniva na unapred određenoj osetljivosti detekcije i stepena značaja. Na primer, u tipičnom ispitivanju, broj mužjaka u svakoj grupi koja prima određenu dozu treba da bude dovoljan da se obezbedi između 30 i 50 gravidnih ženki po svakom intervalu parenja.

1.6.2.4. Primena pozitivnih i negativnih kontrola

U svaki eksperiment treba uključiti istovremene pozitivne i negativne (medijum) kontrole. Kad postoje prihvatljivi rezultati pozitivne kontrole iz eksperimenata koji su nedavno obavljeni u istoj laboratoriji, oni se mogu koristiti umesto istovremene pozitivne kontrole. Supstance pozitivne kontrole treba da se koriste u prikladnoj niskoj dozi (npr. MMS, intraperitonealno pri 10 mg/kg), a kako bi se pokazala osetljivost ispitivanja.

1.6.2.5. Dozni nivoi

Obično se koriste tri nivoa doza. Visoka doza treba da prouzrokuje znakove toksičnosti ili smanjene plodnosti tretiranih životinja. U određenim slučajevima jedna visoka doza može da bude dovoljna.

1.6.2.6. Ispitivanje granične doze

Netoksične supstance traba ispitati pri dozi od 5 g/kg u obliku jedne doze, ili pri dozi od 1 g/kg/dnevno prilikom ponovljenog doziranja.

1.6.3. Postupak

Postoji nekoliko planova za izvođenje postupka. Najviše se primenjuje doziranje ispitivane supstance u obliku jednokratne primene. Mogu se primeniti i drugi planovi tretiranja.

Pojedini mužjaci se sekvencijalno pare s jednom ili dve netretirane nevine ženke u odgovarajućim vremenskim intervalima posle tretiranja ispitivanom supstancom. Ženke je potrebno ostaviti zajedno s mužjacima tokom najmanje jednog estrusnog ciklusa ili dok ne dođe do parenja koje se utvrđuje prema prisutnosti sperme u vagini ili prema postojanju vaginalnog "čepa".

Broj parenja posle tretiranja rukovodi se planom tretiranja i treba da obezbedi uzorkovanje svih stadijuma polnih ćelije posle tretiranja.

Ženke se žrtvuju u drugoj polovini graviditeta i pregleda se sadržaj materice kako bi se utvrdio broj živih i mrtvih implanta. Mogu se pregledati i jajnici kako bi se utvrdio broj žutih tela.

2. PODACI

Podaci se navode tabelarno kako bi se prikazao broj mužjaka, broj gravidnih ženki i broj negravidnih ženki. Rezultati svakoga parenja, uključujući identitet svakog mužjaka i ženke, navode se pojedinačno. Potrebno je zabeležiti nedelju parenja za svaku ženku, veličinu doze koju su primili mužjaci, kao i učestalosti pojave živih i mrtvih implanta.

Izračunavanje ukupnog efekta dominantne letalnosti zasniva se na poređenju živih implanta po svakoj ženki u ispitivanoj grupi sa živim implantima po svakoj ženki u kontrolnoj grupi. Odnos mrtvih i živih implanta iz tretirane grupe u poređenju sa odnosom u kontrolnoj grupi analizira se kako bi se pokazao postimplantacioni gubitak.

Ukoliko se podaci navode u obliku ranih i kasnih smrti, u tabelama to treba jasno da se naznači. Navodi se i predimplantacioni gubitak, ukoliko je procenjen. Predimplantacioni gubitak može se izračunati kao razlika između broja žutih tela i broja implanta ili kao smanjenje prosečnog broja implanta po materici, a u poređenju sa kontrolnim parenjima.

Podaci se procenjuju primenom odgovarajućih statističkih metoda.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži podatke o:

- životinjskoj vrsti, soju, starosti i telesnoj masi korišćenih životinja, broju životinja svakoga pola u eksperimentalnim i kontrolnim grupama;

- ispitivanoj supstanci, medijumu, ispitanim nivoima doza i logičkoj osnovi za izbor doza, negativnoj i pozitivnoj kontroli, toksičnosti;

- putu i planu primene;

- rasporedu parenja;

- metodama koje su korišćene da bi se utvrdilo da je došlo do parenja;

- vremenu žrtvovanja;

- kriterijumima beleženja dominantnih letala;

- odnosu doza/efekat, ako je primenljivo;

- statističkoj proceni;

- obrazloženju rezultata;

- tumačenju rezultata.

3.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Videti Opšti uvod.

4. LITERATURA

Videti Opšti uvod.

B.23. ISPITIVANJE HROMOZOMSKIH ABERACIJA NA SPERMATOGONIJIMA SISARA

1. METODA ISPITIVANJA

Metoda potpuno odgovara metodi OECD: TG 483, Mammalian Spermatogonial Chromosome Aberration Test (1997).

1.1. UVOD

Svrha ispitivanja hromozomskih aberacija u spermatogonijima sisara in vivo jeste identifikacija supstanci koje uzrokuju strukturalne hromozomske aberacije u ćelijama spermatogonija sisara1, 2, 3, 4, 5. Strukturalne aberacije mogu biti dvojake: hromozomskog ili hromatidnog tipa. Većina hemijskih mutagena uzrokuje aberacije hromatidnog tipa, ali ponekad se pojavljuju i aberacije hromozomskog tipa. Ova metoda nije namenjena merenju numeričkih aberacija i obično se ne upotrebljava u tu svrhu. Hromozomske mutacije i sa njima povezane pojave uzrok su mnoštva genetskih oboljenja kod ljudi.

Ovo ispitivanje meri hromozomske pojave u zametnim ćelijama spermatogonija i od njega se očekuje da bude uspešno u predviđanju indukovanja naslednih mutacija u polnim ćelijama.

U ovom ispitivanju obično se upotrebljavaju glodari. Navedeno citogenetsko ispitivanje in vivo otkriva hromozomske aberacije prilikom mitoze spermatogonija. Ostale ciljne ćelije nisu predmet ove metode.

Da bi se otkrile aberacije hromatidnog tipa u ćelijama spermatogonija potrebno je ispitati prvu mitotsku deobu ćelija posle tretmana, a pre nego što navedene lezije nestanu u narednim ćelijskim deobama. Dodatni podaci o tretiranim matičnim ćelijama spermatogonija mogu se dobiti analizom aberacija hromozomskoga tipa kod mejotskih hromozoma prilikom dijakineze-metafaze 1 kada tretirane ćelije postaju spermatociti.

Svrha ovoga ispitivanja in vivo jeste ispitati da li su mutageni somatskih ćelija aktivni i u polnim ćelijama. Uz to, ovo ispitivanje na spermatogonijima odgovara i za ocenjivanje mutagenosti, zbog toga što omogućava uzimanje u obzir faktor metabolizma in vivo, farmakokinetike i procesa popravka DNK.

U testisu se nalaze brojne generacije spermatogonija koje imaju različite nivoe osetljivosti na hemijski tretman. Otkrivene aberacije predstavljaju zbirnu reakciju tretiranih ćelijskih populacija spermatogonija, pri čemu preovlađuju diferencirane ćelije spermatogonija koje su brojnije. Zbog fizičke i fiziološke barijere Sertolijevih ćelija i barijere između krvi i testisa, različite generacije spermatogonija mogu ili ne moraju biti izložene krvotoku, zavisno od njihovog položaja u testisima.

Ovaj oblik ispitivanja ne odgovara ukoliko se pojave dokazi da ispitivana supstanca ili reaktivni metabolit neće dospeti do ciljnog tkiva.

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Aberacija hromatidnog tipa jeste strukturalno oštećenje hromozoma koje se izražava kao cepanje pojedinih hromatida ili cepanje i ponovno sjedinjavanje između hromatida.

Aberacija hromozomskog tipa jeste strukturno oštećenje hromozoma koje se izražava kao cepanje ili cepanje i ponovno sjedinjavanje obe hromatide na identičnom mestu.

Hromozomski prekid jeste ahromatska lezija manja od širine jedne hromatide s minimumom neporavnatošću hromatida.

Numerička aberacija jeste promena u broju hromozoma koja odstupa od redovnog broja karakterističnog za životinje koje se koriste.

Poliploidnost jeste umnožak haploidnog broja hromozoma (n) različit od diploidnog broja (tj. 3n, 4n, itd.).

Strukturna aberacija jeste promena u strukturi hromozoma koja se može otkriti mikroskopskim pregledom metafaznog stadijuma deobe ćelija, a koja se zapaža u obliku delecija, transpozicija ili recipročnih translokacija.

1.3. PRINCIP METODE

Životinje se odgovarajućim putem ekspozicije izlažu ispitivanoj supstanci i žrtvuju u odgovarajuće vreme posle tretiranja. Pre žrtvovanja, životinje se tretiraju supstancom za zaustavljanje metafaze (npr. kolhicinom ili Colcemid-om®). Posle toga, pripreme se i oboje hromozomski preparati od polnih ćelija i analiziraju ćelije u metafazi s ciljem utvrđivanja hromozomskih aberacija.

1.4. OPIS METODE

1.4.1. Pripreme

1.4.1.1. Izbor životinjske vrste

Obično se koriste kineski hrčci i miševi muškoga pola. Mogu se primeniti i mužjaci druge odgovarajuće vrste sisara. Koriste se laboratorijski sojevi mladih zdravih odraslih životinja koji se obično koriste. Na početku istraživanja odstupanje u telesnoj masi životinja treba da bude minimalno i da ne premašuje ± 20% prosečne telesne mase.

1.4.1.2. Uslovi smeštaja i ishrane

Primenjuju se opšti uslovi koji su navedeni u Opštem uvodu, iako vlažnost treba održavati na nivou od 50% do 60%.

1.4.1.3. Priprema životinja

Zdravi odrasli mužjaci se, po metodi slučajnog izbora, svrstavaju u kontrolne i eksperimentalne grupe. Kavezi treba da budu raspoređeni na način kojim će efekti koji su posledica položaja kaveza biti svedeni na najmanju moguću meru. Životinje se označavaju na jedinstven način. Životinje se aklimatizuju na laboratorijske uslove najmanje pet dana pre početka ispitivanja.

1.4.1.4. Priprema doza

Čvrste ispitivane supstance rastvaraju se ili suspenduju u odgovarajućim rastvaračima ili vehikulumima i, ukoliko je potrebno, razređuju pre doziranja životinja. Tečne ispitivane supstance mogu direktno da se doziraju ili razrede pre doziranja. Treba koristiti sveže pripremljene preparate ispitivane supstance, osim ako podaci o stabilnosti ukazuju da je čuvanje prihvatljivo.

1.4.2. Uslovi ispitivanja

1.4.2.1. Rastvarač/vehikulum

Rastvarač/vehikulum ne sme da ima toksične efekte pri nivou doza koje se primenjuju i ne sme da postoji sumnja da će hemijski da reaguje sa ispitivanom supstancom. Ukoliko se primenjuju manje poznati rastvarači/vehikulumi, njihovo uključivanje u ispitivanje treba opravdati podacima o njihovoj kompatibilnosti. Kad god je moguće, preporučuje se da se prvo razmotri primena vodenog rastvarača/vehikuluma.

1.4.2.2. Kontrole

Istovremene pozitivne i negativne (rastvarač/vehikulum) kontrole treba uključiti u svako ispitivanje. Osim tretiranja ispitivanom supstancom, sa životinjama u kontrolnim grupama treba postupati na isti način kao sa životinjama u tretiranim grupama.

Pozitivne kontrole treba da izazovu strukturne hromozomske aberacije u ćelijama spermatogonija in vivo pri istim nivoima izloženosti za koje se očekuje da će izazvati primetno povećanje u odnosu na podlogu.

Pozitivne kontrolne doze treba odabrati tako da efekti budu jasni, ali da licu koje čita eksperiment odmah ne otkriju identitet šifriranih mikroskopskih preparata (slajdova). Prihvatljivo je da se pozitivne kontrole primene putem koji je različit od onoga kod ispitivane supstance i da se uzorak uzme samo jednom. Kada je moguće uzima se u obzir primena hemikalija pozitivne kontrole koje pripadaju istoj hemijskoj kategoriji kao i ispitivana hemikalija. Primeri supstanci pozitivne kontrole:

Tabela 1.

Negativne kontrole, tretirane samo rastvaračem ili vehikulumom, inače tretirane na isti način kao grupe obuhvaćene tretmanom, treba da budu uključene u svako vreme uzorkovanja, osim ukoliko se, iz prošlih kontrolnih podataka, mogu ekstrapolirati prihvatljive među-životinjske varijabilnosti i frekventnost ćelija s hromozomskim aberacijama. Istovremeno treba koristiti i netretirane kontrole, osim ukoliko postoje kontrolni podaci iz prošlih ispitivanja ili objavljeni kontrolni podaci koji dokazuju da odabran rastvarač/vehikulum ne izaziva štetne ili mutagene efekte.

1.5. POSTUPAK

1.5.1. Broj životinja

Svaka tretirana i kontrolna grupa mora da obuhvata najmanje pet mužjaka na kojima se može obaviti analiza.

1.5.2. Plan tretmana

Ispitivane supstance je najbolje davati jednom ili dvaput (tj. u okviru jednog ili dva tretmana). Ispitivane supstance mogu da se daju u obliku podeljene doze, tj. u obliku dva tretmana tokom istoga dana u razmaku od najviše nekoliko sati, a kako bi se olakšalo davanje velike količine materijala. Ostali režimi doziranja treba da budu naučno opravdani.

U najvišoj doznoj grupi uzorkovanje se vrši dva puta posle tretiranja. S obzirom da ispitivana supstance može da utiče na dinamiku ćelijskoga ciklusa, jedno uzorkovanje se obavlja ranije, oko 24 sata posle tretmana, a drugo kasnije, oko 48 sati posle tretmana. Kod ostalih doza, različitih od najviše doze, uzorke je potrebno uzeti 24 sata ili 1,5 dužinu ćelijskog ciklusa posle tretmana, osim ukoliko je poznato da bi drugo vreme uzorkovanja bilo prikladnije za otkrivanje efekata6.

Dodatni uzorci mogu da se uzimaju i u drugo vreme. Npr. u slučaju hemikalija koje mogu da dovedu do zaostajanje hromozoma ili efekte nezavisne od S-faze, primerenije je da se uzorkovanje obavi ranije1.

Primerenost plana ponovljenog tretiranja utvrđuje se od slučaja do slučaja. Posle programa ponovljenog tretiranja, životinje treba žrtvovati 24 sata (1,5 dužina ćelijskog ciklusa) posle poslednjeg unosa ispitivane supstance. Kad je potrebno, mogu se uzeti i dodatni uzorci u drugo vreme.

Pre žrtvovanja životinjama se intraperitonealno injektuje odgovarajuća doza supstance za zaustavljanje metafaze (npr. Colcemid-a® ili kolhicina). Zatim se uzimaju životinjski uzorci u odgovarajućim intervalima. Za miševe ovaj interval iznosi oko 3 do 5 sati; za kineske hrčke interval iznosi oko 4 do 5 sati.

1.5.3. Dozni nivoi

Ukoliko se istraživanje obavlja sa ciljem utvrđivanja raspona zbog toga što ne postoje odgovarajući podaci, navedeno istraživanje treba da se obavi u istoj laboratoriji, uz korišćenje iste vrste, soja, pola i režima tretiranja koji će biti primenjeni u glavnom istraživanju7. Ukoliko postoji toksičnost, prilikom prvog intervala uzorkovanja koriste se tri nivoa doziranja. Ovi nivoi doziranja treba da obuhvate raspon od maksimalne do minimalne toksičnosti ili bez toksičnosti. Prilikom kasnijeg intervala uzorkovanja potrebno je upotrebiti samo najvišu dozu. Najviša doza se definiše kao doza usled koje nastaju simptomi toksičnosti takve prirode da se očekuje da bi veći nivoi doziranja, zasnovani na istom režimu doziranja, izazvali smrt.

Supstance specifičnog biološkog delovanja u malim netoksičnim dozama (kao što su hormoni i mitogena) izuzetak su od kriterijuma za postavljanje doza, pa ih treba vrednovati od slučaju do slučaja. Najviša doza se može definisati i kao doza koja dovodi do nekih indikacija toksičnosti u ćelijama spermatogonija (npr. smanjenje odnosa između mitoza spermatogonija u prvoj i drugoj mejotskoj metafazi; navedeno smanjenje ne sme da bude veće od 50%).

1.5.4. Ispitivanje granične doze

Ukoliko prilikom ispitivanja jednom dozom, na nivou od najmanje 2.000 mg/kg TM/dnevno u okviru jednog tretmana ili dva tretmana tokom istoga dana, ne nastanu nikakvi primetni toksični efekti i ukoliko se genotoksičnost ne očekuje na osnovu podataka o strukturno sličnim supstancama, nije neophodno celokupno ispitivanje koje primenjuje tri nivoa doziranja. Očekivana izloženost ljudi može ukazati na potrebu za primenom veće doze tokom ispitivanja granične doze.

1.5.5. Primena doza

Ispitivana supstanca obično se primenjuje intubacijom (prisilno hranjenje), i to korišćenjem želudačne cevi ili odgovarajuće intubacijske kanile ili intraperitonealnom injekcijom. Ostali putevi izlaganja mogu da budu prihvatljivi u slučajevima u kojima se mogu opravdati. Maksimalna zapremina tečnosti koja može da se da odjednom putem cevi ili injekcijom zavisi od veličine eksperimentalne životinje. Zapremina ne sme da pređe 2 ml/100 g TM. Upotrebu većih zapremina potrebno je opravdati. Izuzev u slučaju iritabilnih i korozivnih supstanci koje normalno pokazuju pogoršane efekte pri višim koncentracijama, varijabilnost ekperimentalne zapremine treba svesti na najmanju moguću meru prilagođavanjem koncentracije, a kako bi se osigurala konstantna zapremina pri svim nivoima doza.

1.5.6. Hromozomski preparat

Odmah posle žrtvovanja, iz jednog ili oba testisa uzimaju se ćelijske suspenzije koje se izlažu hipotoničnom rastvoru i fiksiraju. Ćelije se zatim nanesu na mikroskopska stakla i oboje.

1.5.7. Analiza

Za svaku životinju treba analizirati najmanje 100 dobro vidljivih metafaza (tj. najmanje 500 metafaza po grupi). Navedeni broj se može smanjiti kada se uočava veliki broj aberacija. Sve preparate (slajdove), uključujući one pozitivne i negativne kontrole, potrebno je nezavisno šifrirati pre mikroskopske analize. S obzirom da postupci fiksiranja često za posledicu imaju oštećenje proporcija metafaza uz gubitak hromozoma, vrednovane ćelije zbog toga treba da sadrže broj centromera jednak broju 2n ± 2.

2. PODACI

2.1. OBRADA REZULTATA

Podaci koji se odnose na pojedine životinje prikazuju se tabelarno. Životinja predstavlja eksperimentalnu jedinicu. Za svaku pojedinu životinju potrebno je utvrditi broj ćelija sa strukturnim hromozomskim aberacijama i broj hromozomskih aberacija po ćeliji. Navode se različite vrste strukturnih hromozomskih aberacija zajedno sa njihovim brojevima i frekvencama, a u odnosu na tretirane i kontrolne grupe. Hromozomski prekidi navode se odvojeno i o njima se izveštava, ali se uglavnom ne uključuju u ukupnu frekvencu aberacija.

Ukoliko se posmatraju i mitoza i mejoza, potrebno je utvrditi odnos između mitoza spermatogonija u prvoj i drugoj mejotskoj metafazi kao merilo citotoksičnosti za sve tretirane životinje i životinje negativne kontrole na čitavom uzorku od 100 ćelija u deobi po životinji, da bi se utvrdili mogući citotoksični efekti. Ukoliko se posmatra samo mitoza, potrebno je utvrditi mitotski indeks u najmanje 1.000 ćelija za svaku životinju.

2.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Postoji nekoliko kriterijuma za utvrđivanje pozitivnog rezultata, kao što je dozno zavisno povećanje relativnog broja ćelija s hromozomskim aberacijama ili jasno povećanje broja ćelija sa aberacijama u grupi koja je primala po jednu dozu prilikom pojedinog intervala uzorkovanja. Prvenstveno se uzima u obzir biološka relevantnost rezultata. Prilikom procene rezultata ispitivanja mogu da se primene statističke metode kao pomoćno sredstvo8. Statistički značaj ne treba da bude jedini faktor pomoću kojeg se utvrđuje pozitivan odgovor. Dvosmislene rezultate treba pojasniti daljim ispitivanjem, najbolje kroz modifikaciju eksperimentalnih uslova.

Ispitivana supstanca za koju rezultati ne zadovoljavaju navedene kriterijume, smatra se nemutagenom u ovom ispitivanju.

Iako većina eksperimenata daje jasno pozitivne ili negativne rezultate, u retkim slučajevima utvrđeni podaci onemogućavaju donošenje konačne odluke o delovanju ispitivane supstance. Rezultati mogu ostati dvosmisleni ili nejasni, bez obzira koliko je puta eksperiment ponovljen.

Pozitivni rezultati ispitivanja hromozomskih aberacija u spermatogonijima in vivo ukazuju na to da ispitivana supstanca uzrokuje strukturne hromozomske aberacije u polnim ćelijama ispitane vrste. Negativni rezultati ukazuju na to da, pod eksperimentalnim uslovima, ispitivana supstanca ne izaziva hromozomske aberacije u polnim ćelijama ispitane vrste.

Potrebno je razmotriti verovatnoću da će ispitivana supstanca ili njeni metaboliti dopreti do ciljnog tkiva.

3. IZVEŠTAJ

Izveštaj o ispitivanju mora da sadrži podatke o:

1) Rastvaraču/vehikulumu:

- opravdanost izbora vehikuluma;

- rastvorljivost i stabilnost ispitivane supstance u rastvaraču/vehikulumu, ukoliko je poznato.

2) Eksperimentalnim životinjama:

- upotrebljena vrsta/soj;

- broj i starost životinja;

- poreklo, smeštajni uslovi, ishrana, itd.;

- pojedinačna težina životinja na početku ispitivanja, uključujući raspon telesne mase i srednju vrednost i standardnu devijaciju za svaku grupu.

3) Uslovima ispitivanja:

- podaci istraživanja za utvrđivanje raspona, ukoliko je obavljeno;

- logička osnova za izbor nivoa doziranja;

- logička osnova za izbor načina primene ispitivane supstance;

- detalji pripreme ispitivane supstance;

- detalji primene ispitivane supstance;

- logička osnova vremena žrtvovanja;

- način preračunavanja koncentracije ispitivane supstance u hrani/vodi za piće (ppm) u stvarnu dozu (mg/kg TM/dan), ukoliko je primenljivo na konkretan slučaj;

- detalji o kvalitetu hrane i vode;

- detaljan opis rasporeda tretmana i uzorkovanja;

- metode merenja toksičnosti;

- identitet supstance koja zaustavlja metafazu, njena koncentracija i trajanje tretmana;

- metode pripreme mikroskopskih preparata;

- kriterijumi za prebrojavanje aberacija;

- broj analiziranih ćelija po životinji;

- kriterijumi za proglašavanje ispitivanja pozitivnim, negativnim ili dvosmislenim.

4) Rezultatima:

- simptomi toksičnosti;

- mitotski indeks;

- odnos između mitoza spermatogonija u prvoj i drugoj mejotskoj metafazi;

- vrsta i broj aberacija, zasebno prikazanih za svaku životinju;

- ukupan broj aberacija po grupi;

- broj ćelija sa aberacijama po grupi;

- odnos doza/efekat, gde je moguće;

- statističke analize, ukoliko postoje;

- podaci istovremene negativne kontrole;

- negativni kontrolni podaci prošlih istraživanja s rasponima i srednjim vrednostima i standardnim devijacijama;

- podaci istovremene pozitivne kontrole;

- promene u plodnosti (broju hromozomske strukture ćelije), ukoliko su primećene.

5) Obrazloženju rezultata.

6) Zaključcima.

4. LITERATURA

1. Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert, B. and Magnusson, J. (Eds.) Liss, New York, pp. 477-484.

2. Adler, I.D., (1984). Cytogenetic tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J.M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.

3. Evans, E.P., Breckon, G. and Ford, C.E., (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294.

4. Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In vivo Cytogenetic Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.

5. Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, 207-209.

6. Adler, I.D., Shelby M.D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N.(1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313-318.

7. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working group: Dose setting in In vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.

8. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.

B.24. SPOT TEST NA MIŠEVIMA

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Videti Opšti uvod.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIP METODE

Ovo je in vivo ispitivanje na miševima prilikom kog se hemikalijama izlažu embrioni u razvoju. Ciljne ćelije u embrionima u razvoju su melanoblasti, dok su ciljni geni oni koji kontrolišu pigmentaciju dlake krzna. Embrioni u razvoju su heterozigotni kod niza ovih gena koji uslovljavaju boju krzna. Mutacija ili gubitak (zbog niza genetskih pojava) dominantnih alela takvog gena u melanoblastu ima za posledicu ekspresiju recesivnog fenotipa u ćelijama koje potom nastaju, stvarajući mrlju drugačije boje na krznu dobijenog miša. Broj potomaka s mrljama, mutacijama, prebroji se i učestalost njihovog javljanja upoređuje se s onom koja se javlja među potomcima koji nastanu iz embriona tretiranih isključivo rastvaračem. Test mrlje u miša otkriva pretpostavljene somatske mutacije u fetalnim ćelijama.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Nisu propisani.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Pripreme

Kada može, ispitivane supstance se rastvaraju ili suspenduju u izotoničnom rastvoru. Hemikalije koje su nerastvorljive u vodi rastvaraju se ili suspenduju u odgovarajućim vehikulumima. Vehikulum koji se koristi ne sme da interferira sa ispitivanom hemikalijom, niti da uzrokuje toksične efekte. Neophodna je primena svežih preparata ispitivane hemikalije.

1.6.1.1. Eksperimentalne životinje

Miševi T soja (jednobojni bez uzorka, a/a; činčila, ružičaste oči, cch p/cch p; smeđi, b/b; blage boje, kratke uši, d se/d se; šarene mrlje, s/s) pare se ili sa HT sojem (bleda boja, jednobojni bez uzorka, kratki udovi, pa a bp/pa a bp; nejasno olovnosivi, ln fz/ln fz; sedefasti pe/pe) ili sa C57BL (jednobojni bez uzorka, a/a). Mogu se koristiti i ostali odgovarajući oblici ukrštanja, kao što su NMRI (jednobojni bez uzroka, a/a; albino, c/c) i DBA (jednobojni bez uzorka, a/a; smeđi b/b; blage boje d/d) pod uslovom da se dobiju jednobojni potomci.

1.6.1.2. Broj i pol

Tretira se dovoljan broj gravidnih ženki kako bi se osigurao odgovarajući broj preživelih potomaka za svaki dozni nivo koja se primenjuje. Odgovarajuća veličina uzorka reguliše se zavisno od broja mrlja zapaženih kod tretiranih miševa i raspona kontrolnih podataka. Negativan rezultat prihvatljiv je samo kada je procenjivanje sprovedeno na najmanje 300 potomaka ženki tretiranih najvišom dozom.

1.6.1.3. Primena pozitivnih i negativnih kontrola (kontrolnih uzoraka)

Neophodno je da postoje podaci o istovremenim kontrolama miševa koji su tretirani samo medijumom (negativne kontrole). Mogu se sjediniti kontrolni podaci iz prethodnih istraživanja iste laboratorije kako bi se povećala osetljivost ispitivanja, pod uslovom da su navedena ispitivanja homogena. Podaci o pozitivnoj kontroli koji su nedavno dobijeni u istoj laboratoriji posle tretmana hemikalijom koja je pokazala mutagenost ovim testom, treba da budu dostupni ukoliko se ne primeti mutagenost ispitivane hemikalije.

1.6.1.4. Put primene

Uobičajeni putevi primene uključuju oralnu intubaciju ili intraperitonealno ubrizgavanje supstance gravidnim ženkama. Obavljanje tretmana inhalacijom ili drugim putevima primene koristi se kada to odgovara.

1.6.1.5. Dozni nivoi

Primenjuju se bar dva dozna nivoa, uključujući jednu kod koje se javljaju simptomi toksičnosti ili smanjenje veličine legla. Kod netoksičnih hemikalija potrebno je izlaganje maksimalnoj mogućoj dozi.

1.6.2. Postupak

Obavlja se jedan tretman tokom osmog, devetog ili desetog dana trudnoće, pri čemu se kao prvi dan broji onaj dan kada je prvi put primećen vaginalni "čep". Ovi dani odgovaraju vremenu od 7,25, 8,25 i 9,25 dana posle začeća. Mogu se primeniti i sukcesivni tretmani tokom navedenih dana.

1.6.2.1. Analiza

Potomci se šifriraju i posmatraju na postojanje mrlja između treće i četvrte nedelje posle rođenja. Razlikuju se tri kategorije mrlja:

a) bele mrlje unutar 5 mm od središnje ventralne (trbušne) linije za koje se pretpostavlja da su posledica ubijanja ćelija (u daljem tekstu: WMVS);

b) žute mrlje, nalik aguti boji, vezane uz područja grudi, genitalija, grla, područja pazuha i prepona i na sredini čela; za njih se pretpostavlja da su posledica pogrešne diferencijacije (u daljem tekstu: MDS);

v) pigmentne i bele mrlje slučajno raspoređene po krznu za koje se pretpostavlja da su posledica somatskih mutacija (u daljem tekstu: RS).

Vrednovanje se obavlja u sve tri kategorije, ali je samo poslednja, RS, od genetske važnosti. Poteškoće u razlikovanju MDS i RS mogu se rešiti fluorescentnom mikroskopijom uzoraka dlake.

Neophodno je zabeležiti očigledne makro morfološke abnormalnosti potomaka.

2. PODACI

Podaci se navode u obliku ukupnog broja vrednovanih potomaka i broja kod koga se pojavila jedna ili više mrlja za koje se pretpostavlja da su posledica somatske mutacije. Podaci o tretiranju upoređuju se sa podacima negativne kontrole primenom odgovarajućih metoda. Podaci se prikazuju na osnovi pojedinih legala.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži podatke o:

- sojevima upotrebljenim za ukrštanje;

- broju gravidnih ženki u eksperimentalnim i kontrolnim grupama;

- prosečnoj veličini legla u eksperimentalnim i kontrolnim grupama prilikom okota i prestanka dojenja;

- nivoima doza ispitivane hemikalije;

- upotrebljenom rastvaraču;

- danu gravidnosti na koji je tretman primenjen;

- načinu primene tretmana;

- ukupnom broju vrednovanih potomaka i broju sa WMVS, MDS i RS u eksperimentalnim i kontrolnim grupama;

- uočljivim morfološke abnormalnostima;

- odnosu doze/efekat kod RS-a kada je moguće;

- statističkoj proceni;

- obrazloženju rezultata;

- tumačenju rezultata.

3.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Videti Opšti uvod.

4. LITERATURA

Videti Opšti uvod.

B.25. NASLEĐENA TRANSLOKACIJA KOD MIŠA

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Videti Opšti uvod.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIP METODE

Ispitivanje nasleđene translokacije kod miša otkriva strukturne i numeričke hromozomske promene u polnim ćelijama sisara koje se pojavljuju kod potomstva prve generacije. Vrste otkrivenih hromozomskih promena obuhvataju recipročne translokacije i, ukoliko je uključeno potomstvo ženskog pola, gubitak hromozoma X. Kod nosilaca translokacija i XO-ženki javlja se smanjena plodnost koja se koristi za izbor F1 potomstva u svrhu citogenetske analize. Potpunu sterilnost izazivaju određene vrste translokacija (autozomni gen X (autozom) i c-t tip). Translokacije se citogenetski posmatraju u mejotskim ćelijama tokom dijakineze - metafaze 1 kod jedinki mužjaka, bilo F1 mužjaka ili potomaka muškog pola F1 ženki. XO-ženke citogenetski se identifikuju na osnovu postojanja samo 39 hromozoma tokom mitoza koštane srži.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Nisu propisani.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Pripreme

Hemikalije koje se ispituju rastvaraju se u izotoničnom rastvoru. Ukoliko su hemikalije nerastvorljive, suspenduju se u odgovarajućim vehikulumima. Koriste se sveže pripremljeni rastvori ispitivane supstance. Ukoliko se zbog lakšeg doziranja koristi vehikulum, on ne sme da interferira sa ispitivanim jedinjenjem, niti da uzrokuje toksične efekte.

1.6.1.1. Put primene

Putevi primene obično obuhvataju oralnu intubaciju ili intraperitonealne injekcije. Mogu da odgovaraju i drugi putevi primene.

1.6.1.2. Eksperimentalne životinje

Zbog lakšeg razmnožavanja i citološke verifikacije, eksperimenti se obavljaju na miševima. Nije potreban nikakav specifični mišji soj. Prosečna veličina legla soja treba da bude veća od osam i relativno konstantna.

Koriste se zdrave i polno zrele životinje.

1.6.1.3. Broj životinja

Potreban broj životinja zavisi od učestalosti spontanih translokacija i najnižeg stepena indukcije potrebne za pozitivan rezultat.

Ispitivanje se obično obavlja analizom muškog F1 potomstva. Po svakoj doziranoj grupi potrebno je ispitati najmanje 500 muških F1 potomaka. Ukoliko je u ispitivanje uključeno i žensko F1 potomstvo, potrebno je 300 mužjaka i 300 ženki.

1.6.1.4. Primena pozitivnih i negativnih kontrola

Potrebni su odgovarajući kontrolni podaci dobijeni na osnovu istovremene kontrole i kontrole iz prošlih ispitivanja. Kad postoje prihvatljivi rezultati pozitivne kontrole iz nedavno izvedenih ispitivanja u istoj laboratoriji, mogu se upotrebiti ovi rezultati umesto istovremene pozitivne kontrole.

1.6.1.5. Dozni nivoi

Ispituje se jedna doza, obično najviša doza koja je u vezi sa izazivanjem minimalnih toksičnih efekata, ali bez uticaja na reproduktivno ponašanje ili preživljavanje. Kako bi se uspostavio odnos između doze i efekta, potrebne su i dve dodatne niže doze. Kod netoksičnih hemikalija potrebno je izlaganje maksimalnoj mogućoj dozi.

1.6.2. Postupak

1.6.2.1. Tretiranje i parenje

Postoje dva plana tretiranja. Najviše se koristi pojedinačna primena ispitivane supstance. Ispitivana supstanca se može primenjivati sedam dana nedeljno tokom perioda od 35 dana. Broj parenja koji sledi posle tretmana određen je planom tretmana. Treba obezbediti obavljanje uzorkovanja u svim tretiranim stadijumima polnih ćelija. Na kraju perioda parenja ženke se pojedinačno stavljaju u kaveze. Kada se ženke okote, beleži se datum, veličina legla i pol potomstva. Svi muški potomci se odbijaju od sise, dok se svi ženski potomci odbacuju, osim ukoliko su obuhvaćeni ispitivanjem.

1.6.2.2. Ispitivanje heterozigotnosti kod translokacije

Koristi se jedna od dve moguće metode:

a) Ispitivanje plodnosti F1 potomstva i naknadna verifikacija mogućih nosilaca translokacije citogenetskom analizom;

b) Citogenetska analiza svih muških F1 potomaka bez prethodne selekcije na osnovu ispitivanja plodnosti.

a) Ispitivanje plodnosti

Smanjena plodnost F1 jedinki može se utvrditi praćenjem veličine legla i/ili analizom materičnog sadržaja ženskih ispitanika.

Neophodno je utvrditi kriterijume za određivanje normalne i smanjene plodnosti za soj miševa koji se koristi.

Praćenje veličine legla: F1 mužjaci, na kojima će biti izvedeno ispitivanje, pojedinačno se zatvaraju u kaveze zajedno sa ženkama iz istog eksperimenta ili iz kolonije. Kavezi se svakodnevno proveravaju, počevši 18 dana posle parenja. Prilikom okota beleži se veličina legla i pol F2 potomstva i legla se posle toga odbacuju. Ukoliko se ispituje žensko F1 potomstvo, F2 potomstvo iz malih legala zadržava se zbog daljih ispitivanja. Ženski nosioci translokacija proveravaju se citogenetskom analizom translokacije kod svakog od njihovih muških potomaka. XO-ženke prepoznaju se po promeni odnosa među polovima njihovog potomstva iz 1:1 u 1:2 u korist potomaka muškoga pola. U sekvencijalnom postupku normalne F1 životinje eliminišu se iz daljeg ispitivanja ukoliko prvo F2 leglo dostigne ili premaši unapred određenu normalnu vrednost. U suprotnom, obavlja se posmatranje drugog ili trećeg F2 legla.

F1 životinje koje se ne mogu klasifikovati kao normalne posle praćenja maksimalno tri F2 legla, ili se dalje ispituju analizom materičnog sadržaja ženskih ispitanika ili se direktno podvrgavaju citogenetskoj analizi.

Analiza materičnog sadržaja: do smanjenja veličine legla nosilaca translokacije dolazi zbog smrti embriona tako da visok broj mrtvih implantata upućuje na postojanje translokacije kod životinje koja se ispituje. Svaki F1 mužjak na kojem se obavlja ispitivanje pari se sa dve do tri ženke. Začeće se utvrđuje na osnovu svakodnevnih provera na postojanje vaginalnih "čepova" u jutarnjim satima. Ženke se žrtvuju 14 do 16 dana kasnije i registruju se živi i mrtvi implantati u njihovim matericama.

b) Citogenetska analiza

Preparati sadržaja testisa pripremaju se tehnikom vazdušnog sušenja. Nosioci translokacija prepoznaju se po postojanju multivalentnih struktura pri dijakinezi - metafazi 1 u primarnim spermatocitima. Opažanje najmanje dve ćelije sa multivalentnom asocijacijom dovoljan je dokaz da je ispitana životinja nosilac translokacije.

Ukoliko nije obavljena ni jedna selekcija tokom uzgoja, svi F1 mužjaci se proveravaju citogenetski. Neophodno je mikroskopski otkriti postojanje najmanje 25 ćelija u metafazi 1 dijakineze po mužjaku. Neophodan je pregled mitotskih metafaza u spermatogonijima ili koštanoj srži F1 mužjaka s malim testisima i mejotskom razgradnjom pre dijakineze ili F1 ženki za koje se sumnja da su XO. Postojanje neobično dugog i/ili kratkog hromozoma u svakoj od deset ćelija dokaz je posebne translokacije kod mužjaka koja izaziva sterilnost (c-t tip). Neke translokacije autozoma X koje uzrokuju sterilnost mužjaka mogu se prepoznati samo analizom koja primenjuje pruganje mitotskih hromozoma.

Postojanje 39 hromozoma u svih 10 mitoza dokaz je postojanja XO stanja kod ženke.

2. PODACI

Podaci se navode tabelarno.

Za svaki period parenja, posle parenja roditelja, registruje se srednja veličina legla i odnos polova prilikom okota i prestanka dojenja.

Za procenu plodnosti F1 životinja navodi se srednja veličina legla svih normalnih parenja i pojedinačne veličine legla F1 nosilaca translokacija. Za analizu materičnog sadržaja izveštava se o prosečnom broju živih i mrtvih implantata posle normalnih parenja i o pojedinačnim brojevima živih i mrtvih implantata za svako parenje F1 nosilaca translokacije.

Za citogenetsku analizu dijakineze-metafaze 1 beleži se broj vrsta multivalentnih struktura i ukupan broj ćelija za svakog nosioca translokacije.

Za sterilne F1 jedinke beleži se ukupan broj parenja i trajanje perioda parenja. Navodi se masa testisa i detalji citogenetske analize.

Za XO ženke beleži se srednja veličina legla, odnos polova F1 potomstva i rezultati citogenetske analize.

Kad je moguće, F1 nosioci translokacije prethodno se biraju na osnovu ispitivanja plodnosti i tabele moraju da obuhvataju podatke o tome koliki broj njih su potvrđeni heterozigoti translokacije.

Navode se i podaci negativnih i pozitivnih kontrola ispitivanja.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži podatke o:

- mišjem soju, starosti životinja, masi tretiranih životinja;

- broju životinja roditelja svakog pola u eksperimentalnim i kontrolnim grupama;

- uslovima ispitivanja, detaljan opis tretmana, nivoa doza, rastvarača, raspored parenja;

- broju i polu potomaka po svakoj ženki, broju i polu potomaka uzgojenih u svrhu analize translokacije;

- vremenu i kriterijumima analize translokacije;

- broju i detaljnom opisu nosilaca translokacije, uključujući podatke o parenju i podatke o materičnom sadržaju, u zavisnosti od konkretnog slučaja;

- citogenetskim postupcima i detaljima mikroskopske analize, po mogućstvu uz slike;

- statističkoj proceni;

- obrazloženju rezultata;

- tumačenje rezultata.

3.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Videti Opšti uvod.

4. LITERATURA

Videti Opšti uvod.

B.26. SUBHRONIČNA ORALNA TOKSIČNOST PONOVLJENIH DOZA - STUDIJA ORALNE TOKSIČNOSTI NA GLODARIMA, 90 DANA

1. METODA ISPITIVANJA

Metoda ispitivanja subhronične oralne toksičnosti potpuno odgovara metodi OECD: TG 408 (1998).

1.1. UVOD

Prilikom vrednovanja i procene toksičnih svojstava hemikalije subhronična oralna toksičnost može da se odredi primenom ponovljenih doza, a nakon što su, na osnovu 28-dnevnih ispitivanja toksičnosti, primenom akutne ili ponovljenih doza, dobijeni početni podaci o toksičnosti. Devedesetodnevno ispitivanje daje podatke o mogućim opasnostima po zdravlje koje će verovatno proizaći iz ponavljane dugotrajne izloženosti tokom perioda sazrevanja posle prestanka dojenja i perioda rasta, poprilično zahvatajući odraslo doba. Ispitivanje daje podatke o značajnijim toksičnim efektima, naznačava ciljne organe i mogućnost kumulacije, i može da obezbedi procenu nivoa ekspozicije pri kojem nisu primećeni neželjeni efekti, a koji se može primeniti prilikom izbora nivoa doze za hronična ispitivanja, kao i za utvrđivanje kriterijuma sigurnosti kod izlaganja ljudi.

Metoda stavlja dodatni akcenat na neurološke krajnje tačke i ukazuje na imunološke i reproduktivne efekte. Naglašava se i potreba za pažljivim kliničkim praćenjem životinja, s ciljem prikupljanja što veće količine podataka. Ovo ispitivanje treba da omogući prepoznavanje hemikalija koje imaju potencijal uzrokovanja neurotoksičnih i imunoloških efekata, kao i efekata na reproduktivnim organima, što može opravdati dalja detaljna istraživanja.

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Doza jeste količina ispitivane supstance koja se primenjuje. Doza se izražava kao masa (g, mg) ili kao masa ispitivane supstance po jedinici telesne mase eksperimentalne životinje (npr. mg/kg) ili u obliku konstantnih koncentracija izlaganja putem ishrane (ppm).

Doziranje jeste opšti pojam koji obuhvata dozu, njenu učestalost i vremensko trajanje doziranja.

NOAEL jeste skraćenica za nivo pri kojem nisu primećeni neželjeni efekti i predstavlja najviši nivo doze pri kojoj nisu primećeni nikakvi štetni nalazi vezani za tretman.

1.3. PRINCIP METODE

Ispitivana supstanca primenjuje se svakodnevno oralnim putem u rastućim dozama kod nekoliko grupa eksperimentalnih životinja i to po jedan dozni nivo po grupi tokom 90 dana. Tokom perioda primene, životinje se pažljivo posmatraju zbog uočavanja simptoma toksičnosti. Na životinjama koje uginu ili budu žrtvovane tokom ispitivanja obavlja se postmortalni pregled, dok se, po završetku ispitivanja, preživele životinje takođe žrtvuju i postmortalno pregledaju.

1.4. OPIS METODE

1.4.1. Priprema životinja

Prilikom ispitivanja neophodno je koristiti zdrave životinje koje su se aklimatizovale na laboratorijske uslove najmanje pet dana i nisu bile predmet prethodnih eksperimentalnih postupaka. Eksperimentalne životinje potrebno je okarakterisati kao vrstu, soj, poreklo, pol, telesnu masu i/ili starost. Životinje se slučajnim izborom dodeljuju kontrolnim grupama i grupama koje se tretiraju. Kavezi treba da budu razmešteni na način kojim će mogući efekti koji proizlaze iz položaja kaveza biti svedeni na najmanju moguću meru. Svakoj životinji dodeljuje se jedinstveni identifikacioni broj.

1.4.2. Priprema doza

Ispitivana supstanca daje se putem intubacione cevi ili putem hrane ili vode za piće. Metoda oralne primene zavisi od svrhe ispitivanja, kao i od fizičkih i hemijskih svojstava ispitivanog materijala.

Kada je potrebno, ispitivana supstanca se rastvara ili suspenduje u odgovarajućem vehikulumu. Preporučuje se da se, kad god je moguće, uzme u obzir primena vodenog rastvora/suspenzije, posle čega se razmatra rastvor/emulzija u ulju (npr. kukuruzno ulje), a tek posle toga moguće je rastvaranje u ostalim vehikulumima. Za sve vehikulume, osim vode, moraju biti poznata toksična svojstva. Neophodno je utvrditi stabilnost ispitivane supstance u uslovima primene.

1.4.3. Uslovi ispitivanja

1.4.3.1. Eksperimentalne životinje

Najpogodnija životinjska vrsta je pacov, iako se mogu primeniti i ostale vrste glodara, na primer miševa. Koriste se mlade zdrave odrasle životinje laboratorijskih sojeva koji se obično upotrebljavaju. Biraju se ženke koje nisu ranije rađale i koje nisu gravidne. Sa doziranjem treba započeti što je pre moguće posle prestanka dojenja, a pre nego što životinje navrše devet nedelja. Prilikom započinjanja ispitivanja, odstupanje u telesnoj masi životinja koje se koriste treba da bude minimalno i ne sme da odstupa više od ±20% prosečne telesne mase svakog pola. Kada se istraživanje obavlja kao preliminarno, pre dugotrajnog ispitivanja hronične toksičnosti, u oba ispitivanja treba upotrebiti životinje koje su istog soja i istog porekla.

1.4.3.2. Broj i pol

Prilikom ispitivanja svake doze treba upotrebiti najmanje 20 životinja (deset ženki i deset mužjaka). Ukoliko se planira žrtvovanje u međuvremenu, broj je potrebno povećati za broj životinja čije se žrtvovanje planira pre završetka ispitivanja. Na osnovu prethodnog znanja o hemikaliji ili bliskom analogu, potrebno je razmotriti uključivanje dodatne prateće grupe od deset životinja (pet po polu) u kontrolnu grupu i grupu koja prima najvišu dozu, zbog praćenja reverzibilnosti ili postojanosti bilo kog od toksičnih efekata po isteku perioda tretiranja. Trajanje ovog perioda posle tretiranja utvrđuje se u skladu sa zapaženim efektima.

1.4.3.3. Nivoi doziranja

Potrebno je koristiti najmanje tri nivoa doze i istovremenu kontrolu, osim u slučajevima u kojima se obavlja ispitivanje granične doze (videti odeljak 1.4.3.4. ove metode). Nivoi doze mogu da se temelje na rezultatima ispitivanja s ponovljenim doziranjem ili rezultatima ispitivanja namenjenog utvrđivanju raspona. Uzimaju se u obzir svi postojeći toksikološki i toksikokinetički podaci koji postoje za ispitivanu supstancu ili materijal s njom u vezi. Najviša doza bira se sa ciljem da izazove toksičnost, ali ne i smrt ili ozbiljne tegobe, osim ukoliko nije ograničena fizičkim i hemijskim karakteristikama ili biološkim efektima ispitivane supstance. Opadajući niz doza bira se s ciljem da se dokažu bilo kakve reakcije povezane s doziranjem, kao i najviši nivo na kome nisu primećeni neželjeni efekti (u daljem tekstu: NOAEL) pri najnižem nivou doze. Za uspostavljanje silaznih nivoa doza najčešće su optimalni dvostruki intervali, pa sve do četvorostrukih, dok je dodavanje četvrte eksperimentalne grupe preporučljivije od korišćenja vrlo velikih intervala između doziranja.

Kontrolna grupa je ona koja se ne tretira ili kontrolna grupa koja se tretira samo vehikulumom ukoliko se isti koristi prilikom davanja ispitivane supstance. Izuzev tretiranja ispitivanom supstancom, sa životinjama u kontrolnoj grupi postupa se na isti način kao i sa eksperimentalnim grupama. Ukoliko se koristi vehikulum, kontrolna grupa prima vehikulum u najvišoj zapremini koja se primenjuje. Ukoliko se ispitivana supstanca daje zajedno sa hranom i uzrokuje smanjen unos hrane tada se, za razlikovanje smanjenog unosa uzrokovanog ukusom i onog usled toksikoloških promena kod eksperimentalnog modela, koristi paralelno hranjena kontrolna grupa.

U obzir se uzimaju sledeća svojstva vehikuluma i ostalih dodataka, u zavisnosti od slučaja: efekti na apsorpciju, raspodelu, metabolizam ili zadržavanje ispitivane supstance; efekta na hemijska svojstva ispitivane supstance koji mogu promeniti njena toksična svojstva i efekti na potrošnju hrane i vode ili stanje uhranjenosti životinja.

1.4.3.4. Ispitivanje granične doze

Ukoliko zbog eksperimenta s jednim nivoom doze, koja je najmanje jednaka 1.000 mg/kg TM/dnevno, a koji se koristi u postupcima opisanim za ovo ispitivanje, ne nastanu nikakvi primetni neželjeni efekti i ukoliko se toksičnost ne očekuje na osnovu podataka o strukturno sličnim supstancama, tada se ne smatra neophodnim celokupno ispitivanje koje primenjuje tri nivoa doziranja. Ispitivanje granične doze nije primenljiv u slučajevima kad izloženost ljudi ukazuje na potrebu za primenom višeg nivoa doze.

1.5. POSTUPAK

1.5.1. Primena doza

Životinjama se ispitivana supstanca daje svakodnevno, sedam dana nedeljno tokom perioda od 90 dana. Bilo koji drugi režim doziranja, na primer, pet dana nedeljno, potrebno je opravdati. Kada se ispitivana supstanca primenjuje putem intubacijske cevi (prisilno hranjenje), istu je potrebno dati u obliku jedne doze životinjama koje koriste želudačnu cev ili odgovarajuću intubacijsku kanilu. Maksimalna zapremina tečnosti koja es može dati odjednom zavisi od veličine eksperimentalne životinje. Zapremina ne sme da bude veća od 1ml/100g TM, osim u slučaju vodenih rastvora kada je moguće primeniti 2 ml/100g TM. Izuzev u slučaju iritativnih ili korozivnih supstanci kod kojih se nepovoljni efekti obično pokazuju pri višim koncentracijama, varijabilnost eksperimentalne zapremine treba da bude svedena na najmanju moguću meru prilagođavanjem koncentracije, a kako bi se osigurala konstantna zapremina pri svim nivoima doza.

Kod supstanci koje se primenjuju putem hrane ili vode za piće važno je osigurati da količine ispitivane supstance o kojoj je reč ne ometaju redovnu ishranu i ravnotežu vode. Kada se ispitivana supstanca daje putem hrane, može da se primeni konstantna prehrambena koncentracija (ppm) ili konstantni dozni nivo u odnosu na telesnu masu životinje. Alternativa koja se koristi mora se da se naznači. U slučaju supstance koja se daje prisilnim hranjenjem (intubacijskom cevi), dozu je potrebno dati svaki dan u isto vreme i po potrebi prilagoditi kako bi se održala konstantna doza u odnosu na telesnu masu životinje. Kada se 90-dnevno ispitivanje koristi kao preliminarno ispitivanje dugotrajnog ispitivanja hronične toksičnosti, preporučljivo je u oba ispitivanja primeniti sličan način ishrane.

1.5.2. Posmatranja

Praćenje treba da traje najmanje 90 dana. Životinje u pratećoj grupi za koje se planiraju dodatna posmatranja potrebno je, odgovarajuće vreme, držati bez tretmana, a kako bi se otkrila postojanost ili oporavak od toksičnih efekata.

Opšta klinička posmatranja obavljaju se najmanje jednom dnevno, najbolje u isto vreme svakog dana, uzimajući u obzir najznačajniji period očekivanih efekata posle doziranja. Neophodno je zabeležiti kliničko stanje životinja. Najmanje dvaput dnevno, obično početkom i krajem svakog dana, sve životinje se proveravaju na simptome morbiditeta i mortaliteta.

Najmanje jednom pre prvog izlaganja (kako bi se omogućilo poređenje kod istih ispitanika) i jednom nedeljno posle toga, potrebno je detaljno kliničko snimanje stanja svih životinja. Navedena posmatranja potrebno je obaviti izvan kaveza u kojem životinja inače boravi, najbolje u standardnom okruženju i svaki put u slično vreme. Posmatranja se pažljivo registruju, najbolje korišćenjem sistema vrednovanja, izričito definisanih od strane laboratorije koja obavlja ispitivanje. Neophodno je uložiti određeni napor kako bi se obezbedilo da su odstupanja u uslovima posmatranja minimalna. Simptomi koji se beleže treba da obuhvataju, ali da ne budu ograničeni na, promene na koži, krznu, očima, mukoznim membranama, pojavi sekreta ili ekskreta i autonomnu aktivnost (npr. suzenje, piloerekcija, veličina zenica, neobična respiratorna struktura). Registruju se i promene u hodu, držanju i reakciji na manipulisanje, kao i postojanje kloničkih ili toničkih pokreta, šablone u ponašanju (npr. preterano negovanje spoljašnosti, ponovljeno kruženje) ili neobično ponašanje (npr. samoozleđivanje, hodanje unatrag)1.

Oftalmološki pregled, korišćenjem oftalmoskopa ili podjednako odgovarajuće opreme, potrebno je obaviti pre primene ispitivane supstance i po završetku ispitivanja, najbolje kod svih životinja, ali najmanje u grupama koje primaju visoku dozu i kontrolnim grupama. Ukoliko se primete promene na očima, neophodan je pregled svih životinja.

Pri kraju perioda izlaganja, a u svakom slučaju ne ranije od jedanaeste nedelje, obavlja se ocena senzorne reaktivnosti na podražaje različitih vrsta1 (npr. zvučne, vizuelne i proprioceptivne podražaje)2, 3, 4, ocenu jačine stiska5 i ocenu motorne aktivnosti6. Dalje pojedinosti o postupcima kojih se treba pridržavati navedene su u literaturi. Mogu se primeniti i alternativni postupci različiti od onih iz literature.

Mogu se izostaviti funkcionalna posmatranja koja se obavljaju pri kraju ispitivanja kad postoje podaci o funkcionalnim posmatranjima iz drugih istraživanja, a dnevna klinička posmatranja nisu otkrila nikakve funkcionalne nedostatke.

Izuzetno, funkcionalna posmatranja mogu se izostaviti i kod grupa koje na drugi način pokazuju simptome toksičnosti do mere koja bi znatno ometala obavljanje funkcionalnog ispitivanja.

1.5.2.1. Telesna masa i potrošnja hrane/vode

Sve životinje se mere najmanje jednom nedeljno. Merenje potrošnje hrane potrebno je obavljati najmanje jednom nedeljno. Ukoliko se ispitivana supstanca daje putem vode za piće, meri se i potrošnju vode, i to najmanje na nedeljnom nivou. Potrošnja vode može se razmatrati i u ispitivanjima koja se odnose na ishranu ili prisilno hranjenje tokom kojih može doći do promene u aktivnosti uzimanja tečnosti.

1.5.2.2. Hematologija i medicinska biohemija

Uzorke krvi potrebno je uzeti s navedenog izvora i čuvati pod odgovarajućim uslovima, u zavisnosti od konkretnog slučaja. Na kraju perioda ispitivanja uzorci se prikupljaju neposredno pre ili u okviru postupka žrtvovanja životinja.

Na kraju perioda ispitivanja, i uvek kada su u međuvremenu prikupljeni bilo kakvi uzorci krvi, neophodno je obaviti sledeća hematološka ispitivanja: hematokrit, koncentracija hemoglobina, broj eritrocita, ukupni i diferencijalni broj leukocita, broj trombocita i određivanje vremena/potencijala zgrušavanja krvi.

Medicinsko-biohemijska određivanja koja se izvode u cilju istraživanja značajnijih toksičnih efekata u tkivima, odnosno u cilju istraživanja efekata na bubrege i jetru, potrebno je obaviti na uzorcima krvi svake životinje neposredno pre žrtvovanja ili u okviru postupka žrtvovanja životinja (osim kod životinja koje su umirale i/ili su žrtvovane). Slično hematološkim ispitivanjima, može se obaviti uzorkovanje u međuvremenu i u svrhu medicinsko-biohemijskih ispitivanja. Preporučuje se uskraćivanje hrane životinjama tokom noći pre uzimanja uzoraka krvi.XXXIX Određivanja u plazmi ili serumu treba da obuhvate: natrijum, kalijum, glukozu, ukupni holesterol, ureju, azot iz uree u krvi (u daljem tekstu: BUN), kreatinin, ukupne proteine i albumin i više od dva enzima indikatora hepatocelularnih efekata (poput alanin aminotransferaze, aspartat aminotransferaze, alkalne fosfataze, gama glutamil transpeptidaze i sorbitol dehidrogenaze). Mogu se obaviti i merenja dodatnih enzima (jetrenog ili drugog porekla) i žučnih kiselina, a koji, pod određenim okolnostima, mogu dati korisne podatke.

Opciono, tokom poslednje nedelje ispitivanja prikupljanjem zapremine urina u ograničenom vremenskom periodu mogu se obaviti sledeća određivanja u okviru analize urina: izgled, volumen, osmolalnost ili specifična težina, pH, proteini, glukoza i krv/krvne ćelije. Potrebno je razmotriti i ispitivanja serumskih markera opštih oštećenja tkiva. Ostala određivanja koja je potrebno obaviti, ukoliko su poznata svojstva ispitivane supstance ili postoji sumnja da utiču na srodne metaboličke profile, obuhvataju kalcijum, fosfor, vrednost triglicerida na prazan želudac, specifične hormone, methemoglobin i holinesteraze. Navedeno je potrebno identifikovati kod hemikalija koje pripadaju određenim kategorijama ili u zavisnosti od slučaja.

Potreban je fleksibilan pristup u zavisnosti od životinjske vrste i primećenih odnosno očekivanih efekata ispitivane supstance.

Ukoliko osnovni podaci ranijih studija ne odgovaraju, razmatra se potreba za utvrđivanjem hematoloških i kliničko biohemijskih parametara pre početka doziranja. Ne preporučuje se utvrđivanje ovih podataka pre tretmana7.

______________
XXXIX Kod niza merenja u serumu i plazmi, posebno u slučaju glukoze, preporučuje se uskraćivanje hrane tokom noći. Glavni razlog je činjenica da povećana varijabilnost, koja neizbežno nastaje kao posledica uzimanja hrane, može prikriti nešto suptilnije efekte i otežati tumačenje.
S druge strane, gladovanje tokom noći može ometati opšti metabolizam životinja i, posebno u studijama koje se bave ishranom, narušiti dnevno izlaganje ispitivanoj supstanci. Ukoliko se usvoji gladovanje tokom noći, medicinsko-biohemijska ispitivanja izvode se posle obavljanja funkcionalnih ispitivanja.

1.5.2.3. Postmortalni pregled (postmortalni pregled)

Sve životinje obuhvaćene ispitivanjem podvrgavaju se detaljnom postmortalnom pregledu koji uključuje pažljiv pregled spoljne površine tela, svih telesnih otvora i kranijalne, torakalne i abdominalne šupljine i njihovih sadržaja. Sa jetre, bubrega, nadbubrežne žlezde, testisa, epididimisa, uterusa, ovarijuma, grudne žlezde, slezine, mozga i srca svake životinje (osim životinja koje su zatečene na samrti i/ili su interkurentno žrtvovane) potrebno je odstraniti sva pripadajuća tkiva, zavisno od slučaja, i izmeriti njihovu masu u vlažnom stanju što je pre moguće posle disekcije kako bi se izbeglo isušivanje.

U medijumu za fiksaciju koji je najpogodniji s obzirom na vrstu tkiva i histopatološko ispitivanje koje sledi potrebno je sačuvati sledeća tkiva: sve makro lezije, mozak (reprezentativna područja, uključujući veliki mozak, mali mozak i medulu/most), kičmenu moždinu (na tri nivoa: cervikalnoj regiji, sredini torakalne regije i lumbalnoj regiji), hipofizu, štitnu žlezdu, paratiroidnu žlezdu, grudnu žlezdu, jednjak, pljuvačne žlezde, želudac, tanko i debelo crevo (uključujući Peyerove ploče), jetru, gušteraču, bubrege, nadbubrežne žlezde, slezinu, srce, dušnik i pluća (očuvana naduvavanjem fiksirom i zatim uranjanjem), aortu, polne žlezde, uterus, pomoćne polne organe, ženske mlečne žlezde, prostatu, mokraćnu bešiku, žučnu bešiku (miš), limfne žlezde (najbolje jedna limfna žlezda koja pokriva put kojim se supstanca primenjuje i druga koja je udaljena od puta kojim se supstanca primenjuje kako bi se obuhvatili sistemski efekti), periferne nerve (ishijatični ili tibijalni nerv) najbolje u blizini mišića, uzorak koštane srži (i/ili sveži aspirat koštane srži), kožu i oči (ukoliko su na njima primećene promene tokom oftalmoloških pregleda). Klinički i ostali nalazi mogu da ukažu na potrebu ispitivanja dodatnih tkiva. Potrebno je sačuvati i sve organe za koje postoji verovatnoća da su ciljni organi, a na osnovu poznatih svojstava ispitivane supstance.

1.5.2.4. Histopatologija

Potrebno je obavljanje celovite histopatologije na sačuvanim organima i tkivima svih životinja u kontrolnim grupama i grupama koje su primale visoke doze. Navedenim ispitivanjima obuhvataju se životinje svih ostalih grupa doziranja, ukoliko su kod grupe koja je primala visoku dozu primećene promene vezane za tretman.

Neophodno je ispitati sve veće lezije.

Ako se koristi prateća grupa, histopatologija se obavlja na tkivima i organima na kojima je primećeno ispoljavanje efekata u tretiranim grupama.

2. PODACI

Podaci se navode pojedinačno, tabelarno, tako što se navode: broj životinja na početku ispitivanja u svakoj ispitivanoj grupi, broj životinja koje su pronađene mrtve tokom ispitivanja ili su žrtvovane iz humanih razloga, kao i vreme svake smrti ili humanog žrtvovanja, broj životinja kod kojih su se pojavili simptomi toksičnosti, opis primećenih simptoma toksičnosti, uključujući vreme njihovog nastupanja, trajanje i ozbiljnost svakog toksičnog efekta, broj životinja kod kojih su se javile lezije, vrsta lezija i procent životinja kod kojih se pojavila svaka vrsta lezija.

Kada odgovara, numerički rezultati se procenjuju pomoću odgovarajuće i opšteprihvaćene statističke metode. Statističke metode i podaci koji se analiziraju biraju se tokom osmišljavanja ispitivanja.

3. IZVEŠTAJ

Izveštaj o ispitivanju mora da sadrži podatke o:

1) Ispitivanoj supstanci:

- fizička svojstva, čistoća i fizička i hemijska svojstva;

- podaci za identifikaciju;

- vehikulum (ukoliko odgovara): razlozi za izbor vehikuluma, ukoliko nije reč o vodi.

2) Vrsti životinja koje se ispituju:

- upotrebljena vrsta i soj;

- broj, starost i pol životinja;

- poreklo, uslovi smeštaja, ishrana, itd.;

- pojedinačna telesna masa životinja na početku ispitivanja.

3) Uslovima ispitivanja:

- logička osnova za izbor nivoa doza;

- detalji o pripremanju ispitivane supstance/pripremanju hrane, postignuta koncentracija, stabilnost i homogenost preparata;

- detalji o načinu primene ispitivane supstance na životinjama;

- stvarne doze (mg/kg TM/dnevno) i faktor preračunavanja koncentracije ispitivane supstance u hrani/vodi za piće (ppm) u stvarnu dozu, ukoliko je primenljivo na konkretan slučaj;

- detalji o kvalitetu hrane i vode.

4) Rezultatima:

- telesna masa i promene u telesnoj masi;

- potrošnja hrane i vode, ako je merodavno;

- podaci o toksičnoj reakciji po polu i nivou doze, uključujući simptome toksičnosti;

- priroda, ozbiljnost i trajanje kliničkih zapažanja (bilo u slučaju prolaznih, bilo neprolaznih efekata);

- rezultati oftalmološkog pregleda;

- ocene senzorne aktivnosti, jačine stiska i motornih aktivnosti (kad je moguće);

- hematološka ispitivanja sa relevantnim osnovnim vrednostima;

- medicinsko biohemijska ispitivanja sa relevantnim osnovnim vrednostima;

- telesna masa po žrtvovanju, masa organa i odnos mase organa/TM;

- obdukcioni nalazi;

- detaljan opis svih histopatoloških nalaza;

- podaci o apsorpciji ukoliko postoje;

- statistička obrada rezultata, kada odgovara.

5) Obrazloženju rezultata.

6) Zaključcima.

4. LITERATURA

1. IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.

2. Tupper, D.E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta N eurobiol. Exp., 40, 999-1003.

3. Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J.Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704.

4. Moser, V.C., Mc Daniel, K.M., Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, 267-283.

5. Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assesment of Fore- and Hind- limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, 233-236.

6. Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 59 9-609.

7. Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996). "Harmonisation of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies", Fundam. & Appl. Toxicol., 29, 198-201.

B.27. SUBHRONIČNA ORALNA TOKSIČNOST PONOVLJENIH DOZA - STUDIJA ORALNE TOKSIČNOSTI NA NE-GLODARIMA, 90 DANA

1. METODA ISPITIVANJA

Metoda ispitivanja subhronične oralne toksičnosti potpuno odgovara metodi OECD: TG 409 (1998).

1.1. UVOD

Prilikom vrednovanja i ocene toksičnih svojstava hemikalije mogu se odrediti subhronične oralne toksičnosti primenom ponovljenih doza, a nakon što su, na osnovu 28-dnevnih ispitivanja toksičnosti, primenom akutne ili ponovljenih doza, dobijeni početni podaci o toksičnosti. Devedesetodnevno ispitivanje daje podatke o mogućim opasnostima po zdravlje koje verovatno proizilaze iz ponavljane izloženosti tokom perioda ubrzanog rasta i ulaska u mlađe odraslo doba. Ispitivanje daje podatke o značajnijim toksičnim efektima, naznačava ciljne organe i mogućnost kumulacije, i može da pruži procenu nivoa ekspozicije pri kome nisu opaženi neželjeni efekti, a koji se može primeniti prilikom izbora nivoa doze za ispitivanja u kojima se primenjuju hronične doze, kao i prilikom utvrđivanja kriterijuma bezbednosti kod izlaganja ljudi.

Eksperimentalna metoda omogućava prepoznavanje štetnih efekata koji se javljaju kod vrsta koje nisu glodari prilikom izlaganja hemikalijama. Potrebno je ovu metodu koristiti isključivo:

- kad efekti primećeni u drugim ispitivanjima ukazuju na potrebu za razjašnjenjem/ karakterizacijom kod druge vrste koja ne pripada rodu glodara ili

- kada toksikokinetička ispitivanja pokazuju da je korišćenje specifične vrste ne-glodara najrelevantniji izbor laboratorijske životinje ili

- u slučajevima kad ostali specifični razlozi opravdavaju upotrebu određene vrste ne-glodara.

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Doza jeste količina ispitivane supstance koja se primenjuje. Doza se izražava kao masa (g, mg) ili kao masa ispitivane supstance po jedinici telesne mase eksperimentalne životinje (npr. mg/kg) ili u obliku konstantnih prehrambenih koncentracija (ppm).

Doziranje jeste opšti pojam koji obuhvata dozu, njenu učestalost i vremensko trajanje doziranja.

NOAEL jeste skraćenica za nivo na kojem nisu opaženi neželjeni efekti i predstavlja najviši nivo doze pri kojoj ne postoje nikakvi štetni nalazi vezani za tretman.

1.3. PRINCIP METODE

Ispitivana supstanca primenjuje se dnevno oralnim putem i u progresivnim dozama kod nekoliko grupa eksperimentalnih životinja, i to jedan dozni nivo po grupi tokom 90 dana. Tokom perioda primene životinje se pažljivo posmatraju zbog uočavanja simptoma toksičnosti. Na životinjama koje uginu ili budu žrtvovane tokom ispitivanja obavlja se postmortalni pregled, dok se, po zaključenju ispitivanja, preživele životinje takođe žrtvuju i postmortalno pregledaju.

1.4. OPIS METODE

1.4.1. Izbor životinjske vrste

Najčešće korišćena vrsta ne-glodara je pas koji treba da bude određene pasmine. Često se koristi bigl (kratkonogi pas zečar). Ostale vrste, poput svinja i patuljastih svinja takođe se mogu koristiti. Korišćenje primata se ne preporučuje i njihova primena treba da bude opravdana. Neophodno je koristiti mlade zdrave životinje. U slučaju pasa s doziranjem je najbolje započeti pri starosti od 4 do 6 meseci i ne kasnije od 9 meseci starosti. Kad se istraživanje obavlja kao preliminarno, pre dugotrajnog ispitivanja hronične toksičnosti, u oba ispitivanja treba upotrebiti istu vrstu/pasminu životinja.

1.4.2. Priprema životinja

Prilikom ispitivanja obavezno se koriste zdrave mlade životinje koje su se aklimatizovale na laboratorijske uslove i koje nisu bile predmet prethodnih eksperimentalnih postupaka. Trajanje aklimatizacije zavisi od odabrane eksperimentalne životinjske vrste i njenog porekla. Preporučuje se aklimatizacija u trajanju od najmanje pet dana za pse ili svinje uzgojene u tu svrhu, a koje pripadaju koloniji životinja trajno smeštenoj na lokaciji ispitivanja, i najmanje dve nedelje za iste životinje ukoliko potiču iz spoljašnjih izvora. Eksperimentalne životinje se označavaju s obzirom na njihovu vrstu, soj, poreklo, pol, težinu i/ili starost. Životinje se nasumično dodeljuju kontrolnim grupama i grupama koje se tretiraju. Kavezi treba da budu razmešteni na način kojim će mogući efekti koji proizlaze iz položaja kaveza biti svedeni na najmanju moguću meru. Svakoj životinji se dodeljuje jedinstveni identifikacioni broj.

1.4.3. Priprema doza

Ispitivana supstanca se daje putem hrane ili vode za piće, prisilnim hranjenjem (putem intubacijske cevi) ili u obliku kapsula. Metoda oralne primene zavisi od svrhe ispitivanja, kao i od fizičkih i hemijskih svojstava ispitivane supstance.

Kada je potrebno, ispitivana supstanca se rastvara ili suspenduje u odgovarajućem medijumu. Preporučuje se da se, kad god je moguće, uzme u obzir primena vodenog rastvora/suspenzije, posle čega se razmatraju rastvori/emulzije u ulju (npr. kukuruzno ulje), a tek posle toga moguće rastvaranje u ostalim vehikulumima. Za sve vehikulume, osim vode, moraju biti poznata toksična svojstva. Neophodno je utvrditi stabilnost ispitivane supstance u uslovima primene.

1.5. POSTUPAK

1.5.1. Broj i pol životinja

Prilikom ispitivanje svake doze treba upotrebiti najmanje osam životinja (četiri ženke i četiri mužjaka). Ukoliko se u međuvremenu planira žrtvovanje, broj je potrebno povećati za broj životinja čije se žrtvovanje planira pre zaključenja ispitivanja. Broj životinja na kraju ispitivanja mora odgovara za značajno vrednovanje toksičnih efekata. Na osnovu prethodnog znanja o supstanci ili njenom bliskom analogu, potrebno je uzeti u obzir uključivanje dodatne prateće grupe od osam životinja (četiri po polu) u kontrolnu grupu i grupu koja prima najvišu dozu, a zbog praćenja prolaznosti (reverzibilnosti) ili postojanosti bilo kog od toksičnih efekata po isteku perioda tretiranja. Trajanje ovoga perioda posle tretiranja utvrđuje se u skladu sa opaženim efektima.

1.5.2. Doziranje

Upotrebljava se najmanje tri nivoa doze i istovremena kontrola, osim u slučajevima kada se obavlja ispitivanje granične doze (videti odeljak 1.5.3. ove metode). Nivoi doze mogu se zasnivati na rezultatima ispitivanja s ponovljenom dozom ili na rezultatima ispitivanja namenjenog utvrđivanju raspona. Treba uzeti u obzir sve postojeće toksikološke i toksikokinetičke podatke koji postoje za ispitivano jedinjenje ili srodne materije. Osim ukoliko nije ograničena fizičkom i hemijskom prirodom ili biološkim efektima ispitivane supstance, najviša doza se bira sa ciljem da izazove toksičnost, ali ne smrt ili ozbiljne tegobe. Opadajući niz doza bira se s namerom da se dokažu bilo kakve reakcije povezane sa doziranjem, kao i nivoa pri kome se ne opažaju neželjeni efekti (NOAEL) pri najnižoj dozi. Dvostruki intervali, pa sve do četvorostrukih, najčešće su optimalni za uspostavljanje silaznih doza, dok je dodavanje četvrte eksperimentalne grupe često preporučljivije od korišćenja vrlo velikih intervala između doziranja.

Kontrolna grupa je ona koja se ne tretira ili kontrolna grupa koja se tretira samo vehikulumem ukoliko se isti koristi prilikom davanja ispitivane supstance. Izuzev načina tretiranja ispitivanom supstancom, sa životinjama u kontrolnoj grupi potrebno je postupati na način kao i sa eksperimentalnim grupama. Ukoliko se koristi vehikulum, kontrolna grupa dobija vehikulum u najvišoj količini koja se primenjuje. Ukoliko se ispitivana supstanca daje zajedno s hranom i uzrokuje smanjen unos hrane tada, u razlikovanju smanjenog unosa uzrokovanog ukusom ili toksikološkim promenama kod eksperimentalnog modela, može biti od koristi paralelno hranjena kontrolna grupa.

Uzimaju se u obzir sledeća svojstva vehikuluma i ostalih dodataka, u zavisnosti od slučaja: delovanje na apsorpciju, raspodelu, metabolizam ili zadržavanje ispitivane supstance; dejstvo na hemijska svojstva ispitivane supstance koje može promeniti njena toksična svojstva i delovanje na potrošnju hrane i vode ili stanje uhranjenosti životinja.

1.5.3. Ispitivanje granične doze

Ukoliko prilikom ispitivanja sa jednim nivoom doze, koja je najmanje jednaka nivou od 1.000 mg/kg TM/dnevno, u eksperimentu u kome se koriste postupci opisani za ovo ispitivanje, ne nastanu nikakvi štetni efekti i ukoliko se toksičnost ne očekuje na osnovu podataka o strukturno srodnim supstancama, ne smatra se neophodnim celokupno ispitivanje koje primenjuje tri nivoa doziranja. Ispitivanje granične doze se ne primenjuje samo u slučajevima kada izloženost ljudi ukazuje na potrebu za primenom veće doze.

1.5.4. Primena doza

Ispitivana supstanca se životinjama daje svakodnevno, sedam dana nedeljno tokom perioda od 90 dana. Bilo koji drugi režim doziranja, na primer, pet dana nedeljno, potrebno je opravdati. Kada se ispitivana supstanca primenjuje putem intubacijske cevi (prisilno hranjenje), životinjama koje koriste želudačnu cev ili odgovarajuću intubacionu kanilu, potrebno je dati u obliku jedne doze. Maksimalna zapremina tečnosti koja se može dati odjednom zavisi od veličine eksperimentalne životinje. Neophodno je držati zapreminu na najnižem mogućem nivou. Izuzev u slučaju iritabilnih ili korozivnih supstanci kod kojih se obično lošiji efekti pokazuju pri višim koncentracijama, varijabilnost eksperimentalne zapremine treba svesti na najmanju moguću meru prilagođavanjem koncentracije, a kako bi se osigurala konstantna zapremina pri svim nivoima doza.

Kod supstance koje se daju putem hrane ili vode za piće važno je obezbediti da količine ispitivane supstance o kojoj je reč ne ometaju redovnu ishranu i ravnotežu vode. Kad se ispitivana supstanca primenjuje hranom, može se primeniti konstantna prehrambena koncentracija (ppm) ili konstantna doza u odnosu na telesnu masu životinje. Alternativa koja se koristi mora se označiti. U slučaju supstance koja se daje prisilnim hranjenjem (intubacijskom cevi) ili u obliku kapsula, dozu je potrebno dati svaki dan u isto vreme i po potrebi prilagoditi kako bi se održala konstantna doza u odnosu na telesnu masu životinje. Kad se 90-dnevno ispitivanje koristi kao preliminarno ispitivanje dugotrajnog ispitivanja hronične toksičnosti, preporučljivo je u oba ispitivanja primeniti sličan način ishrane.

1.5.5. Opažanja

Posmatranje treba da traje najmanje 90 dana. Životinje u pratećoj grupi za koje se planiraju dodatna praćenja potrebno je, odgovarajuće vreme, držati bez tretmana, a kako bi se otkrila postojanost ili oporavak od toksičnih efekata.

Opšti klinički pregled treba obavljati najmanje jednom dnevno, najbolje u isto vreme svakog dana, uzimajući u obzir najznačajniji period u kome se očekuje pojava efekata posle doziranja. Neophodno je zabeležiti kliničko stanje životinja. Najmanje dvaput dnevno, obično početkom i krajem svakog dana, sve životinje se proveravaju na simptome morbiditeta i mortaliteta.

Najmanje jednom pre prvog izlaganja (kako bi se omogućilo poređenje kod istih ispitanika) i jednom nedeljno posle toga, potrebno je detaljno kliničko praćenje stanja svih životinja. Navedena opažanja, kad je to praktično, potrebno je obaviti izvan kaveza u kojem životinja inače boravi, najbolje u standardnom okruženju i svaki put u slično vreme. Neophodno je uložiti određeni napor kako bi se garantovalo da su odstupanja u uslovima posmatranja minimalna. Simptomi toksičnosti pažljivo se registruju, uključujući vreme njihovog nastupanja, stepen i trajanje. Opažanja treba da obuhvataju, ali ne i da budu ograničena na: promene na koži, krznu, očima, mukoznim membranama, nastanak sekrecija i izlučevina i autonomnu aktivnost (npr. suzenje, piloerekcija - podizanje dlake, veličina zenica, neobična respiratorna struktura). Potrebno je registrovati i promene u hodu, držanju i reakciji na manipulisanje, kao i postojanje kloničkih ili toničkih pokreta i šablona u ponašanju (npr. preterano negovanje spoljašnosti, ponovljeno kruženje) ili neobično ponašanje.

Oftalmološki pregled, korišćenjem oftalmoskopa ili odgovarajuće opreme, obavlja se pre davanja ispitivane supstance i posle završetka ispitivanja, najbolje kod svih životinja ili bar u grupama koje primaju visoku dozu i u kontrolnim grupama. Ukoliko se primete promene na očima, neophodan je pregled svih životinja.

1.5.5.1. Telesna masa i potrošnja hrane/vode

Sve životinje se mere najmanje jednom nedeljno. Merenje potrošnje hrane obavlja se najmanje jednom nedeljno. Ukoliko se ispitivana supstanca daje zajedno sa vodom za piće, meri se i potrošnja vode, i to najmanje na nedeljnom nivou. Potrošnja vode može da se uzme u obzir i u ispitivanjima koja se odnose na ishranu ili prisilno hranjenje tokom kojih može doći do promene u aktivnosti uzimanja tečnosti.

1.5.5.2. Hematologija i medicinska biohemija

Uzorke krvi potrebno je uzeti sa navedenog mesta i čuvati u odgovarajućim uslovima, u zavisnosti od konkretnog slučaja. Na kraju perioda ispitivanja uzorci se prikupljaju neposredno pre ili prilikom postupka žrtvovanja životinja.

Na početku ispitivanja, zatim u mesečnim intervalima ili na sredini ispitivanja i na kraju ispitivanja, obavezno je hematološko ispitivanje, uključujući, hematokrit, koncentraciju hemoglobina, broj eritrocita, ukupni i diferencijalni broj leukocita, broj trombocita i merenje potencijala zgrušavanja, poput vremena zgrušavanja, protrombinskog vremena ili tromboplastinskog vremena.

Određivanja iz područja medicinske biohemije s ciljem istraživanja značajnijih toksičnih efekata u tkivima, odnosno efekta na bubrege i jetru, potrebno je obaviti na uzorcima krvi dobijenim od svake životinje na početku, zatim u mesečnim intervalima ili na sredini ispitivanja i na kraju ispitivanja. Područja ispitivanja koja je potrebno uzeti u obzir obuhvataju ravnotežu elektrolita, metabolizam ugljenih hidrata i funkciju jetre i bubrega. Na izbor specifičnih ispitivanja utiču zapažanja o načinu delovanja ispitivane supstance. Preporučuje se gladovanje kod životinja pre uzimanja uzoraka krvi tokom vremenskog perioda koje odgovara pojedinoj životinjskoj vrsti. Preporučena određivanja obuhvataju utvrđivanje: nivoa kalcijuma, fosfora, hlorida, natrijuma, kalijuma, vrednosti glukoze na prazan želudac, alanin aminotransferaze, aspartat aminotransferaze, ornitin dekarboksilaze, gama glutamil transpeptidaze, azota iz uree, albumina, kreatinina u krvi i merenje ukupnog bilirubina i ukupnih proteina u serumu.

Analize mokraće potrebno je izvesti najmanje na početku, zatim na sredini i na kraju ispitivanja, prikupljanjem zapremine mokraće u odgovarajućem vremenskom periodu. Analiza mokraće obuhvata izgled, volumen, osmolalnost i specifičnu težinu, pH, proteine, glukozu i krv/krvne ćelije. Mogu se primeniti i dodatni parametri u slučajevima kad je potrebno proširiti ispitivanje primećenih efekata.

Potrebno je razmotriti i ispitivanja namenjena istraživanju serumskih markera opštih tkivnih oštećenja. Ostala opažanja koja mogu biti potrebna zbog donošenja odgovarajuće toksikološke ocene obuhvataju: analizu lipida, hormona, acido-bazne ravnoteže, methemoglobina i inhibicije holinesteraze.

Dopušteno je dodatno koristiti analize medicinske biohemije kada je potrebno proširiti ispitivanje zapaženih efekata. Navedene efekte je potrebno identifikovati kod hemikalija koje pripadaju određenim kategorijama opasnosti ili u zavisnosti od konkretnog slučaja.

Potreban je fleksibilan pristup, u zavisnosti od životinjske vrste i zapaženih odnosno očekivanih efekata ispitivane supstance.

1.5.5.3. Postmortalni pregled (makro-nekropsija)

Sve životinje obuhvaćene ispitivanjem podvrgavaju se detaljnom postmortalnom pregledu koji uključuje pažljiv pregled spoljnje površine tela, svih telesnih otvora i kranijalne, torakalne i abdominalne šupljine i njihovih sadržaja. Sa jetre sa žučnom kesicom, bubrega, nadbubrežne žlezde, testisa, epididimisa, ovarijuma, uterusa, štitne žlezde (sa paratiroidnim žlezdama), grudne žlezde, slezine, mozga i srca svake životinje (osim životinja koje su zatečene na umiranju i/ili su žrtvovane) potrebno je odstraniti sva pripadajuća tkiva, u zavisnosti od slučaja, izmeriti njihovu težinu u vlažnom stanju što je pre moguće posle disekcije kako bi se izbeglo isušivanje.

U medijumu fiksacije koji je najprikladniji s obzirom na vrstu tkiva i histopatološko ispitivanje koje sledi potrebno je sačuvati sledeća tkiva: sve makro lezije, mozak (reprezentativna područja, uključujući veliki mozak, mali mozak i medulu/most), kičmenu moždinu (na tri nivoa: cervikalnoj regiji, sredini torakalne regije i lumbalnoj regiji), hipofizu, oči, štitnu žlezdu, paratiroidnu žlezdu, grudnu žlezdu, jednjak, pljuvačne žlezde, želudac, tanko i debelo crevo (uključujući Peyerove ploče), jetra, žučnu kesu, pankreas, bubrege, nadbubrežne žlezde, slezinu, srce, dušnik i pluća, aortu, polne žlezde, uterus, pomoćne polne organe, ženske mlečne žlezde, prostatu, mokraćnu bešiku, limfne žlezde (najbolje jedna limfna žlezda koja pokriva put primene supstance i druga koja je udaljena od puta kojim se supstanca primenjuje kako bi se njome obuhvatili sistemski efekti), periferne živce (ishijatični ili tibijalni živac) najbolje u blizini mišića, uzorak koštane srži (i/ili sveži aspirat koštane srži) i kožu. Klinički i ostali nalazi mogu da ukažu na potrebu ispitivanja dodatnih tkiva. Potrebno je sačuvati i sve organe za koje postoji verovatnoća da su ciljni organi, a na osnovu poznatih svojstava ispitivane supstance.

1.5.5.4. Histopatologija

Potrebno je obaviti celovitu histopatologiju na sačuvanim organima i tkivima, bar svih životinja u kontrolnim grupama i grupama koje su primale visoke doze. Navedenim ispitivanjima obuhvataju se životinje svih ostalih grupa doziranja, a ukoliko kod grupe koja je primala visoku dozu budu primećene promene vezane za tretman.

Ispituju se sve makro-lezije.

Ako se koristi prateća grupa, histopatologija se obavlja na tkivima i organima za koja je zaključeno da se na njima pokazuju efekti u tretiranim grupama.

2. PODACI

Neophodno je navesti podatke koji se odnose na pojedinačne životinje. Podaci se navode tabelarno i prikazuju: broj životinja na početku ispitivanja u svakoj eksperimentalnoj grupi, broj životinja koje su pronađene mrtve tokom ispitivanja ili su žrtvovane iz humanih razloga, kao i vreme svake smrti ili humanog žrtvovanja, broj životinja kod kojih su se pojavili simptomi toksičnosti, opis zapaženih simptoma toksičnosti, uključujući vreme njihovog nastupanja, trajanje i ozbiljnost svakog toksičnog efekta, broj životinja kod kojih su se javile lezije, vrsta lezija i procenat životinja kod kojih se pojavila svaka pojedina vrsta lezija.

Kada je moguće, numerički rezultati se procenjuju pomoću odgovarajuće i opšteprihvaćene statističke metode. Statističke metode i podaci koji se analiziraju biraju se tokom osmišljavanja ispitivanja.

3. IZVEŠTAJ

Izveštaj o ispitivanju mora da sadrži podatke o:

1) Ispitivanoj supstanci:

- fizička svojstva, čistoća i fizička i hemijska svojstva;

- podaci za identifikaciju;

- vehikulum (ukoliko odgovara): razlozi za izbor vehikuluma, ukoliko nije reč o vodi.

2) Eksperimentalnoj životinjskoj vrsti:

- upotrebljena vrsta i soj;

- broj, starost i pol životinja;

- poreklo, uslovi smeštaja, ishrana, itd.;

- pojedinačna telesna masa životinja na početku ispitivanja.

3) Uslovima ispitivanja:

- logička osnova za izbor nivoa doze;

- detalji o pripremanju ispitivane supstance/pripremanju hrane, postignuta koncentracija, stabilnost i homogenost preparata;

- detalji o načinu primene ispitivane supstance na životinjama;

- stvarne doze (mg/kg TM/dnevno) i faktor preračunavanja koncentracije ispitivane supstance u hrani/vodi za piće (ppm) u stvarnu dozu, ukoliko je primenljivo na konkretan slučaj;

- detalji o kvalitetu hrane i vode.

4) Rezultatima:

- telesna masa i promene u telesnoj masi;

- potrošnja hrane i vode, ako je bitno;

- podaci o toksičnom efektu po polu i nivou doze, uključujući simptome toksičnosti;

- svojstva, tačnost i trajanje kliničkih posmatranja (bilo u slučaju reverzibilnih, bilo ireverzibilnih efekata);

- oftalmološki pregled;

- hematološka ispitivanja s relevantnim osnovnim vrednostima;

- medicinsko-biohemijska ispitivanja sa relevantnim osnovnim vrednostima;

- telesna masa po žrtvovanju, težine organa i odnosi težine organa/TM;

- obdukcioni nalazi;

- detaljan opis svih histopatoloških nalaza;

- podaci o apsorpciji ukoliko postoje;

- statistička obrada rezultata, kada odgovara.

5) Obrazloženju rezultata.

6) Zaključcima.

B.28. SUBHRONIČNA DERMALNA TOKSIČNOST - STUDIJA PONOVLJENIH DERMALNIH DOZA NA GLODARIMA, 90 DANA

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Videti Opšti uvod.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIP METODE

Ispitivana supstanca se svakodnevno i u progresivnim dozama nanosi na kožu nekoliko grupa eksperimentalnih životinja i to jedna doza po grupi tokom 90 dana. Tokom perioda primene životinje se svakodnevno posmatraju zbog uočavanja simptoma toksičnosti. Na životinjama koje uginu tokom ispitivanja obavlja se postmortalni pregled, dok se, po zaključenju ispitivanja, preživele životinje takođe žrtvuju i postmortalno pregledaju.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Nisu propisani.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Priprema

Životinje se drže u uslovima eksperimentalnog smeštaja i ishrane tokom najmanje pet dana pre ispitivanja. Pre ispitivanja, zdrave i mlade životinje se slučajnim izborom biraju i dodeljuju tretiranim i kontrolnim grupama. S leđnog dela trupa eksperimentalnih životinja neposredno pre ispitivanja ošiša se krzno. Moguće je brijanje, ali je potrebno obaviti ga oko 24 sata pre ispitivanja. Šišanje ili brijanje obično je potrebno ponoviti svake nedelje. Prilikom šišanja ili brijanja krzna ne treba oštetiti kožu. Za primenu supstance koja se ispituje potrebno je ukloniti krzno s najmanje 10% površine tela. Prilikom odlučivanja o veličini površine tela sa koje je potrebno ukloniti krzno i o dimenzijama prekrivanja supstancom koja se ispituje uzima se u obzir telesna masa životinje. Kad se ispituju čvrste supstance, koje se, ukoliko odgovara, mogu i pulverizovati, supstancu koja se ispituje potrebno je dovoljno navlažiti vodom ili, kada je neophodno, odgovarajućim vehikulumem, kako bi se obezbedio kvalitetan kontakt s kožom. Tečne supstance koje se ispituju obično se koriste nerazblažene. Primenjuje se režim svakodnevne primene tokom perioda od pet do sedam dana nedeljno.

1.6.2. Uslovi ispitivanja

1.6.2.1. Eksperimentalne životinje

Upotrebljavaju se odrasli pacovi, zečevi ili zamorci. Mogu se upotrebiti i ostale životinjske vrste, s tim da je potrebno da njihova primena bude opravdana. Prilikom započinjanja ispitivanja raspon odstupanja u telesnoj masi treba da bude ± 20% prosečne telesne mase. Kada se ispitivanje subhronične dermalne toksičnosti obavlja kao preliminarno, pre dugotrajnog ispitivanja, u oba ispitivanja treba upotrebiti životinje iste vrste i istog soja.

1.6.2.2. Broj i pol

Prilikom ispitivanja svakog nivoa doze treba upotrebiti najmanje 20 životinja (deset ženki i deset mužjaka) zdrave kože. Biraju se ženke koje nisu ranije rađale i koje nisu gravidne. Ukoliko se u međuvremenu planira žrtvovanje, broj je potrebno povećati za broj životinja čije se žrtvovanje planira pre zaključenja ispitivanja. Može da se uključi i prateća grupa od 20 životinja (10 po polu) kod kojih se primenjuje visok dozni nivo tokom 90 dana i prati prolaznost (reverzibilnost), postojanost ili odložena pojava toksičnih efekata tokom perioda od 28 dana po isteku perioda tretiranja.

1.6.2.3. Dozni nivoi

Upotrebljava se najmanje tri nivoa doze na kontrolnom uzorku i uzorku namenjenom kontroli vehikuluma, ukoliko se primenjuje vehikulum. Vreme izlaganja treba da bude najmanje šest sati dnevno. Eksperimentalna supstanca se primenjuje u isto vreme svakog dana, a količina supstance koja se primenjuje periodično se prilagođava (nedeljno ili dvonedeljno) s ciljem održavanja konstantnog nivoa doze s obzirom na telesnu masu životinje. Izuzev tretiranja ispitivanom supstancom, sa životinjama u kontrolnoj grupi postupa se na isti način kao s ispitanicima u eksperimentalnim grupama. Kada se zbog lakšeg doziranja koristi vehikulum, kontrolna grupa namenjena kontroli vehikuluma dozira se na isti način kao i tretirane grupe i prima količinu vehikuluma jednaku onoj koju prima grupa s najvišim nivoom doze. Najviši dozni nivo treba da dovede do toksičnih efekata, dok smrtnih posledica ne treba da bude ili njihov broj treba da bude zanemarljiv. Najniži dozni nivo ne sme da proizvede bilo kakve dokaze toksičnosti. U situacijama kad postoji primenljiva procena nivoa izloženosti ljudi ispitivanoj supstanci, najniži dozni nivo treba da premašuje navedeni nivo. U idealnom slučaju, srednji dozni nivo treba da dovede do minimalnih vidljivih toksičnih efekata. Ukoliko se koristi više od jedne srednje doze, dozni nivoi treba da budu raspoređeni na način koji za posledicu ima gradaciju toksičnih efekata. U nižim srednjim grupama, kao i u kontrolnim grupama, incidenca smrtnih posledica treba da bude niska, kako bi se omogućila pravilna procena rezultata.

Ukoliko primena supstance koja se ispituje za posledicu ima ozbiljnu iritaciju kože, potrebno je smanjiti koncentraciju, što može dovesti do smanjenja ili nejavljanja ostalih toksičnih efekata pri najvišem nivou doze. Ukoliko je koža teško oštećena može da bude neophodno da se prekine ispitivanje i da se organizuje novo ispitivanje uz korišćenje nižih koncentracija.

1.6.2.4. Ispitivanje granične doze

Ukoliko prilikom preliminarnog ispitivanja sa nivoom doze od 1.000 mg/kg ili višom dozom koja je povezana s mogućom izloženosti ljudi kada je ista poznata, ne nastanu nikakvi toksični efekti, dalje ispitivanje se možda neće smatrati neophodnim.

1.6.2.5. Period posmatranja

Eksperimentalne životinje se svakodnevno posmatraju da bi se uočili simptomi toksičnosti. Neophodno je zabeležiti vreme smrti i vreme u koje su se pojavili ili nestali simptomi toksičnosti.

1.6.3. Postupak

Životinje se pojedinačno smeštaju u kaveze. U idealnom slučaju životinje se ispitivanom supstancom tretiraju sedam dana nedeljno, tokom perioda od 90 dana.

Životinje u bilo kojoj pratećoj grupi, za koje je planirano naknadno posmatranje posle završetka ispitivanja, drže se bez tretmana narednih 28 dana kako bi se otkrio oporavak od ili postojanost toksičnih efekata. Vreme izlaganja treba da bude šest sati dnevno.

Ispitivana supstanca se ravnomerno nanosi na područje čija veličina iznosi oko 10% ukupne površine tela. Kad su u pitanju visoko toksične supstance, površinsko područje koje se prekriva može biti manje, ali je potrebno što više navedenog područja prekriti što tanjim i ravnomernijim slojem.

Tokom izlaganja ispitivana supstanca se održava u kontaktu s kožom pomoću poroznog zavoja od gaze i samolepive trake koja ne nadražuje kožu. Područje kože na kojem se ispitivanje obavlja treba, na odgovarajući način, da bude dodatno prekriveno, kako bi se sačuvao povoj i ispitivana supstanca i kako bi se obezbedilo da životinje ne mogu da progutaju ispitivanu supstancu. Dozvoljeno je delimično imobilisati životinje kako bi se sprečilo gutanje ispitivane supstance, ali se ne preporučuje potpuna imobilizacija.

Po isteku perioda izlaganja potrebno je, kad je moguće, ukloniti ostatke ispitivane supstance korišćenjem vode ili neke druge odgovarajuće metode čišćenja kože.

Sve životinje se svakodnevno prate i beleže se simptomi toksičnosti, uključujući vreme njihovog nastupanja, stepen i trajanje. Opažanja tokom boravka životinja u kavezima treba da obuhvataju: promene na koži i krznu, očima, mukoznim membranama, kao i praćenje respiratornog, cirkulatornog, autonomnog i centralnog nervnog sistema i somatomotorne aktivnosti i obrazaca ponašanja. Potrebno je meriti konzumiranje hrane i telesnu masu životinja na nedeljnom nivou. Neophodno je redovno posmatranje životinja kako bi se obezbedilo da ne dođe do gubitka životinja zbog kanibalizma, autolize tkiva ili pogrešnog smeštanja. Po završetku ispitivanja na svim preživelim ispitanicima u ne-pratećim tretiranim grupama obavlja se postmortalni pregled. Životinje na samrti potrebno je ukloniti i obdukovati.

Na svim životinjama, uključujući kontrolne, obično se obavljaju sledeća ispitivanja:

a) Oftalmološki pregled, korišćenjem oftalmoskopa ili podjednako pogodne opreme potrebno je obaviti pre izlaganja ispitivanoj supstanci i po završetku ispitivanja, najbolje kod svih životinja, ali bar u grupama koje primaju visoku dozu i kontrolnim grupama. Ukoliko se zapaze promene na očima, neophodan je pregled svih životinja.

b) Hematološka ispitivanja, koja uključuju hematokrit, koncentraciju hemoglobina, broj eritrocita, ukupni i diferencijalni broj leukocita i procenu potencijala zgrušavanja, kao što je vreme zgrušavanja, protrombinsko vreme ili tromboplastinsko vreme ili broja trombocita potrebno je obaviti na kraju perioda ispitivanja.

v) Određivanja u oblasti medicinske biohemije potrebno je obaviti na kraju perioda ispitivanja. Oblasti koje se smatraju odgovarajućim za sva ispitivanja obuhvataju ravnotežu elektrolita, metabolizam ugljenih hidrata i funkciju jetre i bubrega. Na izbor specifičnih ispitivanja utiču opažanja o načinu delovanja supstance. Predlaže se utvrđivanje nivoa kalcijuma, fosfora, hlorida, natrijuma, kalijuma, glukoze na prazan želudac (uz primenu perioda gladovanja koje je odgovarajuće za određenu životinjsku vrstu), serumske glutamat piruvat transaminazeXL, serumske glutamat oksaloacetat transaminazeXLI, ornitin dekarboksilaze, gama glutamil transpeptidaze, azota iz uree, albumina, kreatinina u krvi, ukupnog bilirubina i ukupnih proteina u serumu.

Ostali nalazi koji mogu biti potrebni zbog odgovarajuće toksikološke procene obuhvataju: analizu lipida, hormona, acidno-bazne ravnoteže, methemoglobina i aktivnosti holinesteraze. Može se primeniti dodatna medicinska biohemija kada je to potrebno zbog proširivanja istraživanja zapaženih efekata.

g) Pregled urina nije deo uobičajene prakse, nego se traži tek onda kada za to postoji indikacija na osnovu očekivane ili zapažene toksičnosti.

Ukoliko osnovni podaci prethodnih istraživanja ne odgovaraju, potrebno je razmotriti da li je neophodno da se pre početka doziranja utvrde parametri hematologije i kliničke biohemije.

____________
XL Sada poznat kao serumska alanin aminotransferaza.
XLI Sada poznat kao serumska aspartat aminotransferaza

1.6.3.1. Postmortalni pregled (makro-nekropsija)

Sve životinje obuhvaćene ispitivanjem podvrgavaju se detaljnom postmortalnom pregledu koji uključuje pregled spoljne površine tela, svih telesnih otvora i kranijalne, torakalne i abdominalne šupljine i njihovih sadržaja. Jetra, bubrezi, nadbubrežne žlezde i testisi moraju se izmeriti što je pre moguće posle disekcije kako bi se izbeglo isušivanje.

U odgovarajućem medijumu zbog mogućeg kasnijeg histopatološkog ispitivanja potrebno je sačuvati sledeće organe i tkiva: sve makro lezije, mozak-uključujući delove medule/ponsa, kore malog mozga i moždane kore, hipofizu, štitnu/štitastu žlezdu i tkivo grudne žlezde, (dušnik), pluća, srce, aortu, pljuvačne žlezde, jetru, slezinu, bubrege, nadbubrežne žlezde, pankreas, polne žlezde, uterus, pomoćne polne organe, žučnu kesu (ukoliko postoji), jednjak, želudac, duodenum, tanko crevo, slepo crevo, debelo crevo, mokraćnu bešiku, reprezentativni limfni čvor (ženska mlečna žlezda), (muskulaturu bedra), periferni živac, (oči), (grudnu kost s koštanom srži), (bedrenu kost - uključujući površinu zgloba), (kičmenu moždinu na tri nivoa-cervikalni, srednjetorakalni i lumbalni) i (eksorbitalne suzne žlezde). Tkiva navedena u zagradama pregledaju se samo ukoliko na to ukazuju simptomi toksičnosti ili ako su u pitanju ciljni organi.

1.6.3.2. Histopatološki pregled

a) Detaljnu histopatologiju neophodno je obaviti na normalnoj i tretiranoj koži i na organima i tkivima životinja u kontrolnim grupama i grupama koje su tretirane visokim dozama.

b) Neophodan je pregled svih makro-lezija.

v) Ciljni organi u grupama koje su primale ostale doze treba da budu pregledani.

g) Kada se koriste pacovi, pluća životinja u grupama tretiranim niskim i srednjim dozama treba da budu podvrgnuta histopatološkom pregledu zbog pronalaženja dokaza o infekciji, s obzirom da se time dolazi do pravilne ocene zdravstvenog stanja životinja. Može se desiti da se dalji histopatološki pregledi ne obavljaju rutinski na životinjama u navedenim grupama, ali se uvek sprovode na organima na kojima postoje dokazi lezija u visoko doziranoj grupi.

d) Ako se koristi prateća grupa, histopatologija se obavlja na tkivima i organima za koje je utvrđeno da se na njima pokazuju efekti u ostalim tretiranim grupama.

2. PODACI

Podaci se navode tabelarno i prikazuju: broj životinja na početku ispitivanja u svakoj eksperimentalnoj grupi, broj životinja kod kojih su se pojavile lezije, vrstu lezija i procenat životinja kod kojih se pojavila svaka pojedina vrsta lezija.

Rezultati se procenjuju pomoću odgovarajuće statističke metode i može se primeniti bilo koja priznata statistička metoda.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži podatke o:

- životinjskoj vrsti, soju, poreklu, uslovima okoline, ishrani;

- uslovima ispitivanja;

- nivoima doza (uključujući vehikulum ukoliko se koristi) i koncentracije;

- toksičnom efektu prema polu i dozi;

- nivou na kome nisu opaženi bilo kakvi efekti, kada je to moguće;

- vremenu smrti tokom ispitivanja ili podatke da li su životinje preživele do usmrćenja;

- opisu toksičnih i ostalih efekata;

- vremenu zapažanja svakog patološkog znaka i njegov kasniji tok;

- hrani i telesnoj masi;

- oftalmološkim nalazima;

- primenjenim hematološkim ispitivanjima i svim rezultatima;

- primenjenim ispitivanjima medicinske biohemije i svim rezultatima (uključujući rezultate svakog pregleda mokraće);

- nalazima obdukcije;

- detaljnom opisu svih histopatoloških nalaza;

- statističkoj obradi rezultata kada je moguće;

- obrazloženju rezultata;

- tumačenju rezultata.

3.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Videti Opšti uvod.

4. LITERATURA

Videti Opšti uvod.

B.29 SUBHRONIČNA INHALACIONA TOKSIČNOST - STUDIJA PONOVLJENIH INHALACIONIH DOZA NA GLODARIMA, 90 DANA

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Videti Opšti uvod.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIP METODE

Nekoliko grupa eksperimentalnih životinja izlaže se određeno vreme svakodnevno supstanci koja se ispituje u rastućim koncentracijama, pri čemu se na jednu grupu primenjuje jedna koncentracija u trajanju od 90 dana. Kada se koristi pomoćno sredstvo da bi se dobile odgovarajuće koncentracije ispitivane supstance u atmosferi, koristi se i kontrolna grupa. Za vreme primene, životinje se svakodnevno posmatraju zbog otkrivanja znakova toksičnosti. Životinje koje za vreme ispitivanja uginu postmortalno se pregledaju, a po završetku ispitivanja i preživele životinje se postmortalno pregledaju.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Nisu propisani.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Pripreme

Životinje se drže i hrane pod eksperimentalnim uslovima najmanje pet dana pre ispitivanja. Pre ispitivanja, zdrave mlade životinje se nasumce izdvajaju i dodeljuju grupama koje se tretiraju i kontrolnim grupama. Gde je potrebno, ispitivanoj supstanci može se dodati pomoćno sredstvo da bi se pripremile odgovarajuće koncentracije supstance u atmosferi. Ako se pomoćno sredstvo ili drugi dodaci koriste za olakšavanje doziranja mora biti poznato da ne proizvode toksične efekte. Ukoliko odgovara, mogu da se koriste podaci iz ranije studije.

1.6.2. Uslovi ispitivanja

1.6.2.1. Eksperimentalne životinje

Ukoliko ne postoje kontraindikacije, koriste se pacovi. Uzimaju se laboratorijske vrste mladih zdravih životinja koje se uobičajeno koriste. Na početku studije, raspon promena u telesnoj masi korišćenih životinja ne sme da prelazi ± 20% odgovarajuće srednje vrednosti. Ako se vodi studija subhronične inhalacije kao uvod u dugoročnu studiju, u obe studije koriste se iste vrste.

1.6.2.2. Broj i pol

Za svaku koncentraciju izlaganja koristi se najmanje 20 životinja (10 ženki i 10 mužjaka). Uzimaju se ženke koje nisu ranije rađale i koje nisu gravidne. Ako se planiraju žrtvovanja u toku eksperimenta, broj se mora povećati za broj životinja koje su planirane za žrtvovanje pre završetka studije. Prateća grupa od 20 životinja (10 životinja po polu) izlaže se u trajanju od deset dana visokoj koncentraciji i posmatra, kako bi se registrovala reverzibilnost, postojanost ili zakasnela pojava toksičnih efekata 28 dana po završetku tretmana.

1.6.2.3. Koncentracije

Ako se koristi pomoćno sredstvo, potrebne su najmanje tri koncentracije, s kontrolom ili kontrolom pomoćnog sredstva (koje odgovara koncentraciji pomoćnog sredstva na najvišem nivou). Osim tretmana eksperimentalnom supstancom, prema životinjama u kontrolnoj grupi mora se postupati na isti način kao s onima u eksperimentalnoj grupi. Najviše koncentracije treba da pokažu toksične efekte, ali ni jedan smrtni slučaj ili samo nekoliko smrtnih slučajeva. Ako postoji primenljiva procena izloženosti ljudi, najniži nivo primenjen na životinjama treba da premašuje tu vrednost. U idealnom slučaju, srednja koncentracija treba da proizvodi minimalno primetne toksične efekte. Ako se koristi više od jedne srednje koncentracije, njihove vrednosti treba da budu dovoljno različite da se postigne gradacija toksičnih efekata. U grupama kod kojih su primenjene niske ili srednje koncentracije, kao i kontrolnim grupama, učestalost smrtnih slučajeva kod životinja treba da bude niska, kako bi procena rezultata imala smisla.

1.6.2.4. Vreme izlaganja

Dnevno vreme izlaganja je šest sati posle izjednačavanja koncentracija u komorama, ali se mogu odrediti i drugi vremenski intervali kada postoje posebni zahtevi.

1.6.2.5. Oprema

Životinje se podvrgavaju ispitivanju u inhalacionoj opremi koja je dizajnirana tako da održava konstantni protok vazduha s najmanje 12 potpunih izmena u jednom satu, kako bi se obezbedila odgovarajuća koncentracija kiseonika i ravnomerno raspoređena atmosfera ekspozicije. Tamo gde se koristi komora, njen dizajn mora biti dovoljno prostran da minimalizuje prenaseljenost životinja i maksimalizuje njihovu izloženost ispitivanoj supstanci udisanjem. Kao opšte pravilo koje obezbeđuje stabilnost atmosfere u komori, koristi se mera, prema kojoj ukupna zapremina eksperimentalnih životinja ne sme da prelazi 5% zapremine komore. Mogu se koristiti različiti tipovi komora koji omogućavaju izloženost samo oro-nazalnih otvora, glave ili čitavog tela, pri čemu prve dve smanjuju preuzimanje ispitivane supstance drugim putevima.

1.6.2.6. Vreme posmatranja

Eksperimentalne životinje posmatraju se svakog dana tokom perioda tretiranja kao i za vreme oporavka kako bi se uočili znakovi toksičnosti. Važno je registrovati vreme kad se jave ili nestanu prvi znakovi trovanja, kao i vreme smrti.

1.6.3. Postupak

Životinje se izlažu ispitivanoj supstanci svakog dana, pet do sedam dana nedeljno, u periodu od 90 dana. Životinje iz pratećih grupa koje su predviđene za kasnija posmatranja, drže se još 20 dana bez tretmana, kako bi se utvrdila postojanost toksičnih efekata ili oporavak od istih. Temperatura na kojoj se obavlja ispitivanje mora se održavati na 22°C ± 3°C. U idealnim uslovima, relativna vlažnost treba da bude između 30% i 70%, ali u nekim slučajevima (npr. ispitivanja aerosola) to nije izvodljivo. Za vreme izlaganja, životinjama se ne daje voda i hrana.

Tokom eksperimenta koristi se dinamički inhalacioni sistem s odgovarajućim sistemom analitičke kontrole koncentracije. Kako bi se uspostavile odgovarajuće koncentracije preporučuje se obavljanje probnog ispitivanja. Treba podesiti protok vazduha tako da se obezbedi homogenost uslova u komori. Sistem mora da omogući da se stabilni uslovi izlaganja postižu što je moguće brže.

Obavljaju se merenja i prate sledeći parametri:

a) brzina protoka vazduha (neprekidno);

b) koncentracija ispitivane supstance merena u području udisanja. Za vreme izlaganja u toku jednog dana koncentracija ispitivane supstance ne sme da varira više od ± 15% od srednje vrednosti. Kod prašine i aerosola, možda nije moguće postići taj nivo kontrole pa se toleriše širi opseg vrednosti. Za vreme trajanja čitavog eksperimenta, koncentracije iz dana u dan moraju da se drže konstantnim koliko god je izvodljivo. Za vreme razvoja sistema vrše se analize veličina čestica da bi se utvrdila stabilnost koncentracija aerosola. Tokom izlaganja, analize se obavljaju u vremenskim intervalima u kojima je to neophodno za određivanje konzistencije raspodele veličina čestica;

v) temperatura i vlažnost;

g) za vreme i posle izlaganja, opažanja se sistematično registruju; za svaku životinju vodi se poseban zapisnik.

Životinje se posmatraju svakodnevno, a znakovi toksičnosti se evidentiraju, uključujući vreme njihovog prvog javljanja, stepen i trajanje. Registruju se promene na koži i krznu, očima, sluznicama, respiratornom, cirkulatornom, autonomnom i centralnom nervnom sistemu, kao i somatomotorna aktivnost i način ponašanja. Jednom nedeljno mere se telesna masa životinja i unos hrane. Potrebno je redovno pratiti životinje da bi se izbegao njihov gubitak zbog kanibalizma, autolize tkiva ili drugo. Na kraju perioda izlaganja obavlja se postmortalni pregled svih preživelih životinja. Životinje koje su na samrti izdvajaju se i postmortalno pregledaju, kad se primeti da su jako slabe.

Na svim životinjama, uključujući i one iz kontrolne grupe, obično se rade sledeća ispitivanja:

a) oftalmološki pregled uz korišćenje oftalmoskopa ili sličnog odgovarajućeg instrumenta vrši se pre izlaganja ispitivanoj supstanci i na kraju studije, obično na svim životinjama ili bar na onima koje su bile izložene visokoj dozi i životinjama u kontrolnim grupama. Ako se otkriju promene na očima, potrebno je pregledati sve životinje;

b) hematološke analize, uključujući hematokrit, koncentraciju hemoglobina, broj eritrocita, ukupan i diferencijalni broj leukocita i potencijal zgrušavanja krvi kao što je: vreme zgrušavanja, protrombinsko vreme, tromboplastinsko vreme ili broj trombocita, vrše se na kraju perioda ispitivanja;

v) medicinsko biohemijska određivanja u krvi obavljaju se na kraju perioda ispitivanja. Područja ispitivanja koja se smatraju važnim za sve studije su: ravnoteža elektrolita, metabolizam ugljenih hidrata, funkcija jetre i bubrega. Na izbor specifičnih ispitivanja utiču posmatranja mehanizma delovanja supstance. Predložena određivanja su: kalcijum, fosfor, hlorid, natrijum, kalijum, glukoza u uslovima gladovanja (s vremenom gladovanja koje je odgovarajuće za vrstu), serumska glutamat piruvat transaminazaXLII, serumska glutamat oksaloacetat transaminazaXLIII, ornitin deksarboksilaza, gama glutamil transpeptidaza, azot u ureji, albumin, kreatinin u krvi, ukupni bilirubin i merenja ukupnih proteina u serumu. Druga određivanja koja mogu da budu potrebna za adekvatnu toksikološku procenu obuhvataju: analize lipida, hormona, acidobaznu ravnotežu, methemoglobin i aktivnost holinesteraze. Dodatne biohemijske analize mogu se uključiti kada je potrebno proširiti ispitivanje posmatranih efekata;

g) analiza urina nije rutinski potrebna, samo ako postoji indikacija zasnovana na očekivanoj ili primećenoj toksičnosti.

Ako su osnovni podaci iz ranije studije nedovoljni, razmatra se određivanje hematoloških i medicinsko biohemijskih parametara pre početka doziranja.

______________
XLII Sada poznata kao serumska alanin aminotransferaza.
XLIII Sada poznata kao serumska aspartat aminotransferaza.

1.6.3.1. Postmortalni pregled

Sve životinje podvrgavaju se detaljnom postmortalnom pregledu koji obuhvata pregled spoljne površine tela, svih otvora, lobanjske, grudne i trbušne šupljine i njihovih sadržaja. Odmah posle sekcije, još mokri, mere se sledeći organi: jetra, bubrezi, žlezde i testisi. Merenje treba sprovesti što pre posle sekcije, da se organi ne bi osušili. U prikladnom medijumu za eventualni budući histopatološki pregled čuvaju se sledeći organi i tkiva: sve velike lezije, pluća - koja se moraju izvaditi intaktna, mere se i tretiraju odgovarajućim fiksativom kako bi se očuvale sve strukture organa (perfuzija s fiksativom smatra se efikasnom procedurom), nazofaringealno tkivo, mozak - uključujući delove moždine/pons, kore malog mozga (cerebelarni korteks) i moždane kore (cerebralni korteks), hipofizno, tiroidno/paratiroidni i bilo koje timusno tkivo, dušnik, pluća, srce, aorta, pljuvačne žlezde, jetra, slezina, bubrezi, nadbubrežne žlezde, gušterača, gonade, materica (pripadajući genitalni organi), (koža), žučna kesica (ako postoji), jednjak, želudac, dvanaestopalačno crevo, tanko crevo, slepo crevo, debelo crevo, rektum, mokraćna bešika, limfni čvorovi (ženske mlečne žlezde), (bedrena muskulatura), periferni živci, (oči), grudna kost sa koštanom srži (femur, uključujući zglobne površine) i (kičmena moždina u tri nivoa - cervikalni, srednjetorakalni i lumbalni). Tkiva navedena u zagradama pregledaju se samo ako postoje znaci toksičnosti ili ako se radi o ciljnom organu.

1.6.3.2. Histopatološka ispitivanja

a) Kompletna histopatološka posmatranja obavljaju se na respiratornom traktu i drugim organima i tkivima svih životinja u kontrolnim grupama i grupama koje su bile izložene visokim koncentracijama.

b) Sve velike lezije moraju se pregledati.

v) Moraju se pregledati ciljni organi u grupama koje su podvrgnute drugim koncentracijama.

g) Histopatološki treba pregledati i pluća životinja koje su podvrgnute niskim i srednjim koncentracijama, jer se na taj način može objektivno utvrditi zdravstveno stanje životinja. Dalji histopatološki pregledi rutinski se ne obavljaju na životinjama u tim grupama, ali se uvek obavljaju na organima na kojima su vidljive lezije u grupi podvrgnutoj visokoj koncentraciji.

d) Kad se koristi prateća grupa, histopatološki se obrađuju tkiva i organi koji pokazuju iste efekte kao i kod životinja iz drugih ispitanih grupa.

2. PODACI

Podaci se navode tabelarno, gde se za svaku ispitivanu grupu životinja navodi broj životinja na početku eksperimenta, broj životinja s lezijama, vrste lezija i procenat životinja kod kojih su pronađene lezije. Rezultati se procenjuju odgovarajućom statističkom metodom. Može se koristiti bilo koja usvojena statistička metoda.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ako je moguće, sadrži podatke o:

- vrsti, varijetetu, izvoru, uslovima okoline, ishrane;

- eksperimentalnim uslovima: opis aparature za izlaganje, uključujući dizajn, tip, dimenzije, izvor vazduha, sistem za raspršivanje aerosola, metoda kondicioniranja vazduha, obrada iskorišćenog vazduha i način čuvanja životinja u komori. Potrebno je opisati i aparaturu za merenje temperature, vlažnosti i kada odgovara, stabilnost koncentracija aerosola ili veličina čestica;

- izlaganju ispitivanoj supstanci koji se prikazuju tabelarno zajedno sa srednjim vrednostima i merom odstupanja (npr. standardna devijacija) i moraju da obuhvate:

a) brzinu protoka vazduha kroz inhalacionu opremu;

b) temperaturu i vlažnost vazduha;

v) nominalnu koncentraciju (ukupan sadržaj ispitivane supstance koja se uvodi kroz inhalacionu opremu, podeljena sa zapreminom vazduha);

g) prirodu pomoćnog sredstva, ako se koristilo;

d) tačne koncentracije supstance u zoni udisanja;

đ) srednje veličine čestica (kada je potrebno);

- toksičnim efektima po polu i koncentraciji;

- nivou bez efekta ako je moguće;

- vremenu smrti u toku eksperimenta ili da li su životinje preživele do kraja eksperimenta;

- opisu toksičnih ili drugih efekata;

- vremenu posmatranja bilo kakvih abnormalnosti i njihov kasniji tok;

- hranjenju i telesnoj masi;

- oftalmološkim nalazima;

- hematološkim ispitivanjima koja su primenjena i nalazima;

- medicinsko-biohemijskim ispitivanjima i nalazima (uključivši nalaze analize urina);

- nalazima obdukcije;

- detaljnom opisu svih histopatoloških nalaza;

- statističkoj obradi rezultata gde je moguće;

- obrazloženju rezultata;

- tumačenju rezultata.

3.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Videti Opšti uvod.

4. LITERATURA

Videti Opšti uvod.

B.30. ISPITIVANJE HRONIČNE TOKSIČNOSTI

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Videti Opšti uvod.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIP METODE

Ispitivana supstance se obično primenjuje sedam dana nedeljno, odgovarajućim putem, kod nekoliko grupa eksperimentalnih životinja, jedna doza po grupi, kroz duži period njihovog životnog veka. Za vreme i posle izloženosti ispitivanoj supstanci, eksperimentalne životinje se posmatraju svakodnevno, kako bi se otkrili znaci toksičnosti.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Nisu propisani.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Pripreme

Životinje se drže pod eksperimentalnim uslovima čuvanja i hranjenja najmanje pet dana pre ispitivanja. Pre ispitivanja slučajnim izborom zdrave mlade životinje se svrstavaju u tretirane i kontrolne grupe.

1.6.2. Uslovi ispitivanja

1.6.2.1. Eksperimentalne životinje

Preporučena vrsta je pacov. Mogu se koristiti i druge vrste (glodara ili drugih životinja), na osnovu rezultata prethodnih studija. Ispitivanju se podvrgavaju zdravi mladi primerci životinja onih laboratorijskih vrsta koje se najčešće koriste u ovakvim eksperimentima, a primena doze započinje u što kraćem vremenskom roku posle odbijanja od sise.

Na početku studije varijacije u telesnoj masi korišćenih životinja ne smeju prelaziti ± 20% srednje vrednosti. Ako se izvodi subhronična oralna studija kao uvod u dugoročnu studiju, u obe studije koriste se iste vrste i varijeteti.

1.6.2.2. Broj i pol

Za svaki dozni nivo i istovremenu kontrolnu grupu koristi se najmanje 40 životinja (20 ženki i 20 mužjaka). Uzimaju se ženke koje nikad nisu rađale i koje nisu gravidne. Ako se planiraju žrtvovanja u toku eksperimenta, broj se mora povećati za broj životinja koje su planirane za žrtvovanje pre završetka studije.

Za vrste koje ne pripadaju glodarima prihvatljiv je manji broj životinja, ali najmanje četiri životinje po polu po grupi.

1.6.2.3. Dozni nivoi i učestalost izlaganja

Koriste se najmanje tri nivoa doze ispitivane supstance zajedno s istovremenom kontrolnom grupom. Najviša doza treba da pokaže toksične efekte, ali bez velikog broja smrtnih slučajeva. Najniža doza ne sme da izazove i pokaže toksičnost.

Srednja doza utvrđuje se u rasponu između visokih i niskih doza.

Kod izbora nivoa doza moraju se uzeti u obzir podaci iz prethodnih ispitivanja i studija toksičnosti.

Životinje se obično svakodnevno izlažu ispitivanoj supstanci. Ako se hemikalija daje u vodi za piće ili se umeša u hranu, mora uvek biti na raspolaganju.

1.6.2.4. Kontrole

Istovremeno se koristi kontrolna grupa koje je u svakom pogledu identična eksperimentalnim grupama, osim izloženosti ispitivanoj supstanci.

U posebnim okolnostima, kao što su inhalacione studije koje obuhvataju aerosole ili korišćenje emulgatora čija biološka aktivnost nije okarakterisana u oralnim studijama, istovremeno se koristi i negativna kontrolna grupa. Negativna kontrolna grupa tretira se na isti način kao i eksperimentalne grupe, samo što se životinje ne izlažu ispitivanoj supstanci niti bilo kom pomoćnom sredstvu.

1.6.2.5. Put primene

Dva glavna puta primene su oralni i inhalacioni. Izbor puta primene zavisi od fizičkih i hemijskih karakteristika ispitivane supstance i od mogućeg puta unosa kod ljudi.

Korišćenje dermalnog puta predstavlja značajan praktični problem. O hroničnoj sistemskoj toksičnosti koja proizlazi iz perkutane apsorpcije može se izvesti zaključak iz rezultata drugog oralnog ispitivanja i znanja o stepenu perkutane apsorpcije dobijenom iz prethodnih ispitivanja perkutane toksičnosti.

1.6.2.6. Studije sa peroralnim putem primene

Kad se ispitivana supstanca apsorbuje iz gastrointestinalnog trakta i ako je to put unosa kojim mogu biti izloženi ljudi, predlaže se peroralni put primene, osim ako postoje kontraindikacije.

Životinje mogu da dobijaju ispitivanu supstancu u hrani, rastvorenu u vodi za piće ili im se može davati u kapsulama.

Idealno je dnevno doziranje tokom sedam dana nedeljno, jer primena određene doze na bazi pet dana nedeljno može da omogući oporavak ili povlačenje toksičnosti u periodu u kojem se ne primenjuje ispitivana supstanca i time da utiče na rezultat i kasniju procenu. Sa stanovišta prakse, doziranje na bazi pet dana nedeljno smatra se prihvatljivim.

1.6.2.7. Studije sa inhalacionim putem primene

Kako studije sa inhalacionim putem primene predstavljaju tehnički problem koji je složeniji od drugih puteva primene, ovde se detaljnije navodi taj način primene. Mora se napomenuti da intratrahealno ulivanje može biti dobra alternativa u specifičnim situacijama.

Dugoročno izlaganje obično se planira prema projektovanoj izloženosti ljudi. Životinje se dnevno izlažu šest sati posle izjednačenja koncentracija u komori, pet dana u nedelji (isprekidana izloženost) ili, pogodnoj ambijentalnoj izloženosti, 22 do 24 sata izloženosti dnevno tokom sedam dana nedeljno (neprekidna izloženost) sa jednim satom za hranjenje životinja u slično vreme svakog dana i za održavanje komore. U oba slučaja životinje se izlažu fiksnim koncentracijama ispitivane supstance. Najveća razlika između isprekidane i neprekidne izloženosti je što u prvom slučaju postoji period od 17 do 18 sati tokom koga se životinje mogu oporaviti od efekata svakodnevne izloženosti, sa čak i dužim vremenom oporavka tokom vikenda.

Izbor isprekidane ili neprekidne izloženosti zavisi od ciljeva studije i od izloženosti ljudi koja će se simulirati. Moraju se razmotriti određene tehničke teškoće. Na primer, prednosti neprekidne izloženosti koja simulira uslove životne sredine mogu se poništiti potrebom davanja vode i hranjenja za vreme izloženosti i potrebom za složenijim (i pouzdanim) tehnikama za stvaranje i posmatranje aerosola i pare.

1.6.2.8. Komore za izlaganje

Životinje se podvrgavaju ispitivanju u inhalacionim komorama dizajniranim tako da održavaju dinamičan protok vazduha s najmanje 12 izmena vazduha u jednom satu, kako bi se osigurala odgovarajuća koncentracija kiseonika i ravnomerno raspoređena atmosfera. Kontrolne komore i komore za izlaganje moraju biti jednake u konstrukciji i dizajnirane tako da obezbeđuju uslove izlaganja koji su uporedivi u svim pogledima, izuzev izloženosti ispitivanoj supstanci. Slabi negativni pritisak u komori se uglavnom održava za sprečavanje ispuštanja ispitivane supstance u okolno područje. Komore moraju minimizovati prenaseljenost eksperimentalnih životinja. Kao opšte pravilo koje obezbeđuje stabilnost atmosfere u komori, koristi se mera prema kojoj zapremina eksperimentalnih životinja ne sme prelaziti 5% zapremine komore.

Moraju se obavljati merenja i pratiti sledeći parametri:

a) Protok vazduha: preporučuje se da se brzina protoka vazduha prati neprekidno;

b) Koncentracija: u periodu dnevnog izlaganja koncentracija ispitivane supstance ne sme da varira više od ± 15% od srednje vrednosti;

v) Temperatura i vlaga: za glodare se temperatura mora održavati na 22°C ± 2°C, a vlaga u komori na 30% do 70%, osim ako se koristi voda za suspendovanje ispitivane supstance u atmosferu komore. Preporučuje se da se temperatura i vlaga prate neprekidno;

g) Merenja veličine čestica: raspodela veličine čestica određuje se u atmosferi komore koje sadrže tečne ili čvrste aerosole. Čestice aerosola moraju biti takve veličine da ih eksperimentalne životinje mogu udisati. Uzorci vazduha komore uzimaju se u zoni disanja životinja. Uzorak vazduha mora biti tipičan predstavnik raspodele čestica kojima su životinje izložene i mora da obuhvata, na gravimetrijskoj bazi, sav suspendovani aerosol, čak i ako se mnogo aerosola ne može udisati. Za vreme razvoja generišućeg sistema često moraju da se obavljaju analize veličine čestica da bi se obezbedila stabilnost aerosola, a posle toga se analize veličine čestice obavljaju onoliko često koliko zahteva vreme izlaganja, da bi se pravilno odredila konzistencija raspodele čestica kojima su životinje bile izložene.

1.6.2.9. Trajanje ispitivanja

Period davanja treba da bude najmanje 12 meseci.

1.6.3. Postupak

1.6.3.1. Posmatranja

Pažljivo kliničko ispitivanje mora da se obavlja najmanje jednom dnevno. Dodatna posmatranja obavljaju se svakodnevno uz preduzimanje odgovarajućih mera kako bi se gubitak životinja za vreme izvođenja studije sveo na minimum, na primer postmortalni pregled ili zaleđavanje onih životinja koje se pronađu mrtve i izolacija ili žrtvovanje slabih životinja ili životinja na samrti. Obavljaju se pažljiva posmatranja da bi se otkrio početak i napredovanje toksičnih efekata, kao i da bi se sveo na minimum gubitak zbog bolesti, autolize ili kanibalizma.

Klinički znaci, uključujući neurološke promene i promene na očima, beleže se za sve životinje. Beleže se i vreme početka i napredovanje toksičnih efekata, uključujući sumnjive tumore.

Telesne mase beleže se pojedinačno za sve životinje jednom nedeljno u prvih 13 nedelja perioda ispitivanja, a posle toga najmanje jednom svake četiri nedelje. Uzimanje hrane određuje se nedeljno za vreme prvih 13 nedelja studije, a potom u intervalima od oko tri meseca, osim ako zdravstveno stanje ili promene u telesnoj masi ne diktiraju drugačije.

1.6.3.2. Hematološki pregled

Hematološki pregled (npr. sadržaj hemoglobina; ukupna zapremina krvnih ćelija; ukupan broj eritrocita, ukupan broj leukocita, trombocita ili merenja drugih parametara koagulacije) obavlja se posle tri meseca, posle šest meseci, a posle toga u intervalima od oko šest meseci i po završetku ispitivanja iz uzoraka krvi svih životinja koje nisu glodari i uzoraka krvi 10 pacova po polu svih grupa. Ako je moguće, uzorci treba da budu od istih pacova u svakom intervalu. Uzimaju se i uzorci od životinja koje nisu glodari.

Ako klinička posmatranja daju nagoveštaj pogoršanja zdravlja životinja za vreme studije, od životinja kod kojih se naslućuje pogoršanje zdravlja, uzimaju se uzorci krvi i radi se diferencijalna krvna slika.

Diferencijalna krvna slika radi se kod životinja iz grupe koja je podvrgnuta najvišoj dozi i kod kontrolne grupe. Diferencijalna krvna slika radi se kod životinja koje su podvrgnute nešto manjoj dozi samo ako postoji velika razlika između grupe sa najvišom dozom i kontrolne grupe ili ako je indikovana na osnovu patoloških nalaza.

1.6.3.3. Analiza mokraće

Za analizu se uzimaju uzorci mokraće od životinja koje nisu glodari i od 10 pacova po polu, ako je moguće od istih pacova u jednakim intervalima u kojima se obavljaju i hematološke analize. Kod pojedinačnih životinja ili na zbirnim ("pool") uzorcima po polu i po grupi za glodare određuju se:

- izgled: zapremina i gustina za pojedinačne životinje;

- proteini, glukoza, ketoni, skriveno krvarenje (semikvantitativno);

- mikroskopski pregled sedimenta (semikvantitativno);

- medicinska biohemija.

U intervalima od oko šest meseci i na kraju ispitivanja, uzimaju se uzorci krvi za medicinsko-biohemijska merenja od svih životinja koje nisu glodari i 10 pacova po polu svih grupa, po mogućnosti od istih pacova u svakom intervalu. Uzorci za preliminarna ispitivanja uzimaju se od životinja koje nisu glodari. U plazmi tih uzoraka određuju se:

- koncentracija ukupnih proteina;

- koncentracija albumina;

- ispitivanja funkcije jetre (kao što je aktivnost alkalne fosfataze, glutaminske piruvat transaminazeXLIV, aktivnost glutaminske oksaloacetatne transaminazeXLV), gama glutamil transpeptidaze, ornitin dekarboksilaze;

- metabolizam ugljenih hidrata, kao što je glukoza u krvi posle gladovanja;

- ispitivanja funkcije bubrega kao što je azot iz uree u krvi.

______________
XLIV Sada poznata kao serumska alanin aminotransferaza.
XLV Sada poznata kao serumska aspartat amintransferaza.

1.6.3.4. Postmortalni pregled

Postmortalni pregled se obavlja na svim životinjama, uključujući one koje su uginule za vreme eksperimenta ili su žrtvovane jer su bile na samrti. Pre žrtvovanja od svih životinja uzimaju se uzorci krvi za diferencijalnu krvnu sliku. Čuvaju se sve vidljive lezije, tumori ili lezije za koje se sumnja da su tumori. Treba pokušati da se dovede u vezu opažene promene s mikroskopskim nalazima.

Svi organi i tkiva čuvaju se za histopatološke preglede. Ovo se obično odnosi na sledeće organe i tkiva: mozakXLVI (medula i pons, cerebelarni korteks, cerebralni korteks), hipofiza, štitna žlezda (uključujući paratioroidnu žlezdu), timus, pluća (uključujući traheju), srce, aorta, pljuvačne žlezde, jetraIX, slezina, bubreziIX, nadbubrežne žlezdeIX, jednjak, želudac, duodenum, tanko crevo, slepo crevo, debelo crevo, rektum, materica, mokraćna bešika, limfni čvorovi, pankreas, polne žlezdeIX, ostali genitalni organi, kod ženki mlečne žlezde, koža, muskulatura, periferni živci, kičmena moždina (cervikalna, torakalna, lumbalna), grudna kost s koštanom srži (uključujući zglobove) i oči. Za odgovarajući histopatološki pregled važno je naduvavanje pluća i mokraćne bešike sa fiksativom na optimalan način da se sačuvaju ta tkiva, kao i naduvavanje pluća kod inhalacionih studija. U posebnim studijama, kao što su inhalacione studije, pregleda se celokupan respiratorni trakt, uključujući nos, ždrelo i grkljan.

Ako su obavljeni drugi klinički pregledi, dobijeni rezultati moraju biti na raspolaganju pre mikroskopskog pregleda, jer to može biti smernica za patologa.

_____________
XLVI Mere se organi od deset životinja po polu po grupi za glodare i životinje koje nisu glodari, plus tiroidna žlezda (s paratiroidnim žlezdama) za životinje koje nisu glodari.

1.6.3.5. Histopatologija

Sve vidljive promene, naročito tumori i druge lezije nastale u bilo kom organu, moraju da se mikroskopski pregledaju. Preporučuju se sledeći postupci:

a) Mikroskopski pregled svih sačuvanih organa i tkiva s kompletnim opisom svih lezija nađenih:

1) kod svih životinja koje su uginule ili su žrtvovane za vreme studije;

2) u svim grupama koje su dobijale visoku dozu i u kontrolnoj grupi;

b) Organi ili tkiva kod kojih su pronađene abnormalnosti uzrokovane ili verovatno uzrokovane ispitivanom supstancom ispituju se i kod životinja iz grupa sa nižom dozom;

v) Ako rezultat ispitivanja dokaže bitno skraćenje normalnog životnog veka životinje ili efekte koji mogu da utiču na toksičnu reakciju, naredni niži dozni nivo ispituje se na način koji je gore opisan;

g) Za ispravnu procenu značaja promena koje su primećene kod tretiranih životinja neophodni su podaci o nastanku lezija do kojih obično dolazi kod vrste životinja koje se koriste, pod istim laboratorijskim uslovima, tj. istorijski kontrolni podaci.

2. PODACI

Podaci se navode tabelarno, gde se za svaku ispitivanu grupu životinja navodi broj životinja na početku eksperimenta, broj životinja sa lezijama i procenat životinja sa svakom vrstom lezije. Svi dobijeni rezultati analiziraju se odgovarajućom statističkom metodom. Može se koristiti bilo koja usvojena statistička metoda.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ako je moguće, sadrži podatke o:

- vrsti, varijetetu, izvoru, uslovima sredine, ishrane;

- eksperimentalnim uslovima: aparaturi za izlaganje ispitivanoj supstanci uključujući dizajn, vrstu, dimenzije aparature, kao i izvor vazduha, sistem za proizvodnju čestica i aerosola, metoda za kondicioniranje vazduha, obrada iskorišćenog vazduha i metoda čuvanja životinja u komori. Treba opisati opremu za merenje temperature, vlage i, gde je moguće, stabilnost koncentracije aerosola ili veličinu čestice;

- izlaganju ispitivanoj supstanci: ovi podaci se prikazuju tabelarno sa srednjim vrednostima i merama varijabilnosti (npr. standardna devijacija) i obuhvataju podatke o:

a) brzini protoka vazduha kroz opremu za inhalaciju;

b) temperaturi i vlažnosti vazduha;

v) nominalnoj koncentraciji (ukupnom sadržaju ispitivane supstance koja se uvodi u opremu za inhalaciju, podeljenim sa zapreminom vazduha);

g) prirodi pomoćnog sredstva, ako je korišćen;

d) stvarnim koncentracijama supstance u zoni udisanja;

đ) srednjoj veličini čestica (gde je potrebno),

- visini doze (uključujući i pomoćno sredstvo, ako se koristilo) i koncentracije;

- toksičnoj reakciji po polu i dozi;

- nivou bez efekta;

- vremenu smrti za vreme studije ili da li su životinje preživele do kraja eksperimenta;

- opis toksičnih i drugih efekata;

- vremenu kada je primećen svaki znak abnormalnosti i njegov kasniji tok;

- hrani i telesnoj masi;

- oftalmološkim nalazima;

- hematološkim ispitivanja i svim rezultatima;

- medicinsko biohemijskim ispitivanjima i svim rezultatima (uključujući rezultate analize urina);

- nalazima obdukcije;

- detaljan opis svih histopatoloških nalaza;

- statističkoj proceni rezultata, gde je moguće;

- obrazloženju rezultata;

- tumačenju rezultata.

3.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Videti Opšti uvod.

4. LITERATURA

Videti Opšti uvod.

B.31. ISPITIVANJE TOKSIČNOSTI PO PRENATALNI RAST I RAZVOJ

1. METODA ISPITIVANJA

Ova metoda potpuno odgovara metodi OECD: TG 414 (2001).

1.1. UVOD

Ova metoda za ispitivanje toksičnosti po rast i razvoj namenjena je za dobijanje opštih podataka o efektima prenatalnog izlaganja na gravidne eksperimentalne životinje i na organizam tokom rasta i razvoja u materici. Ovo može da obuhvati procenu efekata na majku, kao i smrt, strukturalne abnormalnosti ili izmenjen rast ploda. Funkcionalni nedostaci, iako čine važan deo rasta i razvoja, nisu sastavni deo ove metode ispitivanja. Oni se mogu ispitivati u posebnoj studiji ili kao dodatak ovaj studiji, korišćenjem metode ispitivanja neurotoksičnosti po rast i razvoj. Podatke o ispitivanju funkcionalnih nedostataka i drugih efekata posle rođenja, treba potražiti u odgovarajućem ispitivanju reproduktivne toksičnosti na dve generacije i ispitivanju neurotoksičnosti po rast i razvoj.

Ova metoda ispitivanja može zahtevati specifično prilagođavanje u pojedinačnim slučajevima na osnovu specifičnog znanja o npr. fizičkim i hemijskim ili toksikološkim svojstvima ispitivane supstance. Takvo prilagođavanje je prihvatljivo ako uverljivi naučni dokazi pokazuju da će se prilagođavanjem dobiti bolji kvalitet podataka. U takvom slučaju, ovi naučni dokazi moraju biti pažljivo dokumentovani u izveštaju o ispitivanju.

1.2. DEFINICIJE

Toksikologija rasta i razvoja jeste studija o štetnim efektima na organizam tokom rasta i razvoja koji se mogu pojaviti kao posledica izlaganja pre začeća, tokom prenatalnog rasta i razvoja ili postnatalno do vremena polnog sazrevanja. Najveće manifestacije toksičnosti po rast i razvoj obuhvataju: 1) smrt organizma, 2) strukturalne abnormalnosti, 3) izmenjeni rast, 4) funkcionalne nedostatke. Toksikologija rasta i razvoja se ranije često nazivala teratologija.

Štetni efekat jeste svaka promena polaznog stanja povezana sa tretmanom koja umanjuje sposobnost organizma da preživi, reprodukuje se ili prilagodi životnoj sredini. U najširem smislu, toksikologija rasta i razvoja obuhvata svaki efekat koji remeti normalan razvoj zametka i pre i posle rođenja.

Izmenjen rast jeste promena mase ili veličine organa ili organizma potomaka.

Alteracije (anomalije) jesu strukturne promene u rastu i razvoju koje obuhvataju i malformacije i varijacije28.

Malformacija/veća abnormalnost jeste strukturna promena koja se smatra štetnom za životinju (može biti i smrtonosna) i obično je retka.

Varijacija/manja abnormalnost jeste strukturna promena za koju se smatra da ima mali ili nikakav štetan efekt na životinju; može biti prolazna i može se pojaviti relativno često u kontrolnoj populaciji.

Zametak jeste zbir derivata oplođenog jajašca u bilo kojoj fazi rasta i razvoja od oplodnje do rođenja, uključujući ekstraembrionalne membrane, kao i embrion ili plod.

Implantacija (nidacija) jeste pripajanje blastocista na epitelni sloj materice, uključujući njegovu penetraciju kroz epitel materice i usađivanje u endometrijum.

Embrion jeste rana ili razvojna faza bilo kog organizma, naročito proizvoda oplođenja jajašca koji se razvija posle pojave dugačke ose i do pojave svih većih struktura.

Embriotoksičnost jeste štetnost za normalnu strukturu, razvoj, rast i/ili sposobnost preživljavanja embriona.

Plod jeste nerođeni potomak u periodu posle embrionalnog.

Fetotoksičnost jeste štetnost za normalnu strukturu, razvoj, rast i/ili sposobnost preživljavanja ploda.

Pobačaj jeste prevremeno izbacivanje proizvoda začeća iz materice: embriona ili ploda koji nije sposoban za preživljavanje.

Resorpcija jeste zametak koji, posle implantacije u matericu, kasnije umre i resorbuje se ili je resorbovan.

Rana resorpcija jeste dokaz o implantaciji bez prepoznatljivog embriona/ploda.

Kasna resorpcija jeste mrtvi embrion ili plod sa spoljnjim degenerativnim promenama.

NOAEL jeste skraćenica za najviši nivo doze ili izlaganja, kod koga nisu primećeni štetni efekti povezani sa tretmanom.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIP METODE

Obično se ispitivana supstanca daje gravidnim životinjama najmanje od implantacije do jednog dana pre dana planiranog žrtvovanja, koji mora biti što bliži normalnom danu porođaja bez opasnosti od gubitka podataka koji proizlaze iz preranog porođaja. Eksperimentalna metoda nije namenjena samo za ispitivanje perioda organogeneze (tj. 5-15 dana kod glodara i 6-18 dana kod kunića), nego i za ispitivanje efekata od preimplantacije, ako odgovara, tokom čitavog perioda gestacije do dana pre carskog reza. Malo pre carskog reza ženke se žrtvuju, pregleda se sadržaj materice, a plodovi se procenjuju prema spoljnim vidljivim anomalijama, kao i prema promenama na mekim tkivima i kosturu.

1.5. OPIS METODE

1.5.1. Izbor životinjske vrste

Preporučuje se da se ispitivanje obavlja na najrelevantnijim vrstama i da se koriste laboratorijske vrste i varijeteti koji se obično koriste kod ispitivanja toksičnosti po prenatalni rast i razvoj. Preporučena vrsta glodara je pacov, a preporučena vrsta koja ne pripada glodarima je kunić. Kada se koriste životinje drugih vrsta treba navesti razlog za ovo korišćenje.

1.5.2. Uslovi smeštaja i ishrana

Temperatura eksperimentalne sobe gde se drže životinje treba da bude 22°C (± 3°C) za glodare, a 18°C (± 3°C) za kuniće. Relativna vlažnost vazduha treba da iznosi najmanje 30% ali ne više od 70% osim kad se prostorije čiste. Najbolje je održavati vlažnost vazduha između 50% i 60%. Osvetljenje treba da bude veštačko i to u intervalima 12 sati svetla i 12 sati mraka. Za hranjenje se mogu primenjivati ustaljene laboratorijske dijete sa neograničenim količinama vode za piće. Postupak parenja treba izvoditi u kavezima koji su odgovarajući za tu svrhu. Parene životinje preporučljivo je držati pojedinačno u kavezu, ali je prihvatljivo i čuvanje u malim grupama.

1.5.3. Priprema životinja

Koriste se zdrave životinje koje su se tokom najmanje pet dana privikle na laboratorijske uslove i koje ranije nisu bile podvrgnute eksperimentalnim postupcima. Eksperimentalne životinje se označavaju prema vrsti, varijetetu, izvoru, polu, telesnoj masi i/ili starosti. Životinje svih eksperimentalnih grupa treba da budu jednake telesne mase i starosti, koliko god je izvodljivo. Za svaki dozni nivo koriste se mlade odrasle ženke koje nisu ranije rađale. Ženke se pare s mužjacima iste vrste i varijeteta, a parenje između brata i sestre treba izbegavati. Za glodare je nulti dan gestacije dan kad se opazi vaginalni čep i/ili sperma. Za kuniće je nulti dan obično dan koitusa ili veštačke oplodnje, ukoliko se koristi ova tehnika. Parene ženke dodeljuju se slučajnim izborom kontrolnim grupama ili grupama koje se tretiraju. Kavezi moraju biti postavljeni tako da se pojava mogućih efekata zbog položaja kaveza svede na minimum. Svakoj životinji se dodeljuje jedinstveni identifikacioni broj. Parene ženke se slučajnim izborom dodeljuju kontrolnim grupama ili grupama koje se tretiraju, a ako su se ženke parile u gomili, životinje iz svake gomile podjednako se raspodeljuju po grupama. Ženke koje je oplodio isti mužjak se raspodeljuju po grupama.

1.6. POSTUPAK

1.6.1. Broj i pol životinja

Svaka tretirana i kontrolna grupa mora da sadrži dovoljan broj ženki, tako da se na postmortalnom pregledu nađe oko 20 ženki sa implantima. Grupe sa manje od 16 životinja sa implantima mogu da budu neodgovarajuće. Studija se ne odbacuje obavezno zbog mortaliteta majki, ako se obezbedi da mortalitet ne prelazi približno 10%.

1.6.2. Priprema doza

Ako se za lakše doziranje koristi pomoćno sredstvo ili drugi aditiv, moraju se uzeti u obzir sledeće karakteristike: efekti na apsorpciju, raspodelu, metabolizam i zadržavanje ili izlučivanje ispitivane supstance; efekti na hemijska svojstva ispitivane supstance koja mogu izmeniti njene toksikološke karakteristike; efekti na potrošnju hrane ili vode ili ishranjenost životinja. Pomoćno sredstvo ne sme da bude toksično po rast i razvoj, niti sme da ima efekte na reprodukciju.

1.6.3. Doziranje

Obično se ispitivana supstanca daje svakodnevno od implantacije (npr. peti dan posle parenja) do dana pre planiranog carskog reza. Ako preliminarne studije, kada su dostupne, ne upućuju na visoku opasnost od preimplantacionog gubitka, tretman se može produžiti toliko da obuhvati čitav period gestacije, od parenja do dana pre planiranog žrtvovanja. Dobro je poznato da neodgovarajuća manipulacija ili stres tokom trudnoće mogu da uzrokuju prenatalni gubitak. Radi čuvanja od prenatalnog gubitka zbog faktora koji nisu u vezi sa tretmanom, treba izbegavati nepotrebnu manipulaciju skotnim životinjama, kao i stres zbog spoljašnjih faktora kao što je buka.

Koriste se najmanje tri nivoa doze i istovremena kontrola. Zdrave životinje dodeljuju se kontrolnim grupama i grupama koje se tretiraju slučajnim izborom. Dozni nivoi treba dovoljno da se razlikuju kako bi proizvele gradaciju toksičnih efekta. Osim ako ne postoji ograničenje zbog fizičke/hemijske prirode ili bioloških svojstava ispitivane supstance, najviša doza se određuje s ciljem da izazove određenu toksičnost po rast i razvoj i/ili po majku (klinički znaci ili smanjenje telesne mase), ali ne smrt ili tešku patnju. Najmanje jedan srednji dozni nivo treba da proizvede minimalne primetne toksične efekte. Najniži dozni nivo ne sme da izazove nikakav dokaz toksičnosti niti po majku niti po rast i razvoj. Opadajući niz nivoa doza mora da se izbere u cilju dokazivanja neke reakcije koja je zavisna od doziranja i nivoa pri kome nije opažen štetni efekat (NOAEL). Za određivanje opadajućih nivoa doza obično su optimalni dvostruki do četvorostruki intervali, a često se preporučuje četvrta eksperimentalna grupa umesto primene vrlo velikih intervala između doza (npr. više od faktora 10). Iako je cilj utvrđivanje NOAEL-a majke, mogu se prihvatiti i studije koje ne utvrđuju ovaj nivo1.

Dozni nivoi biraju se uzimajući u obzir sve postojeće podatke o toksičnosti, kao i dodatne podatke o metabolizmu i toksikokinetici ispitivane supstance ili srodnih materijala. Ovi podaci pomažu i kod dokazivanja adekvatnosti režima doziranja.

Koriste se i istovremenu kontrolnu grupu. Ova grupa mora da bude prividno tretirana kontrolna grupa ili kontrolna grupa za pomoćno sredstvo, ako se ono koristi prilikom primene ispitivane supstance. Svim grupama daje se ista zapremina ili ispitivane supstance ili pomoćnog sredstva. Sa životinjama u kontrolnim grupama mora se postupati na isti način kao sa onima u eksperimentalnim grupama. Kontrolne grupe pomoćnog sredstva moraju da dobiju pomoćnu materiju u najvećoj količini koja se koristi (kao kod grupa koje se tretiraju najnižim koncentracijama).

1.6.4. Ispitivanje granične doze

Ako ispitivanje na jednom nivou doze od najmanje 1.000 mg/kg TM/dan primenjene oralno uz korišćenje postupaka opisanih u ovoj studiji ne proizvede primetnu toksičnost kod gravidnih životinja ili kod njihovog potomstva i ako se efekat na osnovu postojećih podataka (npr. iz jedinjenja koja su strukturno i/ili metabolički slična) ne očekuje, nije potrebna potpuna studija uz korišćenje tri nivoa doze. Očekivana izloženost ljudi može da ukaže na potrebu da se u ispitivanju granične doze koristi viša oralna doza. Za druge vrste primene, kao što su inhalacija ili dermalna primena, fizička i hemijska svojstva ispitivane supstance često mogu indikovati i ograničiti nivo izlaganja koji se maksimalno može postići (na primer dermalna aplikacija ne sme da uzrokuje izraženu lokalnu toksičnost).

1.6.5. Primena doza

Ispitivana supstanca ili pomoćno sredstvo obično se daje oralno intubacijom. Ako se koristi drugi put primene, lice koja obavlja ispitivanje mora da opravda i obrazloži svoj izbor i verovatno su neophodne odgovarajuće izmene2, 3, 4. Ispitivana supstanca se primenjuje u približno isto vreme svakog dana.

Doza za pojedinačne životinje treba da se zasniva na poslednjoj određenoj individualnoj telesnoj masi. Potreban je oprez kod prilagođavanja doze tokom poslednjeg trimestra trudnoće. Prilikom izbora doze koriste se postojeći podaci kako bi se sprečila prekomerna toksičnost po majku. Ako se registruje prekomerna toksičnost kod tretiranih (gravidnih) ženki, te životinje moraju humano da se žrtvuju. Ako nekoliko gravidnih životinja pokaže znake prekomerne toksičnosti, treba razmotriti završetak (žrtvovanje) te dozne grupe. Ako se supstanca primenjuje oralnom sondom, preporučuje se da se životinjama daje u jednoj dozi upotrebom želudačne cevi ili odgovarajuće intubacione kanile. Maksimalna zapremina tečnosti koju je dozvoljeno dati odjednom zavisi od veličine eksperimentalne životinje. Zapremina ne sme biti veća od 1 ml/100 g TM, osim u slučaju vodenih rastvora gde se može koristiti 2 ml/100 g TM. Ako se kao pomoćno sredstvo koristi kukuruzno ulje zapremina ne sme da bude veća od 0,4 ml/100 g TM. Varijabilnost u zapremini koja se ispituje treba da se svede na minimum prilagođavanjem koncentracija kako bi se obezbedila stalna zapremina kod svih doznih nivoa.

1.6.6. Posmatranje (gravidnih) ženki

Klinička posmatranja obavljaju se i beleže najmanje jednom dnevno, ako je moguće u isto vreme svakog dana, uzimajući u obzir glavni period tokom koga se javljaju predviđeni efekti posle primene doze. Beleže se stanja životinja, uključujući smrtnost, stanje pred smrt, bitne promene ponašanja i svi znaci očigledne toksičnosti.

1.6.7. Telesna masa i potrošnja hrane

Životinje se mere: nultog dana gestacije i najkasnije trećeg dana gestacije ako je parene životinje nabavio spoljni uzgajivač; prvog dana doziranja; najmanje svaka tri dana tokom perioda doziranja i na dan planiranog žrtvovanja.

Potrošnja hrane beleži se svaka tri dana i treba da se podudara sa danima određivanja telesne mase.

1.6.8. Postmortalni pregled

Ženke se žrtvuju jedan dan pre očekivanog dana porođaja. Ženke koje pokazuju znake pobačaja ili prevremenog porođaja treba da se žrtvuju i podvrgnu detaljnom makroskopskom pregledu pre planiranog žrtvovanja.

Za vreme žrtvovanja ili u slučaju smrti tokom studije, ženka se makroskopski pregleda u cilju otkrivanja bilo koje strukturalne abnormalnosti ili patološke promene. Procena ženki za vreme carskog reza i kasnija analiza ploda obavlja se obično bez poznavanja podataka o tretiranoj grupi kako bi se greške svele na minimum.

1.6.9. Pregled sadržaja materice

Odmah po žrtvovanju ili što pre nakon smrti, uzimaju se materice i proverava stanje trudnoće životinja. Materice koje nisu gravidne potrebno je dalje pregledati (npr. bojenjem amonijum sulfidom za glodare i Salewski bojenjem ili odgovarajućom alternativnom metodom za kuniće) kako bi se potvrdilo da ne postoji trudnoća5.

Treba izmeriti masu gravidne materice sa cerviksom. Kod životinja koje su nađene mrtve tokom studije ne mere se mase gravidnih materica.

Za gravidne životinje mora se odrediti broj žutih tela.

Sadržaji materica pregledaju se kako bi se utvrdio broj smrti embriona ili ploda i plodova koji su sposobni za život. Treba da se opiše stepen resorpcije kako bi se procenilo relativno vreme smrti zametka (videti odeljak 1.2. ove metode).

1.6.10. Pregled ploda

Određuje se pol i telesna masa svakog ploda. Svaki plod se pregleda kako bi se utvrdile spoljašnje promene6.

Plodovi se pregledaju na izmene kostura i mekih tkiva (npr. varijacije i malformacije ili anomalije)7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24. Kategorizacija fetalnih promena se preporučuje, ali nije obavezna. Ako se obavi kategorizacija, treba jasno navesti kriterijume za određivanje svake kategorije. Posebna pažnja mora da se obrati na reproduktivni trakt koji se pregleda na znakove izmenjenog rasta i razvoja.

Za glodare, oko jedne polovine svakog okota priprema se i pregleda promene na kosturu. Preostale životinje iz okota pripremaju se i pregledaju na promene u mekim tkivima korišćenjem prihvaćenih ili odgovarajućih metoda serijske sekcije ili pažljive tehnike seciranja.

Kod životinja koje nisu glodari, npr. kunića, svi plodovi se pregledaju na promene u mekim tkivima i kosturu. Tela tih plodova procenjuju se pažljivim seciranjem i traženjem promena na mekim tkivima, što može da obuhvati postupke za dalju procenu interne kardijalne strukture25. Glave jedne polovine plodova pregledane na taj način treba ukloniti i obraditi za procenu promena na mekim tkivima (uključujući oči, mozak, nazalne šupljine i jezik) korišćenjem standardnih metoda serijske sekcije26 ili neke podjednako osetljive metode. Tela tih plodova i preostali nedirnuti plodovi obrađuju se i pregledaju na promene na kosturu, koristeći iste metode kao što je opisano za glodare.

2. PODACI

2.1. OBRADA REZULTATA

Podaci se navode pojedinačno za ženke, kao i za njihove potomke i prikazuju tabelarno. Podaci se navode za svaku eksperimentalnu grupu i generaciju i to: broj životinja na početku ispitivanja, broj životinja koje su nađene mrtve za vreme ispitivanja ili su žrtvovane iz humanih razloga, vreme svake smrti ili humanog žrtvovanja, broj gravidnih ženki, broj životinja koje pokazuju znakove toksičnosti, opis znakova uočene toksičnosti, uključujući vreme pojave, trajanja i težine svakog toksičnog efekta, vrste primećenih pojava koje embriona/ploda i sve relevantne podatke o okotu.

Numerički podaci se procenjuju odgovarajućom statističkom metodom, uz uzimanje okota kao jedinice za analizu podataka. Koristi se opšteprihvaćena statistička metoda. Statističke metode treba izabrati prilikom planiranja ispitivanja i one se moraju opravdati. U izveštaju o ispitivanju navode se i podaci o životinjama koje nisu preživele do planiranog žrtvovanja. Ako je relevantno ovi podaci se mogu uključiti u srednje vrednosti za grupe. Relevantnost podataka dobijenih od takvih životinja, pa i uključivanje ili isključenje iz srednjih vrednosti grupe, treba da se opravda i proceni na individualnoj osnovi.

2.2. PROCENA REZULTATA

Nalazi ispitivanja toksičnosti po prenatalni rast i razvoj procenjuju se u smislu primećenih efekata. Procena obuhvata:

- rezultate ispitivanja majke i embriona/ploda, uključujući procenu odnosa ili njihovo odsustvo, između izlaganja životinja ispitivanoj supstanci i učestalosti i ozbiljnosti svih nalaza;

- kriterijume korišćene za kategorizaciju spoljnog izgleda ploda, promena mekog tkiva i kostura, ako je obavljena kategorizacija;

- kad odgovara, kontrolne podatke iz ranije studije kako bi se poboljšalo tumačenje rezultata ispitivanja;

- numeričke vrednosti korišćene za izračunavanje svih procenata ili indeksa;

- odgovarajuću statističku analizu nalaza ispitivanja, gde odgovara, koja mora da obuhvati podatke o metodi analize, tako da nezavisni analitičar/statističar može da reevaluira i rekonstruiše analizu.

U svakoj studiji koja pokazuje odsustvo bilo kakvih toksičnih efekata treba razmotriti dalja istraživanja kako bi se utvrdila apsorpcija i bioraspoloživost ispitivane supstance.

2.3. TUMAČENJE REZULTATA

Ispitivanje toksičnosti po prenatalni rast i razvoj daje podatke o efektima ponavljanog izlaganja supstanci tokom graviditeta na ženke i na intrauterini razvoj njihovih potomaka. Rezultati ispitivanja tumače se u vezi sa nalazima iz subhronične, reproduktivne, toksikokinetičke i drugih studija. Kako je naglasak stavljen i na opštu toksičnost u smislu toksičnosti po majku i na pokazatelje toksičnosti po rast i razvoj, rezultati ispitivanja dozvoljavaju u određenoj meri razlikovanje između efekata na rast i razvoj do kojih dolazi u odsustvu opšte toksičnosti i onih efekata koji su indukovani samo pri nivoima koji su toksični i za gravidne životinje27.

3. IZVEŠTAJ

Izveštaj o ispitivanju sadrži podatke o:

1) Ispitivanoj supstanci:

- fizička svojstva i, gde je neophodno, fizička i hemijska svojstva;

- identifikacija uključujući CAS broj ako je poznat/utvrđen;

- čistoću.

2) Pomoćnom sredstvu (ako se koristi):

- opravdanje za izbor pomoćnog sredstva, ako se ne radi o vodi.

3) Eksperimentalnim životinjama:

- korišćena vrsta i varijetet;

- broj i starost životinja;

- izvor, uslovi smeštaja, dijeta itd.;

- individualne telesne mase životinja na početku ispitivanja.

4) Eksperimentalnim uslovima:

- obrazloženje za izbor nivoa doze;

- pojedinosti o formulaciji ispitivane supstance/priprema hrane, postignuta koncentracija, stabilnost i homogenost preparata;

- pojedinosti o primeni ispitivane supstance;

- konverzija koncentracije ispitivane supstance u hrani/vodi za piće (ppm) do stvarne doze (mg/kg TM/dan), ako je primenljivo;

- uslovi životne sredine;

- podaci o kvalitetu hrane i vode.

5) Rezultatima:

- Podaci o toksičnoj reakciji kod majke, uključuju, ali nisu ograničeni na:

- broj životinja na početku ispitivanja, broj preživelih životinja, broj gravidnih ženki i broj pobačaja i broj životinja koje su se prevremeno okotile;

- datum smrti tokom studije ili da li su životinje preživele do žrtvovanja;

- podatke o životinjama koje nisu preživele do planiranog žrtvovanja, ali ih ne treba uključiti u statističko poređenje između grupa;

- datum uočavanja svakog abnormalnog kliničkog znaka i kasniji tok;

- telesna masa, promene telesne mase i masa gravidne materice, uključujući, po izboru, promenu telesne mase korigovane za težinu gravidne materice;

- potrošnja hrane i, ako je merena, potrošnja vode;

- nalazi obdukcije, uključujući težinu materice;

- NOAEL vrednosti za efekte na majku i rast i razvoj.

6) Krajnjim pokazateljima efekta na rast i razvoj po dozi za okot sa implantima, uključujući:

- broj žutih tela;

- broj implantacija, broj i procenat živih i mrtvih plodova i resorpcija;

- broj i procenat pred- i postimplantacionih gubitaka.

7) Krajnjim pokazateljima efekta na rast i razvoj po dozi za okote sa živim plodovima, uključujući:

- broj i procenat živih potomaka;

- odnos polova;

- telesna masa, najbolje po polu i sa kombinovanim polovima;

- malformacije spoljnog izgleda, mekih tkiva i kostura i druge relevantne promene;

- kriterijumi za kategorizaciju, ako odgovara;

- ukupan broj i procenat plodova i okota sa spoljašnjim promenama, promenama mekog tkiva ili kostura, kao i vrsta i incidenca individualnih anomalija i drugih relevantnih promena.

8) Obrazloženju rezultata.

9) Zaključcima.

4. LITERATURA

1. Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for Developmental Toxicity. Risk Analysis 16; 399-410.

2. Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies. Fundamental and Applied Toxicology 14; 386-398.

3. Wong, B.A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation Exposure Systems to Address Toxicological Problems. CIIT Activities 17; 1-8.

4. US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E-Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation Developmental Toxicity Study.

5. Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte. Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experimentelle Pathologie 247:367.

6. Edwards, J.A. (1968) The external Development of the Rabbit and Rat Embryo. In Advances in Teratology. D.H.M. Woolam (ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.

7. Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S. Congenital Anomalies 16; 171-173.

8. Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techniquefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses. Congenital Anomalies 32; :381-391.

9. Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following Heat Exposure in the Rat. Teratology 47:229-242.

10. Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats. Teratology 37; 476.

11. Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Foetuses. Journal of Morphology 127:291-306.

12. Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative of Foetal Maturity. Teratology 11; 313-320.

13. Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity Studies. Toxicology and Applied Pharmacology 9; :398-408.

14. Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in Rats: Malformations or Variations Teratology 8; 309-316.

15. Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD (Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to Ethylene Glycol. Teratology 46; 169-181.

16. Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and Histological Study of Viscera. Supplement to Teratology Workshop Manual, pp. 163-173.

17. Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Possible Influence of the Sex Factor. American Journal of Anatomy 41; 411-445.

18. Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone. Stain Technology 39; 61-63.

19. Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton. American Journal of Anatomy 36; 313-355.

20. Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Examination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis 4; 181-188.

21. Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957) The Genesis of the Rat Skeleton. Thomas, Springfield, IL.

22. Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Teratology. In Teratology: Principles and Techniques, Wilson J.G. and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, pp 251-277.

23. Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977) Handbook of Teratology, Vol. 4. Plenum, NY.

24. Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Techniques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity. Acta Vet. Acad. Sci. Hung. 28; 233-239.

25. Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in Mammalian Foetuses. Teratology 9; 37-38.

26. Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In: Methods in Prenatal Toxicology Neubert, D., Merker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of Chicago, Chicago, IL, pp. 126-144.

27. US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for Developmental Toxicity Risk Assessment. Federal Register 56; 63798-63826.

28. Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Teratology 55; 249-292.

B.32. ISPITIVANJE KARCINOGENOSTI

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Videti Opšti uvod.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIP METODE

Obično se ispitivana supstanca primenjuje odgovarajućim putem sedam dana nedeljno kod nekoliko grupa eksperimentalnih životinja, jedna doza po grupi, tokom većeg dela njihovog životnog veka. Za vreme i posle izlaganja ispitivanoj supstanci eksperimentalne životinje se svakodnevno posmatraju kako bi se otkrili znakovi toksičnosti, naročito razvoj tumora.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Nisu propisani.

1.6. OPIS METODE

Eksperimentalne životinje drže se pod eksperimentalnim uslovima čuvanja i hranjenja najmanje pet dana pre ispitivanja. Zdrave mlade životinje pre ispitivanja se slučajnim izborom raspoređuju u tretirane i kontrolne grupe.

1.6.1. Pripreme

1.6.1.1. Eksperimentalne životinje

Na osnovu rezultata prethodnih studija mogu se koristiti različite vrste životinja (glodari ili drugi). Ispitivanju se podvrgavaju zdravi mladi primerci životinja laboratorijskih vrsta koje se najčešće koriste u ovakvim eksperimentima, a davanje doze započinje u što kraćem vremenskom roku posle odbijanja od sise.

Varijacije u telesnoj masi korišćenih životinja na početku studije ne smeju biti veće od ± 20% srednje vrednosti. Ako se izvodi subhronična oralna studija kao uvod u dugoročnu studiju u obe studije treba koristiti iste vrste i sojeve životinja.

1.6.1.2. Broj i pol

Za glodare koristi se najmanje 100 životinja (50 ženki i 50 mužjaka) za svaki dozni nivo i istovremenu kontrolnu grupu. Uzimaju se ženke koje nisu ranije rađale i koje nisu gravidne. Ako se planiraju žrtvovanja u toku eksperimenta broj životinja se mora povećati za broj životinja koje su planirane za žrtvovanje pre završetka ispitivanja.

1.6.1.3. Dozni nivoi i učestalost izlaganja

Koriste se najmanje tri doze ispitivane supstance uz istovremenu kontrolu. Najviša doza treba da pokaže znake minimalne toksičnosti, kao što je blago smanjenje dobijanja na telesnoj masi (manje od 10%), bez bitne promene normalnog životnog veka zbog efekata, osim kad se radi o tumorima.

Najniža doza ne sme da utiče na normalni rast, razvoj i dužinu života životinja niti da da bilo kakvu naznaku toksičnosti. Najniža doza ne sme da bude niža od 10% od visoke doze.

Srednja doza utvrđuje se u sredini raspona između visokih i niskih doza.

Kod izbora visine doza moraju se uzeti u obzir podaci iz prethodnih ispitivanja toksičnosti i studija.

Životinje se obično svakodnevno izlažu ispitivanoj supstanci. Ako se hemikalija daje u vodi za piće ili se umeša u hranu, mora neprekidno da bude na raspolaganju.

1.6.1.4. Kontrole

Istovremeno se koristi kontrolna grupa koja je u svakom pogledu ista kao eksperimentalne grupe, osim izlaganja ispitivanoj supstanci.

U posebnim okolnostima kao što su inhalacione studije koje uključuju aerosole ili korišćenje emulgatora čija biološka aktivnost nije okarakterisana u oralnim studijama, istovremeno se koristi i dodatna kontrolna grupa koja se ne izlaže pomoćnom sredstvu.

1.6.1.5. Put primene

Tri glavna puta primene su: peroralni, dermalni i inhalacioni. Izbor puta primene zavisi od fizičkih i hemijskih karakteristika ispitivane supstance i mogućeg puta izlaganja kod ljudi.

1.6.1.6. Studije sa peroralnim putem primene

Kad se ispitivana supstanca apsorbuje iz gastrointestinalnog trakta i ako je to put kojim ljudi mogu biti izloženi, predlaže se peroralni način primene, osim ako postoje kontraindikacije. Životinje mogu da dobiju ispitivanu supstancu u hrani, rastvorenu u vodi za piće ili im se može davati u kapsulama.

Idealno je dnevno doziranje tokom sedam dana nedeljno, jer primena doze na bazi pet dana nedeljno može da omogući oporavak ili povlačenje toksičnosti u periodu u kome se ne primenjuje ispitivana supstanca i time da utiče na rezultat i kasniju procenu. Doziranje na bazi pet dana nedeljno smatra se prihvatljivim.

1.6.1.7. Studije sa dermalnim putem primene

Kutano izlaganje premazivanjem kože može se izabrati da simulira glavni put izlaganja ljudi i kao sistem-model za izazivanje lezija na koži.

1.6.1.8. Studije sa inhalacionim putem primene

Kako studije sa inhalacionim putem primene predstavljaju tehnički problem koji je složeniji od drugih načina primene, ovde se detaljnije navodi taj način davanja. Dobra alternativa u specifičnim slučajevima može biti intratrahealno ukapavanje.

Dugotrajna izlaganja se osmišljavaju po projektovanoj izloženosti ljudi, pa se životinje dnevno izlažu šest sati posle izjednačenja koncentracija u komori, pet dana u nedelji (isprekidana izloženost) ili, kod eventualne ambijentalne izloženosti, 22 do 24 sata izloženosti tokom sedam dana nedeljno (neprekidna izloženost) sa oko jednim satom dnevno za hranjenje životinja u slično vreme i za održavanje komore. U oba slučaja životinje se izlažu fiksnim koncentracijama ispitivane supstance.

Glavna razlika između isprekidane i neprekidne izloženosti je u tome što u prvom slučaju postoji period od 17 do 18 sati tokom koga se životinje mogu oporaviti od efekata pojedinačne dnevne izloženosti, sa čak i dužim vremenom oporavka tokom vikenda.

Izbor isprekidane ili neprekidne izloženosti zavisi od ciljeva ispitivanja i od simulirane izloženosti ljudi. Moraju se razmotriti određeni tehnički problemi. Na primer, prednosti neprekidne izloženosti za simuliranje uslova životne sredine mogu da deluju suprotno zbog potrebe davanja vode i hranjenja za vreme izloženosti i potrebe za složenijim (i pouzdanim) tehnikama za stvaranje i praćenje aerosola i pare.

1.6.1.9. Komore za izlaganje

Životinje se podvrgavaju ispitivanju u inhalacionim komorama dizajniranim tako da održavaju dinamičan protok vazduha s najmanje 12 izmena vazduha u jednom satu kako bi se obezbedio odgovarajući sadržaj kiseonika i ravnomerno raspoređena atmosfera. Kontrolne komore i komore za izlaganje moraju da budu jednake u konstrukciji i dizajnirane tako da obezbeđuju uslove izlaganja koji su uporedivi u svim pogledima, izuzev izloženosti ispitivanoj supstanci. U komori se održava blagi negativni pritisak zbog sprečavanja ispuštanja ispitivane supstance u okruženje. Komore moraju da smanje na minimum prenaseljenost eksperimentalnih životinja. Kako bi se obezbedila stabilnost atmosfere u komori, pravilo je da ukupna "zapremina" eksperimentalnih životinja ne sme da prelazi 5% zapremine komore.

Moraju se obavljati merenja i pratiti sledeći parametri:

a) Protok vazduha: preporučuje se da se brzina protoka vazduha kroz komoru neprestano prati;

b) Koncentracija: u periodu dnevnog izlaganja koncentracija ispitivane supstance ne sme da varira za više od ± 15% od srednje vrednosti. Tokom celog ispitivanja koncentracije iz dana u dan moraju da se održavaju što je moguće stalnijim;

v) Temperatura i vlaga: za glodare se temperatura mora održavati na 22°C ± 2°C, a vlaga u komori na 30% do 70%, osim ako se koristi voda za suspendovanje ispitivane supstance u atmosferu komore. Preporučuje se da se temperatura i vlažnost neprestano prate;

g) Merenja veličine čestica: raspodela veličine čestica određuje se u atmosferi komore koja sadrži tečne ili čvrste aerosole. Čestice aerosola moraju biti takve veličine da ih eksperimentalne životinje mogu udisati. Uzorci atmosfere komore uzimaju se u zoni disanja životinja. Uzorak vazduha mora biti reprezentativan za raspodelu čestica kojima su životinje izložene i mora da obuhvata, na gravimetrijskoj bazi, sav suspendovani aerosol, čak i ako se ne može udisati mnogo aerosola. Za vreme razvoja generišućeg sistema, često moraju da se obavljaju analize veličine čestica, kako bi se obezbedila stabilnost aerosola, a posle toga onoliko često koliko je potrebno tokom izlaganja, kako bi se pravilno odredila raspodela čestica kojima su životinje bile izložene.

1.6.1.10. Trajanje ispitivanja

Trajanje ispitivanja karcinogenosti obuhvata veći deo životnog veka eksperimentalnih životinja. Ispitivanje se završava posle 18 meseci za miševe i hrčke, a posle 24 meseca za pacove. Za određene vrste životinja s dužim životnim vekom i/ili niskom stopom spontane pojave tumora ispitivanje treba završiti posle 24 meseca za miševe i hrčke, a posle 30 meseci za pacove. Alternativno je prihvatljiv završetak takve produžene studije kada broj preživelih životinja s najnižom dozom ili kontrolna grupa dostigne 25%. Kod završetka ispitivanja u kome je vidljiva razlika između polova, svaki pol mora posebno da se razmatra. Ako zbog vidljive toksičnosti prevremeno ugine samo grupa izložena visokoj dozi, to ne mora da bude razlog za završetak ispitivanja, pod uslovom da toksične manifestacije ne uzrokuju probleme u ostalim grupama. Kako bi se prihvatio negativan rezultat, najviše 10% životinja od bilo koje grupe može da se izgubi zbog autolize, kanibalizma ili problema usled manipulacije, a preživljavanje u svim grupama treba da bude veće od 50% posle 18 meseci za miševe i hrčke, a posle 24 meseca za pacove.

1.6.2. Postupak

1.6.2.1. Posmatranja

Dnevna posmatranja životinja u kavezu treba da obuhvate promene na koži i krznu, očima i sluznicama, kao i respiratornom, cirkulatornom sistemu i autonomnom i centralnom nervnom sistemu, somatomotornu aktivnost i model ponašanja.

Neophodno je redovno posmatrati životinje kako bi se obezbedilo, koliko je moguće, da se životinje ne izgube iz studije zbog kanibalizma, aotolize tkiva ili stavljanja na pogrešno mesto. Kada se primete životinje na samrti, treba ih izolovati i obdukovati.

Klinički znaci i mortalitet moraju da se zabeleže za sve životinje. Posebna pažnja mora se obratiti na razvoj tumora: potrebno je zabeležiti vreme pojave; lokaciju, dimenzije, izgled i rast svakog golim okom vidljivog tumora ili tumora koji se palpira.

Merenja potrošnje hrane (i vode, ako se ispitivana supstanca daje u vodi za piće) obavljaju se jednom nedeljno tokom prvih 13 nedelja ispitivanja, a potom u intervalima od oko tri meseca, osim ako zdravstveno stanje ili promene telesne mase ne zahtevaju drugačije.

Telesna masa se beleži pojedinačno za sve životinje jednom nedeljno tokom prvih 13 nedelja ispitivanja, a posle toga najmanje na svake četiri nedelje.

1.6.2.2. Klinička ispitivanja

1.6.2.2.1. Hematologija

Ako se posmatranjem životinja u kavezima primeti pogoršanje zdravlja tokom studije, za sve životinje kod kojih je primećeno pogoršanje treba da se uradi diferencijalna krvna slika.

Posle 12 meseci, 18 meseci i pre žrtvovanja, od životinja se uzima uzorak krvi. Diferencijalna krvna slika radi se u uzorcima životinja iz grupe kojoj je davana visoka doza i životinja u kontrolnim grupama. Ako ti podaci, naročito oni dobijeni pre žrtvovanja ili podaci patološkog pregleda, ukažu na potrebu izrade diferencijalne krvne slike, ista treba da se uradi i u grupi s narednom nižom dozom.

1.6.2.2.2. Postmortalni pregled

Postmortalni pregled se izvodi na svim životinjama, uključujući one koje su uginule za vreme eksperimenta ili su žrtvovane jer su nađene na samrti. Čuvaju se sve vidljive lezije, tumori ili lezije za koje se sumnja da su tumori.

U odgovarajućem medijumu za eventualni kasniji histopatološki pregled čuvaju se sledeći organi i tkiva: mozak (uključujući delove produžene moždine/ponsa, kore malog mozga, kore velikog mozga), hipofiza, tiroidna/paratiroidna žlezda, timusna tkiva, dušnik i pluća, srce, aorta, pljuvačne žlezde, jetra, slezina, bubrezi, nadbubrežne žlezde, gušterača, polne žlezde, materica, ostali genitalni organi, koža, jednjak, želudac, dvanaestopalačno crevo, tanko crevo, slepo crevo, debelo crevo, rektum, mokraćna bešika, reprezentativan limfni čvor, ženske mlečne žlezde, muskulatura bedra, periferni živci, grudna kost sa kostnom srži, femur (uključujući zglob), kičmena moždina na tri nivoa (cervikalna, srednje-torakalna i lumbalna) i oči.

Inflacija (naduvavanje) pluća i mokraćne bešike s fiksativom je optimalan način da se sačuvaju ta tkiva. Inflacija pluća kod inhalacionih studija je suštinska za odgovarajući histopatološki pregled. Kod inhalacionih studija treba da se sačuva čitav respiratorni trakt, uključujući nosnu šupljinu, ždrelo i grkljan.

1.6.2.2.3. Histopatologija

a) Kompletna histopatološka ispitivanja treba da se obave na organima i tkivima svih životinja koje su uginule ili su žrtvovane tokom ispitivanja i u kontrolnoj grupi i grupi kojoj je davana visoka doza.

b) U svim grupama mikroskopski se pregledaju svi tumori vidljivi golim okom ili lezije za koje se sumnja da bi mogli biti tumori.

v) Ako postoji značajna razlika u incidenci neoplastičkih lezija u grupi kojoj je davana visoka doza i u kontrolnoj grupi, histopatološki pregledi na tim organima ili tkivima izvode se i u drugim grupama.

g) Ako je preživljavanje u grupi kojoj je davana visoka doza bitno manje nego u kontrolnoj grupi, obavlja se kompletno ispitivanje grupe naredne niže doze.

d) Ako u grupi kojoj je davana visoka doza postoji dokaz o izazivanju toksičnih ili drugih efekata koji su mogli uticati na neoplastičnu reakciju, obavlja se kompletno ispitivanje životinja u grupi s narednom nižom dozom.

2. PODACI

Podaci se navode tabelarno, gde se za svaku ispitivanu grupu životinja navodi: broj životinja na početku eksperimenta, broj životinja s tumorima otkrivenim tokom eksperimenta, vreme otkrivanja i broj životinja kod kojih je nađen tumor posle žrtvovanja. Svi dobijeni rezultati analiziraju se odgovarajućom statističkom metodom. Može se koristiti bilo koja usvojena statistička metoda.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ako je moguće, sadrži podatke o:

1) Vrsti, soju, izvoru, uslovima sredine, ishrani;

2) Eksperimentalnim uslovima: opis aparature za izlaganje (uključujući dizajn, vrstu, dimenzije aparature, kao i izvor vazduha, sistem za generisanje partikulata i aerosola, metoda za kondicioniranje vazduha, obrada iskorišćenog vazduha i metoda čuvanja životinja u eksperimentalnoj komori, ako se koristi. Treba opisati opremu za merenje temperature, vlažnosti i, kada odgovara, stabilnost koncentracije aerosola ili veličinu čestica).

3) Izlaganju:

- ovi podaci se prikazuju tabelarno sa srednjim vrednostima i merom varijabilnosti (npr. standardna devijacija) i treba da obuhvate podatke o:

a) brzini protoka vazduha kroz opremu za inhalaciju;

b) temperaturi i vlažnosti vazduha;

v) nominalnoj koncentraciji (ukupnom sadržaju ispitivane supstance koja se uvodi kroz opremu za inhalaciju, podeljenom sa zapreminom vazduha);

g) prirodi pomoćnog sredstva, ako je korišćeno;

d) koncentraciji supstance u zoni udisanja;

đ) srednjoj veličini čestica (gde je potrebno),

- nivoima doze (uključujući pomoćno sredstvo, ako je korišćeno) i koncentracije;

- o incidencama tumora po polu, dozi i vrsti tumora;

- vremenu smrti tokom ispitivanja ili da li su životinje preživele do žrtvovanja;

- o toksičnom odgovoru po polu i dozi;

- opis toksičnih ili drugih efekata;

- vremenu kada je primećen svaki znak abnormalnosti i njenom kasnijem toku;

- hrani i telesnoj masi;

- izvedenim hematološkim ispitivanjima i svim rezultatima istih;

- nalazima obdukcije;

- detaljan opis svih histopatoloških nalaza;

- statističkoj obradi rezultata s opisom korišćene metode.

4) Obrazloženju rezultata.

5) Tumačenju rezultata.

3.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Videti Opšti uvod.

4. LITERATURA

Videti Opšti uvod.

B.33. KOMBINOVANO ISPITIVANJE HRONIČNE TOKSIČNOSTI/KARCINOGENOSTI

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Videti Opšti uvod.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIP METODE

Cilj kombinovanog ispitivanja hronične toksičnosti karcinogenosti jeste određivanje hroničnih i karcinogenih efekata supstance kod sisara posle produžene izloženosti.

U tu svrhu u ispitivanje karcinogenosti treba dodatno uključiti najmanje jednu prateću grupu i kontrolnu prateću grupu. Doza koja se koristi kod prateće grupe sa visokom dozom može da bude veća od one koja se koristi kod grupe sa visokom dozom u ispitivanju karcinogenosti. Životinje se u ispitivanju karcinogenosti pregledaju kako bi se uočila opšta toksičnost, kao i karcinogeni odgovor. Životinje iz tretirane prateće grupe pregledaju se na opštu toksičnost.

Ispitivanom supstancom više grupa eksperimentalnih životinja tretira se sedam dana nedeljno, odgovarajućim putem, jednom dozom po grupi i to tokom najvećeg dela njihovog života. Za vreme i posle izlaganja ispitivanoj supstanci, eksperimentalne životinje se svakodnevno posmatraju radi otkrivanja znakova toksičnosti i razvoja tumora.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Nisu propisani.

1.6. OPIS METODE

Životinje se drže pod eksperimentalnim uslovima smeštaja i ishrane najmanje pet dana pre ispitivanja. Pre ispitivanja zdrave mlade životinje se slučajnim izborom dodeljuju grupama za tretiranje i kontrolnim grupama.

1.6.1. Pripreme

1.6.1.1. Eksperimentalne životinje

Najpogodnija vrsta je pacov. Na osnovu rezultata prethodnih ispitivanja mogu se koristiti i druge vrste (glodarske ili ne). Treba koristiti mlade i zdrave životinje uobičajeno korišćenih laboratorijskih linija. Sa doziranjem treba da se počne što je moguće pre nakon odbijanja od sise.

Na početku ispitivanja varijacija u telesnoj masi životinja ne treba da bude veća od ±20% srednje vrednosti. Kada se pre dugoročnog ispitivanja izvodi ispitivanje subhronične oralne toksičnosti u oba ispitivanja moraju da se koriste iste vrste i sojevi/linije životinja.

1.6.1.2. Broj i pol

Za glodare je potrebno koristiti najmanje 100 životinja (50 ženki i 50 mužjaka) za svaki dozni nivo i istovremenu kontrolnu grupu. Koriste se ženke koje nisu ranije rađale i koje nisu gravidne. Ukoliko se planira žrtvovanje u toku ispitivanja, potrebno je povećati broj životinja za onoliko koliko će biti žrtvovano pre završetka ispitivanja.

Tretirana prateća grupa ili grupe za određivanje patologije različite od tumora moraju obuhvatati po 20 životinja svakog pola, dok kontrolna prateća grupa treba da obuhvata po 10 životinja svakog pola.

1.6.1.3. Dozni nivoi i učestalost izlaganja

U svrhu ispitivanja karcinogenosti potrebno je koristiti najmanje tri nivoa doza pored istovremene kontrolne grupe. Najveći dozni nivo treba da izazove znake minimalne toksičnosti, kao što je malo usporenje dobijanja na telesnoj masi (manje od 10%), a da se pri tome normalni životni vek ne menja bitno usled uzroka koji su drugačiji od pojave tumora.

Najmanji dozni nivo ne treba da remeti normalni rast, razvoj i životni vek životinje, niti treba da stvara ikakve naznake toksičnosti. Ovaj nivo ne treba da bude niži od 10% visoke doze.

Srednju dozu treba ustanoviti na oko polovine raspona između visoke i niske doze.

Dozni nivoi se biraju uzimajući u obzir podatke iz prethodnih ispitivanja i studija toksičnosti.

U svrhu ispitivanja hronične toksičnosti u ispitivanje se uključuju dodatne prateće grupe - tretirane i istovremena kontrolna grupa. Visoka doza kod tretiranih pratećih životinja treba da izazove definitivne znake toksičnosti.

Učestalost izlaganja je svakodnevno. Ako se hemikalija daje u vodi za piće ili je umešana u hranu, potrebno je da voda i hrana budu stalno dostupne životinjama.

1.6.1.4. Kontrole

Koristi se istovremenu grupu koja je u svakom pogledu identična tretiranim grupama, osim po izlaganju ispitivanoj supstanci.

U posebnim okolnostima, kao što je ispitivanje inhalacione toksičnosti koja uključuje aerosole ili upotreba emulgatora bez okarakterisanog biološkog dejstva u studijama oralne toksičnosti potrebno je koristiti dodatnu kontrolnu grupu koja nije izložena rastvaraču.

1.6.1.5. Put primene

Tri glavna puta primene su: peroralni, dermalni i inhalacioni. Izbor puta primene zavisi od fizičkih i hemijskih karakteristika ispitivane supstance i od mogućeg puta izlaganja kod ljudi.

1.6.1.6. Ispitivanja peroralno

Kada se ispitivana supstanca apsorbuje iz gastrointestinalnog trakta, a to je i put unosa kojim mogu biti izloženi ljudi, ukoliko ne postoje kontraindikacije najbolje je primeniti peroralni put primene. Životinje ispitivanu supstancu mogu da dobijaju putem hrane, rastvorenu u vodi za piće ili u obliku kapsule. U idealnom slučaju treba da se koristi dnevno doziranje sedam dana u nedelji, jer doziranje na bazi pet dana nedeljno može da omogući oporavak ili povlačenje toksičnosti u periodu bez doziranja, što može da utiče na rezultat i procenu. Na osnovu razmatranja praktičnosti, doziranje na bazi pet dana nedeljno smatra se prihvatljivim.

1.6.1.7. Ispitivanja dermalnim putem primene

Za simulaciju u slučaju kada je glavni put izloženosti ljudi preko kože i kao model za izazivanje povreda kože, može se izabrati izlaganje premazivanjem kože.

1.6.1.8. Ispitivanja inhalacionim putem primene

Ispitivanja inhalacionim putem primene predstavljaju složeniji tehnički problem od drugih puteva primene, te se iz tog razloga daju detaljnija uputstva o tom načinu. U posebnim slučajevima intratrahijalna instilcija može da predstavlja opravdanu alternativu.

Dugotrajna izlaganja se planiraju prema projektovanom izlaganju ljudi tako što se posle uravnoteženja koncentracija u komori životinje dnevno izlažu po šest sati, pet dana u nedelji (povremeno izlaganje) ili, u odnosu na moguće izlaganje u životnoj sredini, 22 do 24 sata dnevno sedam dana nedeljno (neprekidno izlaganje), sa jednim satom dnevno (u približno isto vreme) za hranjenje životinja i za održavanje komora. U oba slučaja životinje su izložene fiksnim koncentracijama ispitivane supstance. Glavna razlika između povremenog i neprekidnog izlaganja je da u prvom slučaju postoji period od 17 do 18 sati tokom kog se životinje mogu oporaviti od efekta dnevnog izlaganja, uz još duži period oporavka tokom vikenda.

Izbor povremenog ili neprekidnog izlaganja zavisi od ciljeva ispitivanja i od simuliranog izlaganja ljudi. U obzir se moraju uzeti određene tehničke poteškoće. Na primer, prednosti neprekidnog izlaganja za simulaciju uslova životne sredine mogu biti smanjene zbog potrebe pojenja i hranjenja za vreme izlaganja i zbog potrebe za komplikovanijim (i pouzdanijim) tehnikama produkcije aerosola i para, kao i zbog praćenja.

1.6.1.9. Komore za inhalaciono izlaganje

Životinje se ispituju u komorama za inhalaciono izlaganje koje su projektovane da podržavaju dinamički protok od najmanje 12 promena vazduha na sat kako bi se obezbedio adekvatan sadržaj kiseonika i ravnomerno raspoređena atmosfera izlaganja. Kontrolne komore i komore za izlaganje moraju da budu identične konstrukcije i dizajna, kako bi se obezbedili uslovi izlaganja koji se u svim aspektima mogu uporediti, osim u pogledu izlaganja ispitivanim supstancama. U unutrašnjosti komore obično se održava negativni pritisak zbog sprečavanja ispuštanja ispitivane supstance u okolni prostor. Komore treba da su takve da se gomilanje eksperimentalnih životinja svede na minimum. Opšte je pravilo da, zbog stabilnosti atmosfere u komori, ukupna zapremina životinja ne sme da prelazi 5% zapremine komore.

Mere se i prate sledeći parametri:

a) Protok vazduha: protok vazduha kroz komoru treba neprekidno kontrolisati;

b) Koncentracija: tokom dnevne izloženosti koncentracija ne sme da odstupa više od ± 15% od srednje vrednosti. Za vreme ukupnog trajanja ispitivanja, koncentracije iz dana u dan treba održavati što je moguće stabilnijim;

v) Temperatura i vlažnost: za glodare temperaturu treba održavati na 22°C ± 2°C, a vlažnost u komori na 30% do 70%, osim u slučaju kada se upotrebljava voda za suspendovanje ispitivane supstance u atmosferu komore. Preporučuje se neprekidno praćenje temperature i vlažnosti;

g) Merenja veličine čestica: raspodela veličine čestica treba da se odredi u atmosferi komore kada ona uključuje tečne ili čvrste aerosole. Čestice aerosola treba da budu veličine koju eksperimentalna životinja može da udiše. Uzorci atmosfere iz komora treba da se uzimaju u zoni udisanja. Uzorak vazduha treba da bude reprezentativan za raspodelu čestica kojima su životinje izložene i treba da pruži gravimetrijski podatak o ukupnom aerosolu, čak i onda kada se veći deo aerosola ne udiše. Analize veličine čestica treba da se obavljaju često tokom razvijanja generatorskog sistema kako bi se obezbedila stabilnost aerosola, a potom onoliko često koliko je potrebno da se adekvatno utvrdi konzistencija raspodele čestica kojima su životinje izložene.

1.6.1.10. Trajanje ispitivanja

Trajanje dela ispitivanja karcinogenosti podrazumeva najveći deo normalnog životnog veka eksperimentalnih životinja. Završetak ispitivanja u slučaju miševa i hrčaka treba da bude u 18 meseci starosti, a za pacove 24 meseca. Kod određenih sojeva životinja koje imaju duži životni vek i/ili nižu stopu spontane pojave tumora, završetak ispitivanja a treba da bude 24 meseca za miševe i hrčke, a 30 meseci za pacove. Alternativno se može prihvatiti završetak takvog produženog ispitivanja kada broj preživelih u grupi sa najnižom dozom ili kontrolnoj grupi dostigne 25%. Ako se prilikom završetka ispitivanja uoče znatne razlike među polovima, svaki pol treba odvojeno razmatrati. Kad zbog očigledne toksičnosti pre vremena ugine samo grupa koja je primala visoku dozu, ispitivanje ne treba prekidati ukoliko toksičnost ne uzrokuje probleme u drugim grupama. Da bi se prihvatio negativni rezultat ispitivanja, ne sme biti izgubljeno više od 10% životinja u svakoj grupi zbog autolize, kanibalizma ili postupanja, a preživljavanje kod svih grupa ne sme da bude manje od 50% posle 18 meseci za miševe i hrčke, a posle 24 meseca za pacove.

Prateće grupe od 20 doziranih životinja po polu i 10 priključenih kontrolnih životinja po polu koje se koriste za ispitivanje hronične toksičnosti treba da se na ispitivanju zadrže najmanje 12 meseci. Te životinje treba da budu žrtvovane zbog ispitivanja patologije koja je u vezi sa ispitivanom supstancom, a koja nije dodatno zakomplikovana gerontološkim promenama.

1.6.2. Postupak

1.6.2.1. Posmatranja

Životinje u kavezima svakodnevno se posmatraju u pogledu promena na koži i krznu, očima i sluznicama, kao i disajnom, cirkulatornom, autonomnom i centralnom nervnom sistemu, promena somatomotornih aktivnosti i modela ponašanja.

Na životinjama u ispitivanim pratećim grupama treba u odgovarajućim intervalima obavljati kliničke preglede.

Redovno posmatranje životinja potrebno je zbog obezbeđivanja, koliko je moguće, da ne dođe do gubitka ispitivanih životinja zbog kanibalizma, autolize tkiva ili greškom. Životinje na samrti treba odmah odvojiti i izvršiti obdukciju.

Za sve životinje potrebno je zabeležiti kliničke znake, uključujući i neurološke i promene na oku i uginuća. Posebna pažnja se mora posvetiti razvoju tumora: vremenu nastanka, mestu, dimenzijama, izgledu i progresiji svakog vidljivog i opipljivog tumora. Potrebno je zabeležiti i vreme nastanka i progresiju toksičnih efekata.

Nedeljno se meri potrošnja hrane (i vode, kad se ispitivana supstanca daje putem vode za piće) tokom prvih 13 nedelja ispitivanja, a posle toga u intervalima od oko tri meseca, osim ako zdravstveno stanje ili promene telesne mase ne zahtevaju drugačije.

Telesna masa se beleži individualno za sve životinje, jednom nedeljno tokom prvih 13 nedelja perioda ispitivanja, a posle toga najmanje jednom u svake četiri nedelje.

1.6.2.2. Klinički pregledi

1.6.2.2.1. Hematologija

Hematološki pregled (tj. sadržaj hemoglobina, ukupna zapremina ćelija, ukupan broj crvenih krvnih ćelija, ukupan broj belih krvnih ćelija, krvnih pločica ili drugi parametri koagulabilnosti) treba obavljati posle tri meseca, posle šest meseci, a posle toga u intervalima od oko šest meseci i na završetku ispitivanja na uzorcima krvi uzetih od 10 pacova po polu iz svih grupa. Ako je moguće, u svakom intervalu se uzimaju uzorci od istih pacova.

Ukoliko se tokom posmatranja utvrdi pogoršanje zdravstvenog stanja životinja, potrebno je uraditi diferencijalnu krvnu sliku odgovarajućih životinja.

Diferencijalna krvna slika vrši se na uzorcima životinja iz grupe s najvećom dozom i kontrolne grupe. Diferencijalna krvna slika vrši se na sledećoj nižoj grupi/grupama samo ako se utvrde značajne razlike između najviše grupe i kontrole ili ako je indikovano zbog patoloških nalaza.

1.6.2.2.2. Analiza mokraće

Za analizu se uzimaju uzorci mokraće od 10 pacova svakog pola iz svih grupa, ako je moguće od istih pacova, u istim intervalima kao i hematološki pregledi.

Za svaku pojedinu životinju ili na "pool" uzorku po polu po grupi glodara određuje se:

- izgled: zapremina i gustina po pojedinoj životinji;

- proteini, glukoza, keton, okultna krv (semi-kvantitativno);

- mikroskopski pregled sedimenata (semi-kvantitativno).

1.6.2.2.3. Medicinska biohemija

U intervalima od oko šest meseci i na završetku ispitivanja uzimaju se uzorci krvi od svih životinja koje nisu glodari za biohemijska merenja i 10 uzoraka od pacova po polu iz svih grupa, ako je moguće uvek od istih životinja. Potrebno je uzeti prethodne uzorke od životinja koje nisu glodari. U plazmi ovih uzoraka određuje se:

- koncentracija ukupnih proteina;

- koncentracija albumina;

- ispitivanja funkcije jetre (kao što su aktivnost alkalne fosfataze, aktivnost glutmat piruvat transaminazeXLVII i aktivnost glutamat oksaloacetat transaminazeXLVIII), gama glutamil transpeptidaza, ornitin dekarboksilaza;

- metabolizam ugljenih hidrata, kao što je glukoza u krvi posle gladovanja;

- ispitivanja funkcije bubrega kao što je azot u ureji u krvi (u daljem tekstu: BUN).

______________
XLVII poznata kao serumska alanin aminotransferaza
XLVIII poznata kao serumska aspartat aminotransferaza

1.6.2.2.4. Postmortalni pregled

Kompletnu obdukciju treba izvesti na svim životinjama, uključujući i one koje su uginule tokom ispitivanja ili koje su žrtvovane jer su nađene na samrti. Pre žrtvovanja potrebno je od svih životinja uzeti uzorke krvi za različite analize. Svi vidljivi tumori i ozlede za koje se sumnja da su tumori moraju biti sačuvani. Potrebno je preduzeti sve mere za povezivanje uočenih promena s mikroskopskim nalazima.

Svi organi i tkiva moraju se sačuvati za histopatološke preglede. To podrazumeva sledeće organe i tkiva: mozakXLIX (medula/pons, kora malog mozga, kora velikog mozga); hipofiza, tiroidea (uključujući paratiroideu), timus, pluća (uključujući traheju), srce, aortu, pljuvačne žlezde, jetruXII, slezinu, bubregeXII, nadbubrežne žlezdeXII, jednjak, želudac, duodenum, jejenum, ileum, slepo crevo, kolon, rektum, mokraćna bešika, limfni čvorovi, pankreas, polne žlezdeXII, pomoćni genitalni organi; ženska mlečna žlezda, koža, muskulatura, periferni živci, kičma (cervikalna, torakalna, lumbalna), sternum sa koštanom srži i femur (sa zglobom) i oči.

Iako inflaciaja (naduvavanje) pluća i mokraćne bešike pomoću fiksativa predstavlja optimalni način za konzerviranje tih tkiva, u ispitivanjima inhalacione toksičnosti naduvavanje pluća je neophodno za odgovarajući histopatološki pregled. Kod specifičnih ispitivanja, kao što su ispitivanja inhalacione toksičnosti, potrebno je pregledati ceo respiratorni trakt, uključujući i nos, ždrelo i grkljan.

Ukoliko se obavljaju druga klinička ispitivanja, dobijeni podaci treba da budu dostupni pre mikroskopskog pregleda, jer patologu mogu dati značajne smernice.

______________
XLIX Mora se izmeriti masa organima (uzetim od po 10 životinja po polu po grupi glodara)

1.6.2.2.5. Histopatologija

Za deo ispitivanja hronične toksičnosti:

Potrebno je detaljno pregledati sve sačuvane organe svih životinja iz prateće grupe visoke doze i iz kontrolne grupe. Ako se patološki nalaz uzorka iz prateće grupe visoke doze može povezati s ispitivanom supstancom, ciljni organi svih životinja iz ostalih tretiranih pratećih grupa moraju se na kraju ispitivanja podvrgnuti potpunom i detaljnom histološkom pregledu, kao i oni iz pogođenih grupa iz dela ispitivanja karcinogenosti.

Za deo ispitivanja karcinogenosti:

a) Na organima i tkivima svih životinja koje su uginule ili bile žrtvovane tokom ispitivanja, kao i svih životinja iz kontrolne grupe i grupe visoke doze potrebno je obaviti potpuni histopatološki pregled;

b) Svi tumori vidljivi golim okom ili promene za koje se sumnja da su tumori nađene kod svih grupa i na bilo kom organu moraju biti pregledani mikroskopski;

v) Ukoliko postoji značajna razlika u učestalosti pojave neoplastičnih promena kod grupe visokog doznog nivoa i kontrolne grupe, potrebno je obaviti histopatološki pregled na određenom organu ili tkivu u drugim grupama;

g) Ako je preživljavanje kod grupe visokog doznog nivoa znatno manje nego u kontrolnoj grupi, potrebno je detaljno pregledati sledeću grupu sa nižim nivoom doze;

d) Ako kod grupe visokog doznog nivoa postoji dokaz o uzrokovanju toksičnosti ili o drugim efektima koji mogu da utiču na neoplastičnu reakciju, potrebno je detaljno pregledati grupu sledećeg nižeg doznog nivoa.

2. PODACI

Podaci se ne vode tabelarno i za svaku ispitivanu grupu navodi se: broj životinja na početku ispitivanja, broj životinja kod kojih su se pojavili tumori ili toksični efekti utvrđenih tokom ispitivanja, vreme otkrivanja i broj životinja kod kojih su tumori ustanovljeni po žrtvovanju. Rezultati se procenjuju odgovarajućom statističkom metodom. Može se primeniti bilo koja priznata statistička metoda.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ako je moguće, sadrži podatke o:

1) Vrsti, soju, izvoru, uslovima sredine, ishrani.

2) Uslovima ispitivanja: opis aparature za inhalaciono izlaganje (uključujući dizajn, tip, dimenzije, izvor vazduha, sistem generisanja čestica i aerosola, način klimatizovanja vazduha, tretman iskorišćenog vazduha i metoda smeštaja životinja u eksperimentalnim komorama, ako se primenjuju. Treba opisati uređaj za merenje temperature, vlažnosti i, kada odgovara, stabilnosti koncentracije aerosola i veličine čestica).

3) Izlaganju:

- ovi podaci se navode u obliku tabele u kojoj se prikazuju srednje vrednosti i mera odstupanja (tj. standardna devijacija) i uključuju:

a) podatke o protoku vazduha kroz opremu za inhalaciju;

b) temperaturu i vlažnost vazduha;

v) nominalne koncentracije (ukupna količine ispitivane supstance dodate u opremu za inhalaciju, podeljena sa zapreminom vazduha);

g) prirodu rastvarača, ako je korišćen;

d) koncentraciju u zoni udisanja;

đ) srednju veličina čestica (gde je primenljivo);

- doznim nivoima (uključujući rastvarač, ako se koristi) i koncentracije;

- učestalosti pojave tumora po polu, dozi i tipu tumora;

- vremenu smrti tokom ispitivanja ili da li su životinje preživele do kraja, uključujući prateću grupu;

- toksičnoj reakciji po polu i dozi;

- opis toksičnih ili drugih efekata;

- vremenu uočavanja svakog znaka abnormalnosti i njen dalji tok;

- oftalmološkim nalazima;

- hrani i telesnoj masi;

- primenjenim hematološkim ispitivanjima i svim rezultatima;

- primenjenim medicinsko-biohemijskim ispitivanjima i svim rezultatima (uključujući i analizu urina);

- obdukcionim nalazima;

- detaljan opis svih histopatoloških nalaza;

- statističkoj obradi rezultata sa opisom primenjenih metoda.

4) Obrazloženju rezultata.

5) Tumačenju rezultata.

3.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Videti Opšti uvod.

4. LITERATURA

Videti Opšti uvod.

B.34. ISPITIVANJE TOKSIČNOSTI PO REPRODUKCIJU NA JEDNOJ GENERACIJI

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Videti Opšti uvod.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIP METODE

Ispitivana supstanca primenjuje se u rastućim dozama u grupama mužjaka i ženki. Mužjacima se daje supstanca tokom rasta i tokom najmanje jednog spermatogenog ciklusa (oko 56 dana kod miša, a 70 dana kod pacova) kako bi se izazvali štetni efekti supstance koja se ispituje na spermatogenezu.

Ženke roditeljske (P) generacije treba dozirati tokom najmanje dva kompletna ciklusa "estrusa" kako bi se izazvali štetni efekti ispitivane supstance po "estrus". Posle toga se životinje pare. Ispitivana supstanca se primenjuje kod oba pola tokom perioda parenja, a posle toga samo ženkama tokom graviditeta i tokom perioda dojenja.

Za primenu inhalacionim putem metoda zahteva modifikaciju.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Nisu propisani.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Pripreme

Pre ispitivanja zdrave mlade životinje se slučajnim izborom raspoređuju u tretirane i kontrolne grupe. Životinje se drže u uslovima eksperimentalnog smeštaja i ishrane najmanje pet dana pre ispitivanja.

Preporučuje se da se ispitivana supstanca daje u hrani ili vodi za piće. Prihvataju se i drugi putevi primene. Tokom odgovarajućeg eksperimentalnog perioda svim životinjama se daje supstancu na isti način. Ako se upotrebljava rastvarač ili aditivi da bi se olakšalo doziranje, oni ne smeju da izazivaju toksični efekat.

Doziranje treba da bude sedam dana nedeljno.

1.6.1.1. Eksperimentalne životinje

1.6.1.1.1. Izbor vrste

Preporučene vrste su pacovi ili miševi. Koriste se zdrave životinje koje ranije nisu bile podvrgnute ispitivanjima. Ne treba koristiti sojeve za koje se zna da su slabo plodni. Eksperimentalne životinje treba okarakterisati po vrsti, soju, polu, telesnoj masi i/ili starosti.

Za adekvatnu procenu plodnosti potrebno je posmatrati i mužjake i ženke. Kada ispitivanje započne nijedna eksperimentalna životinja, bilo iz tretirane ili iz kontrolne grupe, ne sme da bude u fazi sisanja.

1.6.1.2. Broj i pol

Svaka eksperimentalna i kontrolna grupa mora da ima dovoljan broj životinja kako bi se dobilo oko 20 gravidnih ženki neposredno pre ili blizu okota.

Cilj je da se proizvede dovoljno trudnoća i potomstva kako bi se obezbedila svrsishodna procena potencijala supstance da utiče na plodnost, graviditet i majčinsko ponašanje u P generaciji životinja, i odojčad, rast i razvoj F1 potomaka od začeća do odbijanja od sise.

1.6.1.3. Uslovi ispitivanja

Treba obezbediti slobodan pristup hrani i vodi. Uoči koćenja, gravidne ženke treba smestiti u posebne kaveze za koćenje ili uzgoj i treba im dati materijal za gnežđenje.

1.6.1.4. Dozni nivoi

Koriste se najmanje tri tretirane grupe i kontrolnu grupu. Ako se za primenu ispitivane supstance upotrebljava rastvarač, kontrolna grupa treba da prima najveću korišćenu zapreminu rastvarača. Ukoliko ispitivana supstanca uzrokuje smanjeno uzimanje ili iskorišćenost hrane, neophodno je koristiti dodatnu kontrolnu grupu koja bi se hranila. U idealnom slučaju, osim ako postoji ograničenje fizičko/hemijske prirode ili biološki efekti ispitivane supstance, najviši dozni nivo treba da izaziva toksičnost, ali ne smrtnost kod životinja roditelja (P). Srednja doza treba da izaziva minimalne toksične efekte koji bi se mogli pripisati ispitivanoj supstanci, a niska doza ne treba da izaziva nikakve primetne štetne efekte kod roditelja ili potomaka. Kada se daje prisilnim hranjenjem ili kao kapsula, doza koja se daje svakoj životinji mora se odrediti prema njenoj telesnoj masi i podešavati svake nedelje prema promenama telesne mase. Doze za gravidne ženke mogu se određivati prema telesnoj masi nultog ili šestog dana graviditeta, ako je poželjno.

1.6.1.5. Ispitivanje granične doze

U slučaju supstance sa niskom toksičnošću, ako dozni nivo od najmanje 1.000 mg/kg ne proizvodi nikakav dokaz interferencije sa reprodukcijom, ispitivanja pri drugim doznim nivoima nisu neophodna. Ako preliminarno ispitivanje pri visokom doznom nivou sa jasnim dokazom toksičnosti po majku ne pokaže štetne efekte na plodnost, nisu neophodna ispitivanja drugih doznih nivoa.

1.6.2. Izvođenje ispitivanja

1.6.2.1. Eksperimentalni rasporedi

Dnevno doziranje roditeljskih (P) mužjaka treba početi kad su stari oko pet do devet nedelja, a nakon što su odbijeni od sise i aklimatizovani najmanje pet dana. Kod pacova doziranje se nastavlja 10 nedelja pre perioda parenja (kod miševa osam nedelja). Mužjake treba žrtvovati i pregledati ili na kraju perioda parenja ili se, alternativno, mužjaci mogu zadržati na eksperimentalnoj ishrani za moguću produkciju drugog legla i usmrtiti i pregledati negde pre kraja studije. Doziranje roditeljskih (P) ženki treba početi posle najmanje pet dana aklimatizacije i nastaviti najmanje dve nedelje pre parenja. Dnevno doziranje P ženki nastavlja se tokom perioda parenja od tri nedelje, graviditeta i do odbijanja od sisa F1 potomaka. Potrebno je razmotriti modifikaciju rasporeda doziranja na osnovu drugih podataka o ispitivanoj supstanci, kao što su podaci o indukciji metabolizma ili bioakumulaciji.

1.6.2.2. Postupak parenja

U ispitivanju reproduktivne toksičnosti primenjuje se parenje 1:1 (jedan mužjak s jednom ženkom) ili 1:2 (jedan mužjak s dve ženke).

Kod postupka parenja 1:1, jedna ženka se smešta s istim mužjakom do pojave graviditeta ili posle isteka perioda od tri nedelje. Svakog jutra ženka se pregleda na prisutnost sperme ili vaginalnog čepa. Nulti dan graviditeta definiše se kao dan kada je utvrđena prisutnost sperme ili vaginalnog čepa.

Parove koji ne uspeju da se spare treba proceniti kako bi se utvrdio uzrok neplodnosti.

Taj postupak može da uključi procedure kao što su dodatna mogućnost parenja sa drugim plodnim mužjacima ili ženkama, mikroskopski pregled reproduktivnih organa i ispitivanja ciklusa "estrusa" ili spermatogeneze.

1.6.2.3. Veličine legla

Životinjama koje su primale supstancu tokom ispitivanja plodnosti dozvoljava se normalno koćenje i podizanje mladih do stadijuma odbijanja od sise, bez standardizacije legla.

Tamo gde se primenjuje standardizacija preporučuje se sledeća procedura: između prvog i četvrtog dana posle rođenja veličina legla se može podesiti odstranjivanjem prekobrojnih mladunaca selekcijom kako bi se postiglo, što je približnije moguće, veličina od četiri mužjaka i četiri ženke po leglu. Ako broj mužjaka ili ženki ne dopušta selekciju od četiri mladunca svakog pola po leglu, prihvatljivo je i delimično sastavljanje (npr. pet mužjaka i tri ženke). Prilagođavanje se ne obavlja u leglima s manje od osam mladih.

1.6.2.4. Posmatranja

Tokom perioda ispitivanja potrebno je bar jednom dnevno posmatrati svaku životinju. Promene ponašanja, znaci teškog ili produženog koćenja i svi znaci toksičnosti, uključujući i mortalitet, moraju biti zabeleženi. Za vreme perioda pred parenje i perioda parenja potrebno je dnevno obavljati merenje potrošnje hrane. Posle koćenja i za vreme dojenja merenje potrošnje hrane (i vode, ako se ispitivana supstanca daje u vodi za piće) treba obavljati istog dana kad i merenje mase legla. Telesna masa P mužjaka i ženki treba da se meri prvog dana doziranja, a posle toga jednom nedeljno. Ova zapažanja treba navesti za svaku odraslu životinju pojedinačno.

Trajanje gestacije računa se od nultog dana graviditeta. Svako leglo treba pregledati što je moguće pre po porođaju, kako bi se utvrdio broj i pol mladih, mrtvorođenih, živih mladih i prisutnost većih anomalija.

Mrtvorođene i mladunce koji su žrtvovani četvrtog dana treba sačuvati i ispitati kako bi se utvrdili mogući defekti. Živi mladunci se prebrojavaju i meri se masa legla jutro posle rođenja i četvrtog i sedmog dana, a posle toga jednom nedeljno, sve do završetka studije, kada se životinje mere pojedinačno. Beleže se fizičke ili abnormalnosti u ponašanju kod ženki ili mladunaca.

1.6.2.5. Patologija

1.6.2.5.1. Postmortalni pregled

U vreme žrtvovanja ili smrti tokom ispitivanja životinje P generacije treba makroskopski pregledati kako bi se utvrdile strukturne abnormalnosti ili patološke promene, s posebno posvećenom pažnjom na pregled organa reproduktivnog sistema. Mrtve ili umiruće mladunce treba pregledati kako bi se uočili defekti.

1.6.2.5.2. Histopatologija

Jajnici, uterus, cerviks, vagina, testisi, epididimisi, semene kesice, prostata, koagulišuća žlezda, hipofiza i ciljni organ(i) svih P životinja treba da se sačuvaju za mikroskopski pregled. U slučaju da se ti organi ne pregledaju u ispitivanjima drugih doznih nivoa, potrebno ih je mikroskopski pregledati kod svih životinja izloženih visokim dozama i kod kontrolnih životinja i onih koje su uginule tokom studije kada je izvodljivo.

Organe koji pokazuju abnormalnosti kod tih životinja treba pregledati i kod svih drugih P životinja. Tom prilikom potrebno je izvršiti mikroskopski pregled svih tkiva koja pokazuju veće patološke promene. Kao što je preporučeno kod postupka parenja, reproduktivni organi životinja kod kojih postoji sumnja na neplodnost moraju se podvrgnuti mikroskopskom pregledu.

2. PODACI

Podaci se navode tabelarno, tako da se za svaku ispitivanu grupu navodi: broj životinja na početku ispitivanja, broj plodnih mužjaka, broj gravidnih ženki, tipovi promena i procenat životinja koje pokazuju svaki tip promene.

Kada je moguće, numerički rezultati se ocenjuju pomoću odgovarajuće statističke metode. Može se primeniti bilo koja prihvaćena statistička metoda.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

Izveštaj o ispitivanju, ako je moguće, sadrži podatke o:

- vrsti/soju;

- toksičnom odgovoru po polu i dozi, uključujući plodnost, gestaciju i viabilitet;

- vremenu smrti tokom studije ili da li su životinje preživele do trenutka predviđenog žrtvovanja ili završetka ispitivanja;

- tabeli sa podacima o telesnoj masi svakog legla, srednja vrednost: masa mladunaca i pojedinačna telesna masa mladunaca na kraju ispitivanja;

- toksičnim ili drugim efektima na reprodukciju, potomke ili postnatalni rast;

- danu utvrđivanja svakog abnormalnog znaka i njegovog daljeg toka;

- telesnoj masi P životinja;

- nalazima obdukcije;

- detaljan opis svih mikroskopskih nalaza;

- statističkoj obradi rezultata, gde je moguće;

- obrazloženju rezultata;

- tumačenju rezultata.

3.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Videti Opšti uvod.

4. LITERATURA

Videti Opšti uvod.

B.35. ISPITIVANJE TOKSIČNOSTI PO REPRODUKCIJU NA DVE GENERACIJE

1. METODA ISPITIVANJA

Ova metoda potpuno odgovara metodi OECD: TG 416 (2001).

1.1. UVOD

Ova metoda ispitivanja reprodukcije na dve generacije namenjena je da obezbedi opšte podatke u vezi efekata ispitivane supstance na integritet i učinak muških i ženskih reproduktivnih sistema, uključujući funkciju polnih žlezda, estrus ciklus, parenje, začeće, gestaciju, porođaj, laktaciju i odbijanje od sise i rast i razvoj potomstva. Studija može da pruži i podatke o efektima ispitivane supstance na neonatalni morbiditet, mortalitet i preliminarne podatke o prenatalnoj i postnatalnoj toksičnosti po rast i razvoj i da usmeri buduća ispitivanja. Pored proučavanja rasta i razvoja F1 generacije, ova eksperimentalna metoda se predviđa i za procenu integriteta i sposobnosti muških i ženskih reproduktivnih sistema, kao i rasta i razvoja F2 generacije. Za dodatne podatke o toksičnosti po rast i razvoj i funkcionim nedostacima, u ovaj protokol mogu se uključiti dodatni segmenti ispitivanja, konsultujući metode za toksičnost po rast i razvoj i/ili neurotoksični efekti za rast i razvoj neurotoksičnost u periodu rasta i razvoja, ako odgovara, ili se ovi efekti mogu proučavati u posebnim studijama, koristeći odgovarajuće eksperimentalne metode.

1.2. PRINCIP METODE

Ispitivana supstanca se daje u rastućim dozama muškim i ženskih jedinkama u grupama. Mužjacima P generacije daju se doze za vreme rasta i tokom bar jednog celog ciklusa spermatogeneze (približno 56 dana kod miševa i 70 dana kod pacova) kako bi se izazvali svi štetni efekti na spermatogenezu. Efekti na spermu se određuju brojnim parametrima sperme (npr. morfologija i pokretljivost spermatozoida) i pripremom tkiva i detaljnom histopatologijom. Ukoliko postoje podaci o spermatogenezi iz prethodne studije koja je trajala dovoljno dugo i u kojoj je primenjeno ponovljeno doziranje, npr. 90-dnevna studija, mužjake P generacije nije potrebno uključiti u procenu. Preporučuje se da uzorci ili digitalni snimci spreme P generacije budu sačuvani kako bi se omogućila kasnija procena. Ženke P generacije treba dozirati tokom rasta i tokom nekoliko estrus ciklusa kako bi se uočili bilo kakvi štetni efekti ispitivane supstance na normalnost estrus ciklusa. Ispitivana supstanca se daje roditeljskim (P) životinjama za vreme parenja, za vreme graviditeta koji su usledili i tokom odbijanja od sise njihovog F1 potomstva. Po odbijanju od sise nastavlja se sa davanjem supstance F1 potomstvu tokom njihovog rasta do odraslog doba, parenja i produkcije F2 generacije, sve dok F2 generacija ne bude odbijena od sise.

Obavljaju se klinička opažanja i patološki pregledi na svim životinjama kako bi se utvrdili znakovi toksičnosti sa posebnim naglaskom na efekte na integritet i sposobnost muških i ženskih reproduktivnih sistema i rast i razvoj potomstva.

1.3. OPIS METODE

1.3.1. Izbor životinjskih vrsta

Preporučena vrsta za ispitivanje je pacov. Ukoliko se koriste druge vrste, treba dati opravdanje, a neophodne su i odgovarajuće izmene metode. Ne treba koristiti sojeve sa slabom plodnošću ili one sa poznatom visokom učestalošću pojave nedostataka u rastu i razvoju. Na početku studije varijacija u telesnoj masi životinja koje se koriste mora biti minimalna i ne sme da prelazi 20% srednje telesne mase za svaki pol.

1.3.2. Uslovi smeštaja i ishrane

Temperatura u eksperimentalnoj prostoriji za životinje treba da bude 22°C (±3°C). Relativna vlažnost mora da bude najmanje 30%, i po mogućnosti da ne prelazi 70%, osim za vreme čišćenja prostorije. Idealna vlažnost treba da bude 50% do 60%. Osvetljenje treba da bude veštačko, uz izmenu 12 sati svetla i 12 sati mraka. Za hranjenje se može koristiti uobičajena laboratorijska ishrana uz neograničenu količinu vode za piće. Izbor ishrane može da bude pod uticajem potrebe da se obezbedi odgovarajuća mešavina ispitivane supstance koja se primenjuje ovom metodom.

Životinje mogu biti smeštene pojedinačno ili u kavezima u malim grupama istog pola. Parenje se obavlja u odgovarajućim kavezima. Posle dokazane kopulacije, sparene ženke treba smestiti pojedinačno u kaveze za porođaj ili materinstvo. Spareni pacovi mogu se držati u malim grupama i odvojeni jedan ili dva dana pre koćenja. Sparenim životinjama treba obezbediti određeni odgovarajući materijal za gnežđenje neposredno pre porođaja.

1.3.3. Priprema životinja

Koriste se zdrave mlade životinje koje su se aklimatizovale na laboratorijske uslove tokom najmanje pet dana i koje nisu bile podvrgnute prethodnim eksperimentalnim postupcima. Eksperimentalne životinje treba okarakterisati prema vrsti, soju, izvoru, polu, telesnoj masi i/ili starosti. Kako bi se izbeglo parenje srodnih životinja mora biti poznato bilo koje srodstvo među životinjama. Životinje se slučajnim izborom razvrstavaju u kontrolne ili tretirane grupe (preporučuje se stratifikacija po telesnoj masi). Kaveze treba rasporediti tako da se smanje mogući efekti rasporeda kaveza. Svakoj životinji treba pripisati jedinstveni identifikacioni broj. Za P generaciju ovo se radi pre početka doziranja. Za F1 generaciju ovo se radi prilikom odbijanja od sise za životinje koje su odabrane za parenje. Podaci o leglu iz kog potiče životinja čuvaju se za sve izabrane F1 životinje. Pojedinačna identifikacija mladunaca odmah posle rođenja preporučuje se prilikom individualnog merenja mladunaca ili prilikom razmatranja bilo kakvog funkcionalnog ispitivanja.

Roditeljske (P) životinje treba da budu stare oko pet do devet nedelja na početku doziranja. Životinje svih eksperimentalnih grupa treba da budu, koliko je izvodljivo, ujednačene telesne mase i starosti.

1.4. POSTUPAK

1.4.1. Broj i pol životinja

Svaka eksperimentalna i kontrolna grupa mora da ima dovoljan broj životinja kako bi se dobilo ne manje od 20 gravidnih ženki na porođaju ili pred porođaj. Za supstance koje uzrokuju neželjene efekte tokom tretmana (npr. sterilnost, izražena toksičnost pri visokim dozama), ovo nije moguće. Cilj je da se dobije dovoljno trudnoća kako bi se obezbedila značajna ocena potencijala supstance da utiče na plodnost, trudnoću i materinsko ponašanje, sisanje, rast i razvoj F1 potomstva od začeća do zrelosti, kao i na rast i razvoj njihovog potomstva (F2) do odbijanja od sise. Ako se ne postigne željeni broj gradivnih životinja (odnosno 20) studija se ne smatra obavezno neodgovarajućom i treba je proceniti od slučaja do slučaja.

1.4.2. Priprema doza

Preporučuje se da se ispitivana supstanca daje peroralno (putem hrane, vode za piće ili sondom), osim ukoliko se neki drugi put primene (npr. dermalno ili inhalaciono) ne smatra prikladnijim.

Kada je potrebno, ispitivana supstanca se rastvara ili suspenduje u odgovarajućem vehikulumu. Preporučuje se da se, kada god je moguće, koristi vodeni rastvor/suspenzija, a zatim da se razmotri rastvor/emulzija u ulju (npr. kukuruzno ulje) i zatim rastvor u nekom drugom vehikulumu. Za vehikulume koji nisu voda moraju biti poznate toksične karakteristike. Potrebno je odrediti stabilnost ispitivane supstance u vehikulumu.

1.4.3. Doziranje

Koristi se najmanje tri dozna nivoa i istovremena kontrola. Osim ukoliko nije ograničena fizičkom i hemijskom prirodom ili biološkim efekatima ispitivane supstance, treba odabrati najveći dozni nivo sa ciljem da se izazove toksičnost ali ne smrt ili teška patnja. U slučaju neočekivane smrtnosti, studija sa stopom smrtnosti od manje od 10% kod roditeljskih (P) životinja još uvek je prihvatljiva. Opadajući niz doznih nivoa treba odabrati tako da se pokaže bilo kakav efekat povezan sa doziranjem i nivoom doza pri kojima se ne primećuju štetni efekti (NOAEL). Često su optimalni dvostruki do četvorostrukih intervala za postavljanje opadajućih doznih nivoa, a dodatak četvrte eksperimentalne grupe je često prihvatljiviji od korišćenja vrlo velikih intervala (npr. više od faktora 10) između doziranja. Za studije ishrane intervali doza ne smeju biti veći od trostrukih. Nivoe doza treba odabrati uzimajući u obzir bilo koje postojeće podatke o toksičnosti, posebno rezultate iz studija s ponovljenim doziranjem. Treba uzeti u obzir bilo koje raspoložive podatke o metabolizmu i kinetici ispitivanog jedinjenja ili sličnih materijala. Ovi podaci pomažu u pokazivanju adekvatnosti režima doziranja.

Kontrolna grupa treba da bude netretirana grupa ili grupa sa vehikulumom ukoliko se on koristi za primenu ispitivane supstance. Osim tretmana sa ispitivanom supstancom, životinje u kontrolnim grupama treba tretirati na identičan način kao i jedinke iz tretiranih grupa ispitivanja. Ukoliko se koristi vehikulum, kontrolna grupa dobija vehikulum u najvećoj zapremini koja se koristi. Ukoliko se ispitivana supstanca daje putem hrane i uzrokuje smanjeno uzimanje ili iskoristljivost hrane, korišćenje kontrolne grupe za unos hrane može se smatrati neophodnim. Alternativno, podaci iz kontrolisanih studija namenjenih za ocenjivanje efekata smanjene potrošnje hrane na reproduktivne parametre mogu se koristiti umesto istovremene kontrolne grupe za unos hrane.

Treba uzeti u obzir sledeće karakteristike vehikuluma i drugih aditiva: efekti na apsorpciju, raspodelu, metabolizam ili zadržavanje ispitivane supstance; efekte na hemijske osobine ispitivane supstance koje mogu izmeniti njena toksična svojstva i efekte na potrošnju hrane ili vode, ili na nutritivni status životinja.

1.4.4. Ispitivanje granične doze

Ukoliko se u oralnoj studiji pri jednom doznom nivou od najmanje 1.000 mg/kg TM/dan ili, za primenu putem hrane ili vode odgovarajući procenat koji se koristi u postupku opisanom u ovoj studiji, ne uzrokuje uočljive toksične efekte kod roditeljskih životinja ili njihovog potomstva, i ako se toksičnost ne može očekivati na osnovu podataka iz strukturno i/ili metabolički sličnih jedinjenja, nije neophodna cela studija uz korišćenje nekoliko doznih nivoa. Primenjuje se ispitivanje granične doze, osim u slučaju kad izloženost ljudi ukazuje na potrebu za korišćenjem viših nivoa oralne doze. Za druge načine primene kao što su inhalacija i dermalna primena, fizička i hemijska svojstva ispitivane supstance, kao što su rastvorljivost, često mogu ukazati na granicu najvećeg ostvarljivog nivoa izlaganja.

1.4.5. Primena doza

Životinje se doziraju ispitivanom supstancom sedam dana u nedelji. Preporučuje se oralna primena (hrana, piće ili sonda). Ukoliko se koristi neki drugi put primene, to treba opravdati i učiniti potrebne izmene. Sve životinje moraju biti dozirane na isti način tokom odgovarajućeg perioda ispitivanja. Kad se ispitivana supstanca primenjuje sondom, primena se obavlja putem trbušne cevi. Zapremina primenjene tečnosti ne sme preći 1 ml/kg TM (0,4 ml/100 g TM najviše za kukuruzno ulje), osim u slučaju vodenih rastvora gde se može koristiti 2 ml/100 g TM. Osim kod iritabilnih i korozivnih supstanci koje pokazuju lošije efekte u većim koncentracijama, varijabilnost zapremine koja se primenjuje treba minimalizovati prilagođavanjem koncentracije kako bi se obezbedila konstantna zapremina pri svim doznim nivoima. Kod prisilnog hranjenja mladunci primaju eksperimentalnu supstancu kroz mleko, sve dok se ne mogu direktno dozirati posle odbijanja od sise. Kada se supstanca primenjuje putem hrane ili vode za piće, mladunci dodatno primaju ispitivanu supstancu čim počnu samostalno da se hrane za vreme poslednje nedelje perioda laktacije.

Kod supstance koja se daje putem hrane ili vode za piće, važno je obezbediti da količina primenjene ispitivane supstance ne utiče na balans normalne ishrane ili vode. Kad se ispitivana supstanca daje putem hrane, može se koristiti stalna prehrambena koncentracija (ppm) ili stalni dozni nivo prema telesnoj masi životinje. Alternativne metode moraju biti obrazložene. Ukoliko se supstanca daje prisilno, doza treba da bude primenjena u slično vreme svakog dana i prilagođena najmanje nedeljno kako bi se održao konstantni dozni nivo u odnosu na telesnu masu životinje. Podatke o placentalnoj raspodeli treba uzeti u obzir prilikom prilagođavanja prisilne doze zasnovane na telesnoj masi.

1.4.6. Eksperimentalni rasporedi

Dnevno doziranje roditeljskih (P) mužjaka i ženki treba započeti kad su stari pet do devet nedelja. Dnevno doziranje F1 mužjaka i ženki započinje po odbijanju od sise. Treba imati na umu da u slučaju primene ispitivane supstance putem hrane ili vode za piće, direktno izlaganje F1 mladunaca ispitivanoj supstanci može započeti već za vreme perioda laktacije. Za oba pola (P i F1), doziranje treba nastaviti najmanje 10 nedelja pre perioda parenja. Doziranje se nastavlja za oba pola za vreme dvonedeljnog perioda parenja. Muške jedinke treba humano žrtvovati i pregledati kada više ne budu potrebne za ocenjivanje reproduktivnih efekata. Za roditeljske (P) ženke, doziranje treba nastaviti tokom trudnoće i sve do odbijanja od sise F1 potomaka. Treba uzeti u obzir modifikacije u rasporedu doziranja na osnovu raspoloživih podataka o ispitivanoj supstanci, uključujući postojeće podatke o toksičnosti, indukciji metabolizma ili bioakumulaciji. Doza za svaku životinju treba da bude zasnovana na najskorijim merenjima telesne mase. Treba obratiti pažnju prilikom prilagođavanja doze tokom poslednjeg tromesečja trudnoće.

Tretiranje P i F1 mužjaka i ženki nastavlja se do žrtvovanja. Sve P i F1 odrasle mužjake i ženke treba humano žrtvovati kada više nisu potrebni za procenu reproduktivnih efekata. F1 potomstvo koje nije odabrano za parenje i čitavo F2 potomstvo treba humano žrtvovati posle odbijanja od sise.

1.4.7. Postupak parenja

1.4.7.1. Roditeljsko (P) parenje

Za svako parenje svaku ženku treba smestiti sa jednim mužjakom iz istog doznog nivoa (1:1 parenje) sve dok ne dođe do kopulacije ili dok ne proteknu dve nedelje. Ženke se svaki dan pregledaju na prisutnost sperme ili vaginalnog čepa. Nulti dan trudnoće definiše se kao dan kad se pronađe sperma ili vaginalni čep. U slučaju da parenje nije uspešno, može se razmotriti ponovno parenje ženki sa dokazanim mužjacima iz iste grupe. Parovi moraju biti jasno naznačeni u podacima. Parenje srodnih jedinki treba izbegavati.

1.4.7.2. F1 parenje

Za parenje F1 potomstva izabere se najmanje jedan mužjak i jedna ženka pri odbijanju od sise iz svakog legla za parenje sa drugim mladuncima iz istog doznog nivoa ali iz drugog legla, kako bi se proizvela F2 generacija. Izbor mladunaca iz svakog legla mora biti slučajan ukoliko se ne uoče značajne razlike u telesnoj masi ili izgledu između jedinki u leglu. U slučaju da se takve razlike uoče, biraju se najbolji predstavnici svakog legla. Ovo se najbolje obavlja na osnovu telesne mase ali može biti pogodnije da se obavi na osnovu izgleda. F1 potomstvo ne treba pariti sve dok ne dostigne punu seksualnu zrelost.

Parovi bez potomaka pregledaju se kako bi se utvrdio uzrok neplodnosti. To može uključivati postupke kao što su: dodatne prilike za parenje sa drugim dokazanim jedinkama, mikroskopski pregled reproduktivnih organa i ispitivanje estrus ciklusa ili spermatogeneze.

1.4.7.3. Drugo parenje

U nekim slučajevima, kao što su promene u veličini legla povezane sa tretmanom ili uočavanje sumnjivog efekta za vreme prvog parenja, preporučuje se da se P ili F1 odrasle jedinke ponovo pare kako bi se proizvelo drugo leglo. Preporučuje se da se ponovno pare mužjaci ili ženke koje nisu proizvele potomstvo s dokazanim priplodnim životinjama suprotnog pola. Ukoliko se smatra da je drugo leglo neophodno u bilo kojoj generaciji, životinje treba ponovno pariti približno jednu nedelju posle odbijanja od sise prethodnog legla.

1.4.7.4. Veličina legla

Životinjama treba omogućiti da imaju normalna legla i da odgajaju svoje potomstvo do odbijanja od sise. Standardizacija veličine legla nije obavezna. Ako se izvodi standardizacija, korišćenu metodu treba detaljno opisati.

1.5. POSMATRANJA

1.5.1. Klinička posmatranja

Svakog dana treba obavljati opšta klinička posmatranja, a u slučaju prisilnog hranjenja njegov vremenski raspored treba da uzme u obzir predviđeno vreme za pojavu maksimalnih efekata posle doziranja. Promene u ponašanju, znaci teškog ili dugotrajnog koćenja i svi znaci toksičnosti moraju se zabeležiti. Detaljniji pregled svake životinje treba obaviti najmanje jednom nedeljno i najbolje ga je obavljati prilikom merenja telesne mase životinja. Dva puta dnevno, a tokom vikenda jednom dnevno, kad odgovara, sve životinje treba pregledati na morbiditet i smrtnost.

1.5.2. Telesna masa i konzumiranje, hrane/vode roditeljskih životinja

Telesna masa roditeljskih životinja (P i F1) meri se prvog dana doziranja i najmanje jednom nedeljno posle toga. Telesna masa roditeljskih ženki (P i F1) meri se najmanje nultog, sedmog, četrnaestog, dvadesetog ili dvadeset prvog dana gestacije, kao i za vreme laktacije u iste dane kada se meri masa legla i na dan kad se životinje žrtvuju. Ova opažanja treba navesti pojedinačno za svaku odraslu životinju. Pre parenja i u periodu gestacije potrošnja hrane se meri najmanje jednom nedeljno. Unos vode meri se najmanje jednom nedeljno ukoliko se ispitivana supstanca primenjuje putem vode.

1.5.3. Estrus ciklus

Dužina i normalnost estrus ciklusa ocenjuju se za P i F1 ženke vaginalnim brisevima pre parenja i po izboru za vreme parenja, dok se ne pronađu dokazi parenja. Kod dobijanja vaginalnih/cervikalnih ćelija, treba paziti kako bi se izbeglo nadraživanje (prekidanje, perturbacija, poremećaj) sluznice i potom izazivanje lažne trudnoće1.

1.5.4. Parametri sperme

Za sve P i F1 mužjake prilikom žrtvovanja beleži se masa testisa i epididimisa i po jedan od organa se čuva za histopatološki pregled (videti odeljke 1.5.7. i 1.5.8.1. ove metode). Od podskupa od najmanje deset mužjaka iz svake grupe P i F1 mužjaka preostali testisi i epididimisi se koriste za prebrojavanje spermatida otpornih na homogenizaciju i rezerve spermatozoida kaudalnog dela epididimisa. Iz iste podgrupe mužjaka spermatozoide iz kaude epididimidisa ili vas deferens-a treba prikupiti zbog ocenjivanja njihove mobilnosti i morfologije. Ukoliko se uoče efekti u vezi sa tretmanom ili kada postoje dokazi o tome iz drugih studija o mogućim efektima na spermatogenezu, ocenjivanje spermatozoida treba obaviti kod svih mužjaka u svakoj doznoj grupi. U protivnom se brojanje može ograničiti na P i F1 mužjake iz kontrolne i visokodozne grupe.

Potrebno je izbrojati ukupni broj spermatida testisa otpornih na homogenizaciju i spermatozoida kaudalnog dela epididimisa2, 3. Kaudalne rezerve spermatozoida mogu se izvesti iz koncentracije i zapremine sperme u suspenziji korišćenoj za kompletiranje kvalitativnih ocenjivanja i broja spermatozoida dobijenog kasnijim mlevenjem i/ili homogenizaciom preostalog kaudalnog tkiva. Brojanje treba obaviti na odabranoj podgrupi mužjaka iz svih doznih grupa odmah nakon žrtvovanja životinja, osim ako se ne naprave video ili digitalni snimci ili ako se primerci ne zamrznu i analiziraju kasnije. U tim slučajevima kontrolne i grupe velikih doza mogu se prve analizirati. Ukoliko se ne uoče efekti u vezi sa tretmanom (npr. efekti na broj spermatozoida, pokretljivost ili morfologiju), preostale grupe nije potrebno analizirati. Kada se takvi efekti uoče u grupi visoke doze, onda se moraju oceniti i grupe nižih doza.

Pokretljivost epididimalnih (ili ductus deferens) spermatozoida treba oceniti ili snimiti odmah nakon žrtvovanja. Spermu se pribavlja uz minimalnu štetu i razblažuje za analizu pokretljivosti korišćenjem prihvatljivih metoda4. Procenat progresivno pokretljivih spermatozoida određuje se subjektivno ili objektivno. Kada se obavlja kompjuterska analiza pokretljivosti5, 6, 7, 8, 9, 10 izvođenje progresivne pokretljivosti se oslanja na korisnički definisane granične vrednosti za prosečnu brzinu i pravac putanje ili na linearni indeks. Ukoliko su uzorci snimljeni11 ili ukoliko postoje slike zabeležene na drugačiji način u trenutku obdukcije, može se obaviti kasnija analiza P i F1 mužjaka samo iz kontrolne i grupe s visokom dozom, osim ukoliko se ne uoče efekti vezani za tretman. U tom slučaju se moraju analizirati i grupe nižih doza. Ukoliko nema video ili digitalnog zapisa svi uzorci u svim tretiranim grupama moraju se analizirati pri postmortalnom pregledu.

Treba uraditi morfološku analizu uzorka spermatozoida iz epididimidisa (ili vas deferens-a). Spermatozoide (najmanje 200 po uzorku) treba analizirati kao fiksirani, mokri preparat12 i klasifikovati kao normalne ili abnormalne. Primeri morfološke abnormalnosti spermatozoida uključuju fuziju, izolovane glave i deformisane glave i/ili repove. Ocenjivanje se obavlja na odabranoj podgrupi mužjaka svih doznih grupa, bilo odmah nakon žrtvovanja životinja ili kasnije na osnovu video ili digitalnih snimaka. Jednom fiksirani razmazi mogu se čitati i kasnije. U tim slučajevima mogu se prvo analizirati kontrolne i grupe visokih doza.

Ukoliko se ne uoče efekti u vezi sa tretmanom (npr. efekti na morfologiju spermatozoida), preostale grupe nije potrebno analizirati. Kada se takvi efekti uoče kod grupe visoke doze, onda i grupe nižih doza moraju da se ocenjuju.

Ukoliko je bilo koji od gore navedenih parametara za ocenjivanje sperme već ispitan kao deo studije sistemske toksičnosti koja traje najmanje 90 dana, takve analize nije neophodno ponavljati u studiji na dve generacije. Preporučuje se da se sačuvaju uzorci ili digitalni snimci sperme P generacije, kako bi se po potrebi omogućila kasnija analiza.

1.5.5. Potomstvo

Svako leglo treba pregledati što je moguće pre nakon koćenja (dan laktacije 0) kako bi se ustanovio broj i pol mladunaca, mrtvorođeni, živorođeni i prisutnost većih anomalija. Mladunce koji su pronađeni mrtvi na dan 0, ukoliko nisu macerirani, treba pregledati kako bi se otkrili mogući defekti i uzrok smrti i treba ih sačuvati. Žive mladunce treba prebrojati i izmeriti telesnu masu svakog pojedinačno, po rođenju (dan laktacije 0) ili na dan 1 i danima koji su redovno predviđeni za merenje telesne mase, npr. dani 4, 7, 14. i 21. dan laktacije. Beleže se fizičke ili anomalije u ponašanju uočene na majkama ili potomstvu.

Fizički razvoj potomstva beleži se pre svega prema dobijanju na telesnoj masi. Drugi fizički parametri (npr. otvaranje uha i oka, izbijanje zuba, rast dlake) mogu dati dodatne podatke, ali je ove podatke najbolje ocenjivati u kontekstu podataka o polnom sazrevanju (npr. starost i telesna masa prilikom otvaranja vagine ili balano-prepucijalne separacije)13. Funkcionalna ispitivanja (npr. motorike, senzorne funkcije, ontogenog refleksa) F1 potomstva pre i/ili posle odbijanja od sise, posebno ona vezana uz polno sazrevanje preporučuju se ukoliko nisu uključena u posebne studije. Starost prilikom sazrevanja vagine i prepucijalne separacije treba utvrditi za F1 mladunce koji se odbijaju od sise, a koji su odabrani za parenje. Anogenitalno rastojanje treba izmeriti nultog postnatalnog dana kod F2 mladunaca ukoliko je izazvano alteracijama u odnosu polova u F1 ili vremenu polnog sazrevanja.

Funkcionalna posmatranja mogu da se izostave kod grupa koje na drugi način pokazuju jasne znake štetnih efekata (npr. značajno smanjenje u dobijanju na telesnoj masi, itd.). Ukoliko se rade funkcionalna istraživanja, ne treba ih izvoditi na mladuncima koji su odabrani za parenje.

1.5.6. Postmortalni pregled

Prilikom zaključivanja ili smrti i toku studije, sve roditeljske životinje (P i F1), sve mladunce sa spoljnjim abnormalnostima ili kliničkim znacima, kao i jedno slučajno odabrano mladunče po polu po leglu iz F1 i F2 generacije, treba makroskopski pregledati kako bi se uočile bilo kakve strukturne abnormalnosti ili patološke promene. Treba posvetiti posebnu pažnju organima reproduktivnog sistema. Humano žrtvovane mladunce nađene na samrti i mrtvu mladunčad, kada nisu macerirana, treba ispitati na moguće defekte i/ili uzrok smrti i sačuvati.

Materice svih ženki koje su jednom rađale treba pregledati na prisustvo i broj implantacionih mesta na način koji ne kompromituje histopatološko ocenjivanje.

1.5.7. Merenje mase organa

Prilikom zaključivanja utvrđuje se telesna masa i masa sledećih organa za sve P i F1 roditeljske životinje (parni organi se mere individualno):

- materica, jajnici;

- testisi, epididimidis (ukupno i kauda);

- prostata;

- semene kesice sa koagulacionim žlezdama i njihove tečnosti i prostata (kao jedna jedinica);

- mozak, jetra, bubrezi, slezina, hipofiza, tiroidna i adrenalne žlezde i poznati ciljni organi.

Utvrđuje se terminalna telesna masa za F1 i F2 mladunce koji su odabrani za obdukciju. Mere se sledeći organi od jednog slučajno odabranog mladunca po polu po leglu (videti odeljak 1.5.6. ove metode): mozak, slezina i timus.

Rezultate obdukcije i merenja mase organa treba proceniti u kontekstu sa zapažanjima iz drugih studija sa ponovljenim dozama, kada je izvodljivo.

1.5.8. Histopatološka ispitivanja

1.5.8.1. Roditeljske životinje

Sledeći organi i tkiva roditeljskih (P i F1) životinja ili reprezentativni uzorci istih se fiksiraju i čuvaju u odgovarajućem medijumu za histopatološku analizu:

- vagina, materica sa cerviksom i jajnici (sačuvani u odgovarajućem fiksativu);

- jedan testis (sačuvan u Bouin-ovom ili sličnom fiksativu), jedan epididimis, semene kesice, prostata i koagulaciona žlezda;

- prethodno identifikovani ciljni organi od svih P i F1 životinja odabranih za parenje.

Potpuna histopatološka ispitivanja gore navedenih sačuvanih organa treba obaviti za sve jedinke iz grupe kojoj je davana visoka doza i kontrolne grupe P i F1 životinja izabranih za parenje. Ispitivanje jajnika P životinja je opcionalno. Organi koji pokazuju promene vezane za tretman treba ispitati u grupama niske i srednje doze kako bi se pomoglo određivanje NOAEL. Reproduktivne organe životinja u grupama s niskim i srednje visokim dozama za koje se sumnja na smanjenu plodnost, npr. onih koje se nisu parile, koje nisu začele, iznele ili rodile zdravo potomstvo ili na čiji je estrus ciklus, broj spermatozoida, mobilnost ili morfologiju bilo uticaja, treba podvrgnuti histopatološkom ocenjivanju. Treba ispitati sva veća oštećenja kao što su atrofija ili tumori.

Treba obaviti detaljni histopatološki pregled testisa (npr. korišćenjem Bouinovog fiksativa, učvršćivanjem parafinom i poprečnim presecima debljine 4 µm do 5 µm) kako bi se identifikovali efekti vezani za tretman kao što su zadržane spermatide, slojevi ili tipovi germinativnih ćelija koji nedostaju, divovske ćelije sa više jedara ili otpadanje spermatogenih ćelija u lumen14. Pregled intaktnog epididimisa treba da uključuje pregled glave, tela i repa što se može postići analizom uzdužnih preseka. Epididimis treba pregledati na infiltraciju leukocita, promene u preovlađujućim tipovima ćelija, nenormalne tipove ćelija i fagocitozu spermatozoida. Bojenje PAS-om i hematoksilinom može se koristiti za pregled muških reproduktivnih organa.

Postlaktacioni jajnik treba da sadrži primordijalne i rastuće folikule kao i velika žuta tela laktacije. Histopatološki pregled treba da otkrije kvalitativno smanjenje populacije primordijalnih folikula. Treba da se obavi kvantitativna analiza primordijalnih folikula za F1 ženke; broj životinja, izbor preseka jajnika i veličina uzorka preseka treba da budu statistički odgovarajući za postupak ocenjivanja koji se koristi. Pregled treba da uključi prebrojavanje primordijalnih folikula koji mogu biti kombinovani sa malim rastućim folikulama zbog poređenja tretiranih i kontrolnih jajnika15, 16, 17, 18, 19.

1.5.8.2. Mladunci odbijeni od sisanja

Izuzetno, nenormalno tkivo i ciljani organi svih mladunaca sa spoljnim abnormalnostima ili kliničkim znacima, kao i oni organi od slučajno odabranog mladunaca po polu po leglu iz obe F1 i F2 generacije, koji nisu odabrani za parenje biće fiksirani i čuvani u odgovarajućem medijumu za histopatološki pregled. Puna histopatološka karakterizacija sačuvanog tkiva obavlja se uz poseban naglasak na organe reproduktivnog sistema.

2. PODACI

2.1. OBRADA REZULTATA

Podaci se navode pojedinačno i tabelarno. Navode se podaci za svaku eksperimentalnu grupu i svaku generaciju i to: broj životinja na početku ispitivanja, broj životinja koje su pronađene mrtve za vreme ispitivanja ili žrtvovane iz humanih razloga, vreme bilo koje smrti ili humanog žrtvovanja, broj plodnih životinja, broj gravidnih ženki, broj životinja koje pokazuju znake toksičnosti, opis uočenih znakova toksičnosti, uključujući, vreme nastanka, trajanje i ozbiljnost toksičnih efekata, tipove zapažanja kod roditelja i potomstva, tipove histopatoloških promena i sve relevantne podatke o leglu.

Numeričke rezultate treba oceniti odgovarajućom opšteprihvaćenom statističkom metodom. Statističke metode treba odabrati prilikom koncipiranja studije i treba ih opravdati. Statistički modeli doza-odgovor mogu biti korisni za analizu podataka. Izveštaj treba da uključi dovoljno podataka o metodi analize i o primenjenom kompjuterskom programu kako bi nezavisni ocenjivač/statističar mogao ponovno da proceni i rekonstruiše analizu.

2.2. OCENJIVANJE REZULTATA

Nalazi ove studije toksičnosti po reprodukciju na dve generacije treba da se ocene u smislu uočenih efekata uključujući obdukcione i mikroskopske nalaze. Ocenjivanje uključuje vezu ili nepostojanje veze između doze ispitivane supstance i prisustva ili odsustva pojave i ozbiljnosti abnormalnosti, uključujući veća oštećenja, identifikovane ciljne organe, efekt na plodnost, kliničke abnormalnosti, efekt na reprodukciju i na legla, promene telesne mase, efekte na smrtnost i sve druge toksične efekte. Prilikom ocenjivanja rezultata ispitivanja treba uzeti u obzir fizička i hemijska svojstva ispitivane supstance i kada su dostupni toksikokinetičke podatke.

Pravilno izvedeno ispitivanje toksičnosti po reprodukciju treba da obezbedi zadovoljavajuću procenu nivoa bez efekta i razumevanje štetnih efekata na reprodukciju, rađanje, laktaciju, postnatalni rast i razvoj, uključujući rast i polni razvoj.

2.3. TUMAČENJE REZULTATA

Ispitivanje toksičnosti po reprodukciju na dve generacije daje podatke o efektima ponovljenog izlaganja supstanci za vreme svih faza reproduktivnog ciklusa. Studija daje podatke o reproduktivnim parametrima i o razvoju, rastu, sazrevanju i preživljavanju potomstva. Rezultati studije tumače se zajedno sa nalazima subhroničkih studija, ispitivanja prenatalnog rasta i razvoja, toksikokinetičkih i drugih raspoloživih studija. Rezultati ove studije mogu se koristiti u proceni potrebe za daljim ispitivanjem hemikalije. Ekstrapolacija rezultata studije na čoveka je prihvatljiva do određenog stepena. Najbolje je da se koriste za obezbeđivanje podataka o nivou bez efekta i za dozvoljeno izlaganje ljudi20, 21, 22, 23.

3. IZVEŠTAJ

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži podatke o:

1) Ispitivanoj supstanci:

- fizička priroda i, ako je relevantno, fizička i hemijska svojstva;

- identifikacioni podaci;

- čistoća.

2) Vehikulumu (ako odgovara):

- opravdanje za izbor vehikuluma ako nije u pitanju voda.

3) Eksperimentalnim životinjama:

- korišćena vrsta/soj;

- broj, starost i pol životinja;

- izvor, uslovi smeštaja, ishrana, materijal za gnežđenje, itd.;

- individualna težina životinja na početku ispitivanja.

4) Uslovima ispitivanja:

- obrazloženje izbora nivoa doze;

- detalji o ispitivanoj supstanci formulacija/priprema hrane, postignute koncentracije;

- stabilnost i homogenost preparata;

- detalji o primeni ispitivane supstance;

- preračunavanje iz koncentracije ispitivane supstance u hrani/vodi za piće (ppm) do postignute doze (mg/kg telesna masa/dan), ako je primenljivo;

- podaci o kvalitetu hrane i vode.

5) Rezultatima:

- potrošnja hrane i vode, ako je dostupno, iskorišćenje hrane (dobijanje na telesnoj masi po gramu konzumirane hrane) i potrošnja ispitivanog materijala za P i F1 životinje, osim za period kohabitacije i za poslednju trećinu perioda laktacije;

- podaci o apsorpciji (ako su dostupni);

- podaci o telesnoj masi za P i F1 životinje koje su izabrane za parenje;

- podaci o masi legla i mladunaca;

- telesna masa pri žrtvovanju i apsolutna i relativna masa organa za roditeljske životinje;

- priroda, ozbiljnost i trajanje kliničkih zapažanja (bilo da su reverzibilni ili ne);

- vreme smrti tokom studije ili da li su životinje preživele do žrtvovanja;

- podaci o toksičkim reakcijama po polu i dozi, uključujući indekse parenja, plodnosti, gestacije, rođenja, održivosti i laktacije; izveštaj treba navesti brojeve korišćene za izračunavanje ovih indeksa;

- toksični i drugi efekti na reprodukciju, potomstvo, postnatalni rast, itd.;

- nalazi obdukcije;

- detaljan opis svih histopatoloških nalaza;

- broj P i F1 životinja sa normalnim ciklusom i trajanje ciklusa;

- ukupni broj spermatozoida kaude epididimis, procenat progresivno pokretljivih spermatozoida, procenat morfološki normalnih spermatozoida i procenat spermatozoida sa svakom identifikovanom abnormalnošću;

- vreme do parenja, uključujući broj dana do parenja;

- trajanje gestacije;

- broj implantacija, žutih tela, veličina legla;

- broj živorođenih i post-implantacioni gubitak;

- broj mladunaca sa većim vidljivim abnormalnostima, ukoliko je određen treba navesti broj kržljavaca;

- podaci o fizičkim obeležjima kod mladunaca i drugi podaci o postnatalnom rastu i razvoju; proučena fizička obeležja moraju biti opravdana;

- podaci o funkcionalnim zapažanjima kod mladunaca i odraslih jedinki, ako je primenljivo;

- statistička analiza rezultata, kad odgovara.

6) Obrazloženju rezultata.

7) Zaključcima, uključujući NOAEL vrednosti za efekte na majku i potomstvo.

4. LITERATURA

1. Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In: Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.

2. Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat. Fundamental and Applied Toxicology 12:92-108.

3. Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats. Journal of Reproduction and Fertility 54:103-107.

4. Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. Reproductive Toxicology 5:39 44

5. Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report. Reproductive Toxicology 10(3):237- 244.

6. Chapin, R.E. et al., (1992). Methods for Assessing Rat Sperm Motility. Reproductive Toxicology 6:267- 273

7. Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In vitro Demonstration. Journal of Andrology 13:409-421.

8. Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations. Reproductive Toxicology 5:449-458.

9. Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In: Methods in Toxicology, Part A., Academic, Orlando, Florida. pp. 319-333.

10. Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10: 401-415.

11. Working, P.K. and M. Hurtt, (1987). Computerized Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andrology 8:330-337.

12. Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491-505.

13. Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biological Reproduction 17:298303.

14. Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.

15. Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida.

16. Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, pp. 421-426.

17. Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989). Test Methods for Assessing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven, New York.

18. Smith, B.J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive Toxicology 5:379-383.

19. Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histology. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston, and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.

20. Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive System. In: Casarett and Doull’s Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull, and C.D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.

21. Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, New York.

22. Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.

23. Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.

B.36. TOKSIKOKINETIKA

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Videti Opšti uvod.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Nisu propisane.

1.4. PRINCIP METODE

Supstanca koja se ispituje primenjuje se odgovarajućim putem. Zavisno od svrhe studije, supstanca može da se daje kao pojedinačna ili u ponovljenoj dozi tokom određenog perioda, jednoj ili više grupa eksperimentalnih životinja. Posle toga, zavisno od tipa ispitivanja određuje se supstanca i/ili metaboliti u telesnim tečnostima, tkivima i/ili ekskretima.

Studija može da se obavi sa "neobeleženim" ili "obeleženim" oblicima supstance koja se ispituje. Kad se koristi oznaka, ona treba da se nalazi u supstanci na takvom mestu da se obezbedi što je moguće više podataka o sudbini jedinjenja.

1.5. KRITERIJUMI KVALITETA

Nisu propisani.

1.6. OPIS METODE

1.6.1. Pripreme

Zdrave mlade odrasle životinje aklimatizuju se na laboratorijske uslove najmanje pet dana pre obavljanja ispitivanja. Pre ispitivanja životinje se slučajnim izborom svrstavaju u grupe za tretiranje. U posebnim slučajevima mogu se koristiti i vrlo mlade, gravidne ili prethodno tretirane životinje.

1.6.2. Eksperimentalni uslovi

1.6.2.1. Eksperimentalne životinje

Toksikokinetička ispitivanja mogu da se izvode na jednoj ili više odgovarajućih životinjskih vrsta. Uzimaju se u obzir vrste koje su korišćene i koje će se koristiti u drugim studijama toksičnosti iste ispitivane supstance. Kad se u ispitivanju koriste glodari, varijacija telesne mase ne sme da prelazi ±20% srednje telesne mase.

1.6.2.2. Broj i pol

Na početku, za ispitivanja apsorpcije i izlučivanja, treba koristiti četiri životinje u svakoj doznoj grupi. Nije obavezan izbor jednog određenog pola, ali pod određenim uslovima potrebno je ispitivanje oba pola. Ukoliko postoje razlike u odgovoru između polova, potrebno je ispitati po četiri životinje svakog pola. U slučaju ispitivanja sa vrstama koje nisu glodari, može da se koristi manji broj životinja. Kada se ispituje raspodela u tkivima, na početku, prilikom određivanja veličine grupe, uzima se u obzir broj životinja koje će se žrtvovati u svakoj vremenskoj instanci (tački) i broj vremenskih instanci koji se ispituje.

Kod ispitivanja metabolizma veličina grupe zavisi od potreba studije. Kod ispitivanja višestrukih doza ili višestrukih vremenskih instanci, veličina grupe zavisi od broja vremenskih tačaka i od planiranih žrtvovanja, ali ne sme da bude manja od dve životinje. Veličina grupe treba da bude dovoljna da obezbedi prihvatljivu karakterizaciju resorpcije, platoa i eliminacije (ako odgovara) supstance koja se ispituje i/ili metabolita.

1.6.2.3. Dozni nivoi

U slučaju primene pojedinačne doze koriste se najmanje dva nivoa doza: niska doza bez toksičnog efekta i visoka doza pri kojoj se mogu pojaviti promene u toksikokinetičkim parametrima ili pri kojoj se javljaju toksični efekti.

U slučaju primene ponovljenog doziranja obično je dovoljna niska doza, ali pod određenim uslovima visoka doza može da bude neophodna.

1.6.2.4. Put primene

U toksikokinetičkim studijama treba koristiti isti put i, kada odgovara, isti vehikulum kao što se koristi ili će biti korišćen u drugim studijama toksičnosti. Ispitivana supstanca se daje grupama eksperimentalnih životinja oralno prisilnim davanjem ili u hrani, nanosi se na kožu ili primenjuje inhalacijom tokom određenih vremenskih perioda. Intravenska primena ispitivane supstance može da bude korisna za utvrđenje relativne apsorpcije kada se supstanca primenjuje drugim putevima. Odmah nakon intravenskog davanja supstance dobijaju se korisni podaci o načinu raspodele.

Mora se uzeti u obzir mogućnost interferencije vehikuluma sa ispitivanom supstancom. Potrebno je posvetiti pažnju razlikama u apsorpciji između primene ispitivane supstance prisilnim davanjem i u hrani i potrebe za tačnim (preciznim) određivanjem doze, posebno kad se supstanca daje putem hrane.

1.6.2.5. Period posmatranja

Sve životinje se moraju svakodnevno posmatrati. Svakodnevno se beleže znaci toksičnosti i drugi relevantni klinički znaci, uključujući vreme njihovog nastupanja, stepen i trajanje.

1.6.3. Postupak

Posle merenja telesne mase, životinjama se odgovarajućim putem primenjuje supstanca koja se ispituje. Ako je relevantno, životinje se stavljaju na gladovanje pre primene supstance koja se ispituje.

1.6.3.1. Apsorpcija

Brzina i stepen apsorpcije primenjene supstance mogu se odrediti korišćenjem različitih metoda, sa i bez referentnih grupaL, na primer:

- određivanjem količine ispitivane supstance i/ili metabolita u ekskretima, kao što su urin, žuč, stolica, izdahnuti vazduh i u ostacima mrtvih životinja;

- poređenjem bioloških reakcija (tj. studije akutne toksičnosti) između tretiranih grupa i kontrolnih i/ili referentnih grupa;

- upoređenjem količine supstance koja je izlučena putem bubrega i/ili metabolita kod tretiranih i referentnih grupa;

- određivanjem površine ispod krive koncentracija u plazmi/vreme između supstance i/ili metabolita i poređenju sa podacima dobijenim od referentne grupe.

_____________
L U ovoj metodi referentna grupa je ona kod koje je supstanca koja se ispituje primenjena drugim putem koji omogućuje potpunu bioraspoloživost doze.

1.6.3.2. Raspodela

Postoje dva pristupa, od kojih se jedan ili oba mogu koristiti za analizu oblika raspodele:

- korisni kvalitativni podaci dobijaju se korišćenjem autoradiografskih tehnika na celom telu;

- kvantitativni podaci dobijaju se žrtvovanjem životinja u različito vreme posle ekspozicije i određivanja koncentracije i količine ispitivane supstance i/ili metabolita u tkivima i organima.

1.6.3.3. Izlučivanje

Kod ispitivanja izlučivanja skupljaju se mokraća, stolica i izdahnuti vazduh, a u nekim slučajevima i žuč. Količinu ispitivane supstance i/ili metabolita u tim izlučevinama treba meriti više puta posle izlaganja ili dok se oko 95% primenjene doze ne izluči ili tokom sedam dana (ukoliko izlučivanje 95% doze traje duže).

U posebnim slučajevima treba uzeti u obzir izlučivanje ispitivane supstance u mleku eksperimentalnih životinja koje doje.

1.6.3.4. Metabolizam

Pogodnim tehnikama analiziraju se biološki uzorci da bi se utvrdio stepen i tip metabolizma. Ukoliko je potrebno dati odgovore na pitanja koja su proizašla iz prethodnih toksikoloških studija, potrebno je razjasniti strukturu metabolita i predložiti odgovarajuće metaboličke puteve. Korisno je obaviti in vitro ispitivanje kako bi se dobili podaci o metaboličkim putevima.

Dodatni podaci o odnosu metabolizma i toksičnosti mogu se dobiti biohemijskim studijama, kao što je određivanje efekata na sisteme enzima koji učestvuju u metabolizmu, smanjenje endogenih neproteinskih sulfidrilnih jedinjenja i vezivanje supstance za makromolekule.

2. PODACI

Podaci se navode tabelarno, u skladu sa tipom izvedene studije, a gde je potrebno, daje se i grafička prezentacija. Za svaku eksperimentalnu grupu navodi se srednja vrednost i statističke varijacije merenja u odnosu na vreme, doziranje, tkiva i organe, kada odgovara. Potrebno je odrediti stepen apsorpcije i količinu i brzine izlučivanja odgovarajućim metodama. Kada se obavljaju ispitivanja metabolizma, navodi se struktura utvrđenih metabolita i mogući metabolički put.

3. IZVEŠTAJ

3.1. IZVEŠTAJ O ISPITIVANJU

U skladu sa tipom izvedenog ispitivanja, izveštaj o ispitivanju, ako je moguće, sadrži podatke o:

- vrsti, soju, izvoru, uslovima sredine, ishrani;

- karakterizaciji obeleženih materijala, ako su upotrebljeni;

- nivoima doza i intervalima davanja;

- putu primene i, ako je korišćen, o vehikulumu;

- toksičnim i drugim uočenim efektima;

- metodi određivanja ispitivane supstance i/ili metabolita u biološkim uzorcima, uključujući izdahnuti vazduh;

- tabele merenja po polu, dozi, režimu, vremenu, tkivima i organima;

- prikaz stepena apsorpcije i izlučivanja tokom vremena;

- metodi za karakterizaciju i identifikaciju metabolita u biološkim uzorcima;

- metodi bioloških merenja u vezi sa metabolizmom;

- predloženim putevima metabolizma;

- obrazloženju rezultata;

- tumačenju rezultata.

3.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Videti Opšti uvod.

4. LITERATURA

Videti Opšti uvod.

B.37. ODLOŽENA NEUROTOKSIČNOST ORGANOFOSFORNIH SUPSTANCI POSLE AKUTNOG IZLAGANJA

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

U proceni i evaluaciji toksičnih efekata supstanci važno je uzeti u obzir potencijal posebnih grupa supstanci da uzrokuju specifične vrste neurotoksičnosti koje ne moraju da budu otkrivene u drugim studijama toksičnosti. Uočeno je da određene organofosforne supstance uzrokuju odloženu neurotoksičnost i treba ih smatrati kandidatima za ocenjivanje.

Za identifikaciju supstanci koje mogu da uzrokuju odloženu polineuropatiju mogu se primeniti in vitro skrining testovi. Negativni rezultati in vitro studija ne daju dokaze da ispitivana supstanca nije neurotoksična.

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Organofosforne supstance uključuju nejonizovane organofosforne estre, tioestere ili anhidride organofosforne, organofosforaste ili organofosfamidne kiseline ili slične tiofosfornoj, tiofosforastoj ili tiofosfamidnoj kiselini ili druge supstance koje mogu da uzrokuju odloženu neurotoksičnost koja se ponekad javlja kod ovih grupa supstanci.

Odložena neurotoksičnost jeste sindrom koji se povezuje sa produženim odloženim nastupanjem ataksije, distalne aksonopatije u kičmenoj moždini i perifernim živcima i inhibicijom i starenjem ciljne esteraze neuropatije (u daljem tekstu: NTE) u nervnom tkivu.

1.3. REFERENTNE SUPSTANCE

Referentne supstance mogu da se ispituju sa pozitivnom kontrolnom grupom kao sredstvo koje pokazuje da se pod laboratorijskim uslovima odgovor ispitivanih životinjskih vrsta nije značajno promenio.

Primer široko korišćene neurotoksične supstance je tri-o-tolil fosfat (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, CAS nomenklatura: tris (2-metilfenil)estar fosforne kiseline, takođe poznat kao tris-o-krezilfosfat.

1.4. PRINCIP METODE

Ispitivana supstanca primenjuje se oralno u jednoj dozi domaćim kokoškama koje su zaštićene od akutnih holinergičkih efekata, kada odgovara. Životinje se posmatraju 21 dan kako bi se uočile abnormalnosti u ponašanju, ataksija i paraliza. Na kokoškama nasumično izabranim iz svake grupe izvode se biohemijska merenja, posebno NTE, obično 24 i 48 sata posle doziranja. Dvadeset i jedan dan posle izlaganja preostale kokoške se žrtvuju i izvode se histopatološki pregled odabranih nervnih tkiva.

1.5. OPIS METODE

1.5.1. Pripreme

Zdrave mlade kokoške bez virusnih bolesti koje mogu da interferiraju, koje ne primaju lekove i bez abnormalnosti treba slučajnim izborom uvrstiti u tretirane i kontrolne grupe i aklimatizovati na laboratorijske uslove najmanje pet dana pre početka studije.

Koriste se kavezi ili zatvoreni prostori koji su dovoljno veliki za slobodno kretanje i lako posmatranje hoda.

Doziranje ispitivane supstance obično je oralnim putem prisilnim hranjenjem, gel kapsulama ili sličnom metodom. Tečnosti se daju nerazblažene ili rastvorene u odgovarajućem vehikulumu kao što je kukuruzno ulje. Čvrste supstance ako je moguće treba rastvoriti, jer velike doze čvrstih supstanci u gel kapsulama ne mogu efikasno da se apsorbuju. Za vehikulume različite od vode moraju biti poznate toksične karakteristike, a ukoliko nisu poznate, iste treba odrediti pre ispitivanja.

1.5.2. Uslovi ispitivanja

1.5.2.1. Eksperimentalne životinje

Preporučuje se mlada odrasla domaća kokoška (Gallus gallus domestícus), stara 8 do 12 meseci. Koriste se vrste i sojeve standardne veličine. Kokoške se gaje u uslovima koji im omogućavaju slobodno kretanje.

1.5.2.2. Broj i pol

Pored tretirane grupe treba koristiti kontrolnu grupu vehikuluma i grupu pozitivne kontrole. Sa kontrolnom grupom vehikuluma treba postupati isto kao i sa tretiranom grupom, osim što se izostavlja primena ispitivane supstance.

Treba koristiti dovoljan broj kokoški u svakoj grupi kako bi se omogućilo žrtvovanje najmanje šest ptica za biohemijska određivanja (po tri u svakoj od dve vremenske tačke) i da šest ptica može da preživi 21-dnevni period praćenja posle tretmana za patologiju.

Grupa pozitivne kontrole može da se vodi istovremeno ili to može da bude nedavna kontrolna grupa iz ranije studije. Ona treba da sadrži najmanje šest kokoški tretiranih s poznatim neurotoksikantom sa odloženim dejstvom: tri kokoši za biohemiju i tri za patologiju. Preporučljivo je periodično ažuriranje podataka iz ranije studije. Nove podatke pozitivne kontrole treba razviti kad laboratorija koja izvodi ispitivanje promeni neki osnovni element (npr. soj, hrana, uslovi smeštaja).

1.5.2.3. Dozni nivoi

Obavlja se preliminarna studija uz korišćenje odgovarajućeg broja kokoški i grupa doznih nivoa kako bi se utvrdio nivo koji će se koristiti u glavnoj studiji. Određena smrtnost je neophodna u ovoj preliminarnoj studiji kako bi se definisala adekvatna doza za glavnu studiju. Može se koristiti atropin ili drugi zaštitni agens za koji se zna da ne utiče na odložene neurotoksične efekte da bi se sprečila smrt zbog akutnih holinergičkih efekata. Mogu se koristiti različite eksperimentalne metode kako bi se procenila maksimalna doza ispitivanih supstanci koja ne izaziva smrt (videti metodu V.1bis koja je data u ovom prilogu). Raniji podaci o kokoški ili drugi toksikološki podaci takođe mogu biti korisni u izboru doze.

Dozni nivo ispitivane supstance u glavnoj studiji treba da bude najveći mogući uzimajući u obzir rezultate studije preliminarnog izbora doze i gornju granicu doze od 2.000 mg/kg TM. Bilo koja smrtnost do koje može doći ne treba da ometa preživljavanje dovoljnog broja životinja za biohemijska (šest) i histološka (šest) ispitivanja posle 21 dana. Koriste se atropin ili drugi zaštitni agens za koji se zna da ne utiče na odložene neurotoksične efekte kako bi se sprečila smrt usled akutnih holinergičkih efekata.

1.5.2.4. Ispitivanje granične doze

Ukoliko ispitivanje pri doznom nivou od najmanje 2.000 mg/kg TM/dan, korišćenjem postupaka opisanih u ovoj studiji, ne pokaže nikakve toksične efekte i ukoliko se toksičnost ne očekuje na osnovu podataka o strukturno sličnim supstancama, nije neophodna studija koja koristi veće doze. Ispitivanje granične doze se ne primenjuje kada ljudsko izlaganje ukazuje na potrebu za korišćenjem višeg nivoa doze.

1.5.2.5. Period posmatranja

Period posmatranja treba da traje 21 dan.

1.5.3. Postupak

Posle primene zaštitnog agensa kako bi se sprečila smrt zbog akutnih holinergičkih efekata, ispitivana supstanca daje se u jednoj dozi.

1.5.3.1. Opšta posmatranja

Posmatranja se započinju odmah po izlaganju. Sve kokoške treba pažljivo pregledati nekoliko puta tokom prva dva dana, a posle toga najmanje jednom dnevno u periodu od 21 dan ili do predviđenog žrtvovanja. Beleže se sve znaci toksičnosti, uključujući vreme nastanka, vrstu, ozbiljnost i trajanje abnormalnosti ponašanja. Ataksija se meri ordinalnom skalom za ocenjivanje koja se sastoji od najmanje četiri nivoa, a paralizu treba registrovati. Najmanje dva puta nedeljno kokoške odabrane za patološka ispitivanja treba izvaditi iz kaveza i izložiti prisilnoj motoričkoj aktivnosti određeni period, kao što je penjanje po merdevinama, kako bi se zapazili minimalni toksični efekti. Životinje na samrti i životinje koje trpe ozbiljan stres ili bol treba ukloniti kada se ove pojave primete, humano ih žrtvovati i postmortalno pregledati.

1.5.3.2. Telesna masa

Pre primene ispitivane supstance meri se telesna masa svim kokoškama, a posle toga najmanje jednom nedeljno.

1.5.3.3. Biohemijska ispitivanja

Šest slučajno izabranih kokoški iz svake tretirane i kontrolne grupe vehikuluma i tri kokoške iz grupe pozitivne kontrole (kad se takva grupa istovremeno vodi) treba da budu žrtvovane u nekoliko dana posle doziranja. Osim toga, treba pripremiti i ispitati mozak i lumbalnu kičmenu moždinu na inhibiciju aktivnosti ciljne esteraze neuropatije. Može da bude korisno da se pripremi i ispita tkivo išijadičnog nerva na inhibiciju aktivnosti ciljne esteraze neuropatije. Obično, tri ptice iz kontrolne i svake tretirane grupe žrtvuju se posle 24 sata i tri ptice posle 48 sati, pri čemu tri kokoške iz grupe pozitivne kontrole treba usmrtiti posle 24 sata. Ukoliko opažanje kliničkih znakova intoksikacije (ovo često može biti procenjeno posmatranjem trenutka nastupa holinergičkih znakova) pokazuje da se toksični agens distribuira vrlo polako, može biti poželjno uzorkovati tkivo iz tri ptice u oba navrata između 24 sata i 72 sata posle doziranja.

Analiza acetilholinesteraze (u daljem tekstu: AChE) može da se obavi na tim uzorcima, ako se to smatra odgovarajućim. Može da se dogodi in vivo spontana reaktivacija AChE i da dovede do potcenjivanja potentnosti supstance kao AChE inhibitora.

1.5.3.4. Postmortalni pregled

Postmortalni pregled svih životinja (planirano žrtvovanih ili žrtvovanih na samrti) treba da uključi posmatranje izgleda mozga i kičmene moždine.

1.5.3.5. Histopatološka ispitivanja

Nervno tkivo životinja koje prežive period posmatranja i koje se ne koristi za biohemijske studije treba podvrgnuti mikroskopskom pregledu. Tkiva treba fiksirati in situ, korišćenjem tehnika perfuzije. Preseci treba da uključe mali mozak (srednji longitudinalni nivo), produženu moždinu, kičmenu moždinu i periferne živce. Preseke kičmene moždine treba uzeti iz gornjeg cervikalnog segmenta, srednje torakalone i lumbo-sakralne regije. Treba uzeti preseke distalne regije tibijalnog živca i njegovih grana do gastroknemijusnog mišića i skijatičnog živca. Preseke treba obojiti odgovarajućim mijelin i akson-specifičnim bojama.

2. PODACI

Negativni rezultati efekata izabranih za posmatranje u ovoj metodi (biohemijska, histopatološka ispitivanja i posmatranje ponašanja) ne zahtevaju dalje ispitivanje odložene neurotoksičnosti. Dvosmisleni ili neuverljivi rezultati za ove efekte mogu zahtevati dalje ocenjivanje.

Navode se pojedinačni podaci. Svi podaci navode se tabelarno. Za svaku eksperimentalnu grupu navodi se: broj životinja na početku ispitivanja, broj životinja koje pokazuju oštećenja, bihevioralne ili biohemijske efekte, tipovi i ozbiljnost tih oštećenja ili efekata i procenat životinja koje pokazuju svaki tip i ozbiljnost oštećenja ili efekta.

Nalaze ove studije treba oceniti u smislu incidence, ozbiljnosti i korelacije bihevioralnih, biohemijskih i histopatoloških efekata i drugih opaženih efekata u tretiranim i kontrolnim grupama.

Numeričke rezultate treba oceniti odgovarajućim i prihvaćenim statističkim metodama. Statističke metode treba odabrati prilikom osmišljavanja studije.

3. IZVEŠTAJ

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži podatke o:

1) Eksperimentalnim životinjama:

- korišćeni soj;

- broj i starost životinja;

- izvor, uslovi smeštaja, itd.;

- individualne telesne mase životinja na početku ispitivanja.

2) Uslovima ispitivanja:

- detalji o preparatu ispitivane supstance, stabilnost i homogenost, kad odgovara;

- opravdanje izbora vehikuluma;

- detalji o primeni ispitivane supstance;

- detalji o kvalitetu hrane i vode;

- obrazloženje izbora doze;

- specifikacija primenjenih doza uključujući detalje o vehikulumu, zapremini i fizičkom obliku primenjenog materijala;

- identitet i detalji o primeni svakog zaštitnog agensa.

3) Rezultatima:

- podaci o telesnoj masi;

- podaci o toksičnom odgovoru po grupi, uključujući mortalitet;

- priroda, ozbiljnost i trajanje kliničkih zapažanja (bilo da su reverzibilni ili ne);

- detaljan opis biohemijskih metoda i nalaza;

- nalazi obdukcije;

- detaljan opis svih histopatoloških nalaza;

- statistička obrada rezultata, kada odgovara.

4) Obrazloženju rezultata.

5) Zaključcima.

B.38. ISPITIVANJE ODLOŽENE NEUROTOKSIČNOSTI ORGANOFOSFORNIH SUPSTANCI - PONOVLJENE DOZE, 28 DANA

1. METODA ISPITIVANJA

1.1. UVOD

U proceni i evaluaciji toksičnih efekata supstanci važno je uzeti u obzir potencijal posebnih grupa supstanci da uzrokuju specifične vrste neurotoksičnosti koje ne moraju da budu otkrivene u drugim studijama toksičnosti. Uočeno je da određene organofosforne supstance uzrokuju odloženu neurotoksičnost i treba ih smatrati kandidatima za ocenjivanje.

Za identifikaciju supstanci koje mogu da uzrokuju odloženu polineuropatiju mogu se primeniti in vitro skrining testovi. Negativni rezultati in vitro studija ne daju dokaze da ispitivana supstanca nije neurotoksična.

Ovo 28-dnevno ispitivanje odložene neurotoksičnosti daje podatke o mogućim rizicima po zdravlje koji mogu proizaći iz ponovljenog izlaganja tokom ograničenog vremenskog perioda. Ispitivanje obezbeđuje podatke o dozi-efektu i može dati procenu doze bez efekta koja može da bude korisna pri utvrđivanju kriterijuma bezbednosti za ekspoziciju.

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Organofosforne supstance uključuju nejonizovane organofosforne estre, tioestere ili anhidride organofosforne, organofosforaste ili organofosfamidne kiseline ili slične tiofosfornoj, tiofosforastoj ili tiofosfamidnoj kiselini ili druge supstance koje mogu da uzrokuju odloženu neurotoksičnost koja se ponekad javlja kod ovih grupa supstanci.

Odložena neurotoksičnost jeste sindrom koji se povezuje sa produženim odloženim nastupanjem ataksije, distalne aksonopatije u kičmenoj moždini i perifernim živcima i inhibicijom i starenjem ciljne esteraze neuropatije (u daljem tekstu: NTE) u nervnom tkivu.

1.3. PRINCIP METODE

Dnevne doze ispitivane supstance primenjuju se oralno domaćim kokoškama tokom 28 dana. Životinje se najmanje jednom dnevno posmatraju zbog abnormalnosti u ponašanju, ataksije i paralize i to do 14 dana posle zadnje doze. Obavljaju se biohemijska merenja, posebno NTE na slučajno odabranim kokoškama iz svake grupe, obično 24 i 48 sata posle poslednje doze. Dve nedelje posle zadnje doze preostale kokoške se žrtvuju i obnavlja se histopatološki pregled odabranih nervnih tkiva.

1.4. OPIS METODE

1.4.1. Pripreme

Najmanje pet dana pre početka studije zdrave mlade kokoške bez virusnih bolesti koje mogu da interferiraju, koje ne primaju lekove i bez abnormalnosti treba slučajnim izborom da se uvrste u tretirane i kontrolne grupe i da se aklimatizuju na laboratorijske uslove.

Koriste se kavezi ili zatvoreni prostori koji su dovoljno veliki za slobodno kretanje i lako posmatranje hoda.

Doziranje ispitivane supstance je oralnim putem sedam dana u nedelji prisilnim hranjenjem, gel kapsulama ili sličnom metodom. Tečnosti se daju nerazblažene ili rastvorene u odgovarajućem vehikulumu kao što je kukuruzno ulje. Čvrste supstance ako je moguće treba rastvoriti, jer velike doze čvrstih supstanci u gel kapsulama ne mogu efikasno da se apsorbuju. Za vehikulume različite od vode moraju da budu poznate toksične karakteristike, a ukoliko nisu poznate, iste treba odrediti pre ispitivanja.

1.4.2. Uslovi ispitivanja

1.4.2.1. Eksperimentalne životinje

Preporučuje se mlada odrasla domaća kokoška (Gallus gallus domestícus), stara 8 do 12 meseci. Koriste se vrste i sojevi standardne veličine. Kokoške se gaje u uslovima koji im omogućavaju slobodno kretanje.

1.4.2.2. Broj i pol

Koriste se najmanje tri tretirane grupe i kontrolna grupa u vehikuluma. Sa kontrolnom grupom vehikuluma postupa se isto kao i sa tretiranom grupom, osim što se izostavlja primena ispitivane supstance.

Koristi se dovoljan broj kokoški u svakoj grupi kako bi se omogućilo žrtvovanje najmanje šest ptica za biohemijska određivanja (po tri u svakoj od dve vremenske tačke) i da šest ptica može da preživi 14-dnevni period praćenja posle tretmana za patološka ispitivanja.

1.4.2.3. Dozni nivoi

Dozne nivoe treba odabrati uzimajući u obzir rezultate akutnog ispitivanja odložene neurotoksičnosti i postojeće podatke o toksičnosti ili kinetici koji su dostupni za ispitivanu supstancu. Najviši dozni nivo određuje se sa ciljem izazivanja toksičnih efekata, najbolje odložene neurotoksičnosti, ali ne smrti niti očigledne patnje. Zatim se bira opadajući niz nivoa doza kako bi se pokazao bilo koji odgovor povezan sa doziranjem i nepostojanje štetnih efekata pri najnižem doznom nivou.

1.4.2.4. Ispitivanje granične doze

Ukoliko ispitivanje pri doznom nivou od najmanje 1.000 mg/kg TM/dan, korišćenjem postupaka opisanih u ovoj studiji, ne pokaže nikakve toksične efekte i ukoliko se toksičnost ne očekuje na osnovu podataka o strukturno sličnim supstancama, nije neophodna studija koja koristi veće doze. Ispitivanje granične doze se ne primenjuje kada izlaganje ljudi ukazuje na potrebu za korišćenjem višeg nivoa doze.

1.4.2.5. Period posmatranja

Sve životinje treba posmatrati najmanje jednom dnevno tokom perioda izlaganja i 14 dana posle toga, sve do planiranog žrtvovanja.

1.4.3. Postupak

Životinje se doziraju ispitivanom supstancom sedam dana u nedelji kroz period od 28 dana.

1.4.3.1. Opšta posmatranja

Posmatranja treba započeti odmah po izlaganju. Sve kokoške se pažljivo pregledaju najmanje jednom dnevno u periodu od 28 dana tretmana i 14 dana posle doziranja ili do planiranog žrtvovanja. Beleže se svi znakovi toksičnosti, uključujući vreme nastanka, vrstu, ozbiljnost i trajanje. Posmatranja treba da uključe, ali ne i da budu ograničena na, abnormalnosti u ponašanju. Ataksija se meri ordinalnom skalom za ocenjivanje koja se sastoji od najmanje četiri nivoa. Treba registrovati paralizu. Najmanje dva puta nedeljno kokoške odabrane za patološka ispitivanja treba izvaditi iz kaveza i izložiti prisilnoj motoričkoj aktivnosti određeni period, kao što je penjanje po merdevinama, kako bi se zapazili minimalni toksični efekti. Životinje na samrti i životinje koje trpe ozbiljan stres ili bol treba ukloniti kada se primete ove pojave, humano ih žrtvovati i postmortalno pregledati.

1.4.3.2. Telesna masa

Svim kokoškama se meri telesna masa pre primene ispitivane supstance i najmanje jednom nedeljno posle toga.

1.4.3.3. Biohemijska ispitivanja

Šest slučajno odabranih kokošaka iz svake tretirane i kontrolne grupe vehikuluma treba žrtvovati nekoliko dana nakon poslednje doze. Treba pripremiti i ispitati mozak i lumbalnu kičmenu moždinu na inhibiciju aktivnosti ciljne esteraze neuropatije. Može biti korisno pripremiti i ispitati tkivo išijadičnog nerva na inhibiciju aktivnosti ciljne esteraze neuropatije. Tri ptice iz kontrolne i svake tretirane grupe žrtvuju se posle 24 sata i tri ptice 48 sati posle zadnjeg doziranja. Ukoliko podaci iz akutne studije ili drugih studija (npr. toksikokinetike) ukazuju da su druge vremenske tačke posle zadnjeg doziranja pogodnije, treba primeniti te tačke, a obrazloženje treba dokumentovati.

Analiza acetilholinesteraze (u daljem tekstu: AChE) može se obaviti na tim uzorcima, ako se to smatra odgovarajućim. Može se dogoditi in vivo spontana reaktivacija AChE i dovesti do podcenjivanja potentnosti supstance kao AChE inhibitora.

1.4.3.4. Postmortalni pregled

Postmortalni pregled svih životinja (planirano žrtvovanih ili žrtvovanih na samrti) uključuje posmatranje izgleda mozga i kičmene moždine.

1.4.3.5. Histopatološka ispitivanja

Nervno tkivo životinja koje prežive period posmatranja i koje se ne koristi za biohemijska ispitivanja treba podvrgnuti mikroskopskom pregledu. Tkiva treba fiksirati in situ, korišćenjem tehnika perfuzije. Preseci treba da uključe mali mozak (srednji longitudinalni nivo), produženu moždinu, kičmenu moždinu i periferne živce. Preseke kičmene moždine treba uzeti iz gornjeg cervikalnog segmenta, srednje torakalone i lumbo-sakralne regije. Treba uzeti preseke distalne regije tibijalnog živca i njegovih grana do gastroknemijusnog mišića i skijatičnog živca. Preseke treba obojiti odgovarajućim mijelin i akson-specifičnim bojama. Treba izvesti mikroskopski pregled na očuvanim tkivima svih životinja u kontrolnoj i tretiranoj grupi kojoj je davana visoka doza. Kada postoje dokazi za efekte kod grupe visoke doze, treba obaviti mikroskopski pregled kod kokoški iz grupa srednje i niže doze.

2. PODACI

Negativni rezultati efekata izabranih za posmatranje u ovoj metodi (biohemijska, histopatološka ispitivanja i posmatranje ponašanja) obično ne zahtevaju dalje ispitivanje odložene neurotoksičnosti. Dvosmisleni ili neuverljivi rezultati za ove efekte mogu zahtevati dalje ocenjivanje.

Podaci se navode pojedinačno i to tabelarno. Za svaku eksperimentalnu grupu navodi se: broj životinja na početku ispitivanja, broj životinja koje pokazuju oštećenja, bihevioralne ili biohemijske efekte, tipovi i ozbiljnost tih oštećenja ili efekata i procenat životinja koje pokazuju svaki tip i ozbiljnost oštećenja ili efekta.

Nalazi ove studije ocenjuju se u smislu incidence, ozbiljnosti i korelacije bihevioralnih, biohemijskih i histopatoloških efekata i drugih opaženih efekata u tretiranim i kontrolnim grupama.

Numerički rezultati ocenjuju se odgovarajućim i prihvaćenim statističkim metodama. Statističke metode se biraju prilikom osmišljavanja studije.

3. IZVEŠTAJ

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži podatke o:

1) Eksperimentalnim životinjama:

- korišćeni soj;

- broj i starost životinja;

- izvor, uslovi smeštaja, itd.;

- individualne telesne mase životinja na početku ispitivanja.

2) Uslovima ispitivanja:

- detalji o preparatu ispitivane supstance, stabilnost i homogenost, kad odgovara;

- opravdanje izbora vehikuluma;

- detalji o primeni ispitivane supstance;

- detalji o kvalitetu hrane i vode;

- obrazloženje izbora doze;

- specifikacija primenjenih doza uključujući detalje o vehikulumu, zapremini i fizičkom obliku primenjenog materijala;

- opravdanje izbora drugih vremenskih tačaka za biohemijska određivanja, ukoliko vreme nije 24 sata i 48 sati.

3) Rezultatima:

- podaci o telesnoj masi;

- podaci o toksičnom odgovoru po grupi, uključujući mortalitet;

- doza bez štetnog dejstva;

- priroda, ozbiljnost i trajanje kliničkih zapažanja (bilo da su reverzibilni ili ne);

- detaljan opis biohemijskih metoda i nalaza;

- nalazi obdukcije;

- detaljan opis svih histopatoloških nalaza;

- statistička obrada rezultata, kad odgovara.

4) Obrazloženju rezultata.

5) Zaključcima.

B.39. ISPITIVANJE VANREDNE SINTEZE DNK (UDS) NA ĆELIJAMA JETRE SISARA IN VIVO

1. METODE ISPITIVANJA

Ova metoda potpuno odgovara metodi OECD: TG 486, Unscheduled DNK Synthesis (UDS) Test with Mammalian Liver Cells In vivo (1997).

1.1. UVOD

Svrha ispitivanja vanredne sinteze DNK (u daljem tekstu: UDS) na ćelijama jetre sisara in vivo je identifikacija ispitivanih supstanci koje uzrokuju popravku DNK u ćelijama jetre tretiranih životinja1,2,3,4.

Ovo in vivo ispitivanje daje metodu za istraživanje genotoksičnih efekata hemikalija u jetri. Krajnji efekat koji se meri je indikativan za oštećenje DNK i kasniju popravku u ćelijama jetre. Jetra je obično glavno mesto metabolizma apsorbovanih supstanci, pa je to odgovarajuće mesto za merenje oštećenja DNK in vivo.

Nije prikladno koristiti ovo ispitivanje ukoliko postoje dokazi da ispitivana supstanca neće dospeti u ciljno tkivo.

Krajnji efekat UDS meri se određivanjem preuzimanja označenih nukleozida u ćelije koje ne prolaze kroz redovnu (u s-fazi) DNK sintezu. Tehnika koja se najviše koristi je određivanje preuzimanja timidina označenog tricijumom (u daljem tekstu: 3H-TdR) autoradiografijom. Jetre pacova se najviše koriste za in vivo UDS ispitivanja. Mogu se koristiti i druga tkiva osim jetre, ali nisu predmet ove metode.

Detekcija UDS efekta zavisi od broja DNK baza koje su uklonjene i zamenjene na mestu oštećenja. UDS ispitivanje je posebno koristan za detektovanje "dugačke popravke" (20 do 30 baza) izazvanog supstancom. Obrnuto "kratka popravka" (1 do 3 baze) detektuje se s mnogo manjom osetljivošću. Mutageni događaji mogu nastati zbog nepopravljenih, pogrešno popravljenih ili pogrešno replikovanih oštećenja DNK. Obim UDS reakcije ne daje indikacije pouzdanosti procesa oporavka. Moguće je da mutagen reaguje sa DNK, ali da se oštećenje DNK ne popravi kroz proces popravke izrezivanjem. Nedostatak specifičnih podataka o mutagenoj aktivnosti koje daje UDS ispitivanje kompenzuje se potencijalnom osetljivošću ovog krajnjeg efekta od interesa, budući da se prati celokupni genom.

Videti Opšti uvod.

1.2. DEFINICIJE

Ćelije u popravci jesu viša neto nuklearna zrnca od podešene vrednosti koja se opravdava u laboratoriji koja vrši ispitivanje.

Neto nuklearna zrnca (net nuclear grains, u daljem tekstu: NNG) jeste kvantitativna mera za UDS aktivnost ćelija u autoradiografskim UDS ispitivanjima, obračunata oduzimanjem prosečnog broja citoplazmatskih zrnaca u delovima citoplazme ekvivalentnim nukleusu (u daljem tekstu: CG) od broja nuklearnih zrnaca (u daljem tekstu: NG), odnosno: NNG = NG - CG. NNG broj se dobija za pojedinačne ćelije, a zatim se zbraja za ćelije u kulturi, u paralelnim kulturama, itd.

Vanredna sinteza DNK (u daljem tekstu: UDS) jeste sinteza radi popravke DNK posle uklanjanja i odstranjivanja niza DNK koji sadrži područje oštećenja koje je uzrokovano hemijskom supstancom ili fizičkim agensom.

1.3. PRINCIP METODE

UDS ispitivanje na ćelijama jetre sisara in vivo ukazuje na sintezu radi popravke DNK posle uklanjanja i odstranjivanja niza DNK koji sadrži područje oštećenja koje je uzrokovano hemijskom supstancom ili fizičkim agensom. Ispitivanje se obično zasniva na ugrađivanju 3H-TdR u DNK ćelija jetre koje imaju nisku frekvenciju ćelija u S-fazi ćelijskog ciklusa. Preuzimanje 3H-TdR određuje se autoradioografijom, budući da ova tehnika nije osetljiva na interferencije iz ćelija u S-fazi kao što je to npr. upotreba tečnog scintilacijskog brojanja.

1.4. OPIS METODE

1.4.1. Pripreme

1.4.1.1. Izbor životinjske vrste

Obično se koriste pacovi, mada može da se koristi bilo koja vrsta sisara. Uobičajeno se koriste sojevi mladih zdravih odraslih životinja. Na početku studije varijacija u telesnoj masi životinja treba da bude minimalna i da ne prelazi ±20% srednje telesne mase za svaki pol.

1.4.1.2. Uslovi smeštaja i ishrane

Primenjuju se opšti uslovi navedeni u Opštem uvodu, mada vlažnost vazduha treba da bude između 50% i 60%.

1.4.1.3. Priprema životinja

Zdrave mlade odrasle životinje raspoređuju se slučajnim izborom u kontrolnu i tretirane grupe. Kaveze treba rasporediti tako da se minimalizuju mogući efekti položaja kaveza. Životinje se identifikuju pojedinačno i drže u kavezima najmanje pet dana pre početka studije kako bi se omogućila aklimatizacija na laboratorijske uslove.

1.4.1.4. Ispitivana supstanca/Preparat

Pre doziranja životinja čvrste ispitivane supstance se rastvaraju ili suspenduju u odgovarajućim rastvaračima ili vehikulumima i, ukoliko je potrebno, razblažuju. Tečne ispitivane supstance mogu da se doziraju direktno ili razblažene pre doziranja. Primenjuju se sveži preparati ispitivane supstance osim ukoliko podaci o stabilnosti ne ukazuju na prihvatljivost čuvanja.

1.4.2. Uslovi ispitivanja

1.4.2.1. Rastvarač/vehikulum

Rastvarač/vehikulum ne sme da uzrokuje toksične efekte pri korišćenim doznim nivoima i ne sme da se sumnja na hemijske reakcije sa ispitivanom supstancom. Ukoliko se koriste rastvarači/vehikulumi koji nisu dobro poznati, njihovo uključivanje treba podupreti podacima o njihovoj kompatibilnosti. Preporučuje se da se, kad god je moguće, prvo razmotri primena vodenog rastvarača/vehikuluma.

1.4.2.2. Kontrole

Istovremene pozitivne i negativne kontrole (rastvarač/vehikulum) treba uključiti u svaki deo eksperimenta koji se nezavisno izvodi. Osim tretmana ispitivanom supstancom, sa životinjama u kontrolnoj grupi treba postupati isto kao i sa životinjama u tretiranim grupama.

Pozitivne kontrole treba da budu supstance za koje je poznato da proizvode UDS kada se primene pri nivoima izloženosti za koje se očekuje da daju uočljivo povećanje u odnosu na pozadinu. Pozitivne kontrole koje zahtevaju metaboličku aktivaciju treba koristiti u dozama koje izazivaju umereni efekat4. Doze se mogu odabrati tako da su efekti jasni ali ne otkrivaju trenutno identitet kodiranih slajdova onome koji čita. Primeri supstanci koje se mogu koristiti kao pozitivne kontrole:

Tabela 1.

Mogu se koristiti i druge odgovarajuće supstance kao pozitivne kontrolne. Prihvatljivo je da se pozitivna kontrola primeni drugačijim putem od ispitivane supstance.

1.5. POSTUPAK

1.5.1. Broj i pol životinja

Koristi se odgovarajući broj životinja kako bi se uzele u obzir prirodne biološke varijacije u efektu ispitivanja. Broj životinja mora da bude najmanje tri životinje po grupi koje se mogu analizirati. Tamo gde je akumulirana značajna istorijska baza podataka potrebne su samo jedna ili dve životinje za istovremene negativne i pozitivne kontrolne grupe.

Ukoliko u vreme studije postoje raspoloživi podaci iz studija za iste vrste i korišćenje istog puta izlaganja koje pokazuju da ne postoje bitne razlike u toksičnosti među polovima, dovoljno je ispitivanje na samo jednom polu, prevashodno na mužjacima. Ako je ljudsko izlaganje hemikalijama specifično za pol, kao što je to npr. s nekim farmaceutskim agensima, ispitivanje treba obaviti na životinjama odgovarajućeg pola.

1.5.2. Raspored tretmana

Ispitivane supstance se obično primenjuju kao jedan tretman.

1.5.3. Dozni nivoi

Uobičajeno se koriste najmanje dva dozna nivoa. Najviša doza se definiše kao doza koja uzrokuje znakove toksičnosti koji su takvi da bi se za više nivoe doza, zasnovane na istom režimu doziranja, očekivalo da uzrokuju smrtnost. Niža doza treba da bude 50% do 25% više doze.

Supstance sa specifičnim biološkim aktivnostima pri niskim netoksičnim dozama (kao što su hormoni i mitogeni) mogu da budu izuzeci od kriterijuma za određivanje doza i ocenjuju se od slučaja do slučaja. Ukoliko se obavlja studija nalaženja raspona, jer nisu raspoloživi odgovarajući podaci, treba je izvoditi u istoj laboratoriji uz korišćenje iste vrste, soja, pola i režima tretiranja kao i u glavnoj studiji.

Najviša doza se može definisati i kao doza koja proizvodi određene indikacije toksičnosti u jetri (npr. piknotički nukleusi).

1.5.4. Ispitivanje granične doze

Ukoliko ispitivanje korišćenjem doze od najmanje 2.000 mg/kg TM primenjene u jednom tretmanu ili u dva tretmana istog dana ne pokaže toksične efekte i ukoliko genotoksičnost nije očekivana na osnovu podataka iz strukturno sličnih supstanci, nije neophodna potpuna studija. Očekivano izlaganje ljudi može da ukaže na potrebu za korišćenjem višeg nivoa doze u ispitivanju granične doze.

1.5.5. Primena doza

Ispitivana supstanca se primenjuje pomoću gastrične cevi ili prikladnim instrumentom za intubaciju. Drugi putevi izlaganja mogu biti prihvatljivi ako se mogu opravdati. Ne preporučuje se intraperitonealni način, budući da jetra može da se izloži ispitivanoj supstanci direktno, a ne preko cirkulacionog sistema. Maksimalna zapremina tečnosti koja može prisilno da se primeni ili ubrizga odjednom zavisi od veličine eksperimentalne životinje. Ova zapremina ne sme da prelazi 2 ml/100g TM. Korišćenje većih zapremina mora biti opravdano. Osim kod iritabilnih ili korozivnih supstanci koje uobičajeno pokazuju lošije efekte pri višim koncentracijama, varijabilnost u ispitivanoj zapremini mora da bude minimalizovana prilagođavanjem koncentracije kako bi se obezbedila stalna zapremina pri svim nivoima doza.

1.5.6. Priprema ćelija jetre

Ćelije jetre pripremaju se od tretiranih životinja obično 12 do 16 sati posle doziranja. Uglavnom je neophodno dodatno ranije vreme uzorkovanja (obično 2 do 4 sata posle tretmana), osim ukoliko postoji jasan pozitivni efekat unutar 12 do 16 sati. Alternativno vreme uzorkovanja može se koristiti kad je to opravdano na osnovu toksikokinetičkih podataka.

Kratkotrajne kulture ćelija jetre sisara obično se dobijaju perfuzijom jetre in situ kolagenazom i omogućavanjem sveže odvojenim ćelijama jetre da se pričvrste na prikladnu podlogu. Ćelije jetre životinja negativne kontrole treba da imaju vijabilitet5 od najmanje 50%.

1.5.7. Određivanje UDS

Sveže izolovane ćelije jetre sisara inkubiraju se sa medijumom koji sadrži 3H-TdR tokom odgovarajućeg vremenskog perioda, npr. 3 do 8 sati. Na kraju perioda inkubacije medijum se uklanja od ćelija koje se tada mogu inkubirati sa medijumom koji sadrži višak neoznačenog timidina kako bi se izbegla neugrađena radioaktivnost ("hladna potraga"). Ćelije se zatim ispiraju, fiksiraju i suše. Hladna potraga nije neophodna za produžena vremena inkubacije. Slajdovi se potapaju u autoradiografsku emulziju, izlažu u mraku (npr. u frižideru 7 do 14 dana), razvijaju, boje i izložena srebrna zrnca se prebrojavaju. Od svake životinje priprema se dva do tri slajda.

1.5.8. Analiza

Preparati slajdova treba da sadrže dovoljno ćelija normalne morfologije kako bi se omogućilo značajno ocenjivanje UDS. Preparati se mikroskopski ispituju na znake očigledne citotoksičnosti (npr. piknoza, smanjen nivo radio označavanja).

Slajdovi se kodiraju pre prebrojavanja zrnaca. Obično se dobije 100 ćelija od svake životinje u najmanje dva slajda. Manje od 100 ćelija po životinji, se obrazlaže. Ne prebrojavaju za nukleusi S-faze, već se beleži razmera S-faze.

Količina ugrađenih 3H-TdR u jedru i citoplazmi morfološki normalnih ćelija, dokazana taloženjem(deposition) srebrnih zrnaca, utvrđuje se odgovarajućim metodama.

Broj zrnaca se određuje po jedru (nuklearna zrnca, u daljem tekstu: NG) i jedru-ekvivalentnim područjima po citoplazmi (citoplazmatska zrnca, u daljem tekstu: CG). Broj CG se meri uzimanjem najviše označenog područja citoplazme ili uzimanjem proseka dva ili tri broja citoplazmatskih zrnaca u poređenju sa jedrom. Druge metode prebrojavanja (npr. prebrojavanje celih ćelija) mogu se koristiti ako je to opravdano6.

2. PODACI

2.1. OBRADA REZULTATA

Navode se podaci o pojedinačnim slajdovima i životinjama. Svi podaci se navode tabelarno. Neto nuklearna zrnca (u daljem tekstu: NNG) se izračunavaju za svaku ćeliju, za svaku životinju i svaku dozu i vreme, i to oduzimanjem broja CG od broja NG. Ukoliko se broje "ćelije u oporavku", kriterijumi za definisanje "ćelija u oporavku" treba obrazložiti i zasnivati ih na podacima negativne kontrole ranije ili konkurentne studije. Numerički rezultati mogu biti ocenjeni statističkim metodama. Ukoliko se koriste statističke metode, biraju se i opravdavaju pre izvođenja studije.

2.2. PROCENA I TUMAČENJE REZULTATA

Kriterijumi za pozitivne odgovore uključuju:

a) NNG vrednosti iznad prethodno zadatog praga, a što je opravdano na osnovu laboratorijskih istorijskih podataka ili

b) NNG vrednosti koje su značajno veće nego istovremena kontrola.

Kriterijumi za negativne odgovore uključuju:

a) NNG vrednosti u okviru/ispod istorijskog praga kontrole ili

b) NNG vrednosti koje nisu značajno veće od istovremene kontrole.

Potrebno je razmotriti biološku relevantnost podataka, odnosno parametre kao što su međuživotinjska varijacija, odnos doza-odgovor, a treba uzeti u obzir i citotoksičnost. Pri ocenjivanju rezultata ispitivanja mogu se koristiti statističke metode. Statistički značaj ne treba da bude jedini određujući faktor za pozitivni odgovor.

Većina eksperimenata daje jasno pozitivne ili negativne rezultate, u retkim slučajevima podaci onemogućuju definitivnu ocenu o aktivnosti ispitivane supstance. Rezultati mogu ostati dvosmisleni ili sumnjivi bez obzira na broj ponavljanja eksperimenta.

Pozitivni rezultat UDS ispitivanja na ćelijama jetre sisara in vivo ukazuje da ispitivana supstanca uzrokuje oštećenje DNK u ćelijama jetre sisara in vivo koje se može popraviti vanrednom sintezom DNK in vitro. Negativni rezultat ukazuje da, pod uslovima ispitivanja, ispitivana supstanca ne uzrokuje oštećenja DNK koja su uočljiva ovim ispitivanjem.

Treba prodiskutovati verovatnoću da ispitivana supstanca dospe u sistemsku cirkulaciju ili specifično u ciljano tkivo (npr. sistemska toksičnost).

3. IZVEŠTAJ

Izveštaj o ispitivanju, ukoliko je moguće, sadrži podatke o:

1) Rastvaraču/vehikulumu:

- opravdanje za izbor vehikuluma;

- rastvorljivost i stabilnost ispitivane supstance u rastvaraču/vehikulumu, ukoliko je poznato.

2) Eksperimentalnim životinjama:

- korišćena vrsta/soj;

- broj, starost i pol životinja;

- izvor, uslovi smeštaja, ishrana, itd.;

- individualna telesna masa životinja na početku ispitivanja, uključujući raspon telesne mase, srednju vrednost i standardnu devijaciju za svaku grupu.

3) Uslovima ispitivanja:

- pozitivne i negativne kontrole vehikuluma/rastvarača;

- podaci iz studije traženja raspona, ukoliko je obavljena;

- obrazloženje izbora nivoa doza;

- detalji o preparatu ispitivane supstance;

- detalji o primeni ispitivane supstance;

- obrazloženje puta primene;

- metode provere da je ispitivani agens dospeo do sistemske cirkulacije ili ciljnog tkiva, ukoliko je primenjivo;

- konverzija iz koncentracije ispitivane supstance u hrani/vodi za piće (ppm) do stvarne doze (mg/kg telesna masa/dan), ukoliko je primenjivo;

- detalji o kvalitetu hrane i vode;

- detaljan opis tretmana i uzorkovanja;

- metode merenja toksičnosti;

- metode pripreme ćelija jetre i kultura;

- korišćena autoradiografska tehnika;

- broj pripremljenih slajdova i broj prebrojanih ćelija;

- kriterijumi ocenjivanja;

- kriterijumi da je ispitivanje pozitivno, negativno ili dvosmisleno.

4) Rezultatima:

- individualni slajd, srednje vrednosti po životinji i grupi za nuklearna zrnca, citoplazmatska zrnca, i neto nuklearna zrnca;

- odnos doza-efekat, ukoliko je dostupan;

- statistička ocena, ukoliko postoji;

- znaci toksičnosti;

- podaci o istovremenoj negativnoj (rastvarač/vehikulum) i pozitivnoj kontroli;

- istorijski podaci o negativnoj (rastvarač/vehikulum) i pozitivnoj kontroli s rasponom, srednjom vrednošću i standardnim devijacijama;

- broj "ćelija u popravci" ako je utvrđen;

- broj ćelija S-faze ako je utvrđen;

- vijabilitet ćelija.

5) Obrazloženju rezultata.

6) Zaključcima.

4. LITERATURA

1. Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, B. and Penman, M.G. (1985). An Assessment of the In vivo Rat Hepatocyte DNK Repair Assay. Mutation Res., 156, 1-18.

2. Butterworth, B.E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987). A Protocol and Guide for the In vivo Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay. Mutation Res. 189, 123-133.

3. Kennelly, J.C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, B., Benford, D.J., Dean, S.W. and Mitchell, I. de G. (1993). In vivo Rat Liver UDS Assay. In: Kirkland D.J. and Fox M., (Eds) Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part II revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 52-77.

4. Madle, S., Dean, S.W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, B., Doolittle, D.J., Furihata, C., Hertner, T., McQueen, C.A. and Mori, H. (1993). Recommendations for the Performance of UDS Tests In vitro and In vivo. Mutation Res., 312, 263-285.

5. Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, C. (1993). Assessment of the Relation Between the Initial Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for the In vivo/In vitro DNK Repair Assay (UDS). Mutation Res., 291, 21-27.

6. Mirsalis, J.C., Tyson, C.K. and Butterworth, B.E. (1982). Detection of Genotoxic Carcinogens in the In vivo/In vitro Hepatocyte DNK Repair Assay. Environ. Mutagen, 4, 553-562.

Sledeći